CN103635788A - 对磁性粒子的簇团的检测 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测样本体积（111）中的磁性粒子（MP）的簇团（C），尤其是由以三明治配置结合到靶分子的具有不同结合位点的两个磁性粒子（MP）构成的簇团（C）的方法和传感器设备（100）。检测源自于输入光（L1）与磁性粒子（MP）的簇团（C）进行的相互作用的输出光（L2）。此外，通过磁驱动场（B）来驱动所述磁性粒子（MP、C），其中所述驱动通过暂停被中断至少一次。以这种方式能够获得恰当反映特异性结合簇团（C）的总量的高输出信号。

Description

对磁性粒子的簇团的检测

技术领域

本发明涉及一种用于检测样本体积中的磁性粒子的簇团的方法和传感器设备，其中，在所述检测期间，通过磁场来驱动所述簇团。

背景技术

WO2007/120095A1公开了一种传感器设备，使用所述传感器设备能够通过确定磁性粒子在载流体中的布朗弛豫时间来观察磁性粒子的集聚。为了避免所需激励磁场的费时的扫频，提出使用脉冲激励磁场。然而描述的测量是复杂并且难以实现的。

发明内容

本发明的目的在于提供允许在相对简单和稳健的过程中可靠地检测磁性粒子的簇团的手段。

这一目的通过根据权利要求1的方法、根据权利要求2的传感器设备以及根据权利要求10的用途来实现。优选实施例在从属权利要求中公开。

根据本发明的方法用于检测样本体积中的磁性粒子的簇团。在本文中，术语“磁性粒子”应当包括永久磁性粒子以及可磁化粒子，例如，超顺磁珠。磁性粒子的尺寸通常在3nm到50μm之间的范围内。“簇团”是通过一些结合类型而被耦合的两个或者更多磁性粒子的团块。在此尤其感兴趣的是化学结合（相比仅由磁化粒子之间的磁性吸引力导致的结合），尤其是经由特定化学基团和/或感兴趣的中间成分的特异性结合。所述方法包括以下步骤：

a）利用输入光辐照所述样本体积。优选地，该输入光作为经准直和/或经聚焦的光束被导向进入所述样本体积。

b）通过磁驱动场来驱动所述样本体积中的磁性粒子（即，单个磁性粒子和/或磁性粒子的簇团）。通过定义，“驱动”包括生成机械效应，尤其是对磁性粒子施加力和/或磁性粒子的运动。根据本发明，所述驱动应当通过暂停被中断至少一次。这意味着具有至少一个（非零长度的）时间间隔，在其期间驱磁动场为零，或者至少小到不（以可检测到的方式）驱动磁性粒子。

c）检测源自于上述输入光与所述样本体积中的磁性粒子的簇团进行的相互作用的输出光。由于与簇团的相互作用，输出光的某些特性（例如，总量、颜色、方向等）将依赖于簇团的存在（并且通常也依赖于簇团的数量）；因此，检测到的输出光将允许对该样本体积中的簇团的存在/数量作出结论，这是所述方法的实际目的。

根据第二方面，本发明涉及一种用于检测样本中的磁性粒子的簇团的传感器设备，尤其是根据以上描述类型的方法。所述传感器设备包括以下部件：

a）具有样本体积的样本容器，在所述样本容器中能够提供具有磁性粒子的样本。例如，所述样本容器可以被实现为由塑料通过注射成型制成的一次性盒体。

b）用于向所述样本体积发射输入光的光源。例如，所述光源可以是激光二极管或LED。

c）磁场发生器，包括例如永磁体或者电磁体，其用于生成驱动所述样本体积中的磁性粒子的磁驱动场。

d）控制单元，其用于控制所述磁场发生器，从而对该簇团的驱动通过暂停被中断至少一次。所述控制单元可以在专用电子硬件、具有相关联软件的数字数据处理硬件或两者的混合中实现。

e）光检测器，其用于检测源自于所述输入光与所述样本体积中的磁性粒子的簇团进行的相互作用的输出光。例如，所述光检测器可以包括光电二极管、光敏电阻器、光电池、CCD芯片或光电倍增管。

本发明的方法和传感器设备允许对磁性粒子的簇团进行稳健而精确的检测。这首先通过光学测量来实现，在所述光学测量中观察簇团与输入光的相互作用。其次，本发明的重要方面在于通过磁驱动场来驱动磁性粒子（包括簇团）。当该驱动发生在检测输出光期间时，可能区分源自于感兴趣簇团的输出光的成分和源自于其他来源的输出光的成分。本发明的第三重要特征在于通过至少一个暂停中断磁性驱动。由于在这种暂停时间期间不会实现磁性驱动对输出光的观察的前述积极影响，因此该手段看起来是自相矛盾的。然而，实验表明，在磁性驱动不连续而是被中断的情况下，能够显著地增大检测的灵敏度和精确性。

在下文中，将描述本发明的各种优选实施例，其涉及以上描述的方法和传感器设备。

应当中断磁性驱动的暂停的数量和/或暂停的持续时间（以及其他相关参数）优选地通过校准测量来确定。这意味着利用已知组分的样本来进行多次实验，其中，暂停的数量和/或暂停的持续时间（或者其他参数）在每个实验中是变化的；然后，产生相对于给定标准（例如，指示感兴趣簇团存在的最高输出信号）的最好结果的实验将指示（各）暂停的数量和/或暂停的持续时间的最佳选择。

在很多实际重要范例中，暂停的适当持续时间在约0.1秒到约10秒之间范围内，优选在约0.5s到约5s之间，最优选在约1秒到约2秒之间。如果使用具有约500nm直径的磁性粒子，这些值例如是适合的。

磁驱动场的中断（暂停）的优选数量在大约10到大约50之间范围内。

在磁场是激活（“开启”）的时间间隔优选具有大约0.1到10s之间的持续时间（产生在0.01到100之间的典型占空比）。

根据本发明的另一优选实施例，磁驱动场在它存在的时间期间旋转。磁驱动场的旋转能够诱发磁性粒子的相应旋转，尤其是那些集聚成簇团的粒子的相应旋转。由于簇团通常地在形状上是各向异性的，因此它们的旋转将影响其与（各向异性）输入光的相互作用。因此，输出光将包括取决于磁驱动场的旋转的调制，所述调制继而允许对它们所源自于的磁性粒子或者簇团做出结论。

由所述方法和所述传感器设备检测的磁性粒子的簇团可以优选为由两个磁性粒子形成的簇团。这些双-粒子簇团实际上是重要的，并且具有明显的各向异性，这使得它们适于在（旋转）磁驱动场中进行检测。

样本可以优选地包括两个不同类型的磁性粒子，其能够以三明治配置与样本中的靶成分相结合。例如，所述样本可以包括被涂覆有第一抗体的磁性粒子和被涂覆有第二抗体的磁性粒子，其中，这些抗体中的每个能够与样本中靶分子上的不同表位相结合。这些靶分子的存在和/或数量通常是人们实际感兴趣的值。其能够经由对簇团的检测来确定，该簇团由通过靶分子耦合的两个不同类型磁性粒子的前述三明治配置来形成。因此，检测出的这种双-粒子簇团的数量是针对样本中靶成分的总量的度量。

输出光可以尤其包括被磁性粒子的簇团散射的输入光。观察散射光具有的优势在于其总量（强度）与散射成分的总量成比例。由于没有必须处理的高基线信号，因此，能够利用高灵敏度的光检测器来优化处理少量的这些成分。应当注意到，输出光通常包括被感兴趣簇团以及被单个磁性粒子或其他团块散射的光。为了单独地确定输出光的与感兴趣簇团相关的那些成分，可以通过磁驱动场以特定方式来驱动这些簇团，这导致对其输出光成分的相应的特性调制。

本发明还涉及以上描述的传感器设备用于分子诊断、生物样本分析、化学样本分析、食物分析，和/或法医分析的用途。例如，分子诊断可以在直接或者间接地被附着在靶分子的磁珠或者荧光粒子的帮助下完成。

附图说明

参照下文描述的实施例，本发明的这些和其他方面将是显而易见的并且得到阐述。

在图中：

图1示意性地描绘了样本中的磁性粒子与靶分子结合并形成簇团的事件；

图2是两个磁性粒子和一个靶分子的三明治配置的放大图片；

图3示意性地描绘了根据本发明的传感器设备；

图4是表示根据磁驱动场中的暂停的持续时间（横轴）的输出信号（纵轴）的区别的图表；

图5是示出了根据靶成分的浓度（横轴）的输出信号（纵轴）的图表；

具体实施方式

近年来，对更普遍和有效的医疗保健系统的增大的需求正在影响体外诊断领域，并着眼于有效的床边解决方案的实现。由于床边诊断的需要：由于该测试需要在患者位置处执行，因此它们必须快速、灵敏、定量并且精确，因此这种目的的实现是尤其苛刻的。此外，在其上执行测试的平台需要是便携的，并且易于使用。

磁性簇团测定提供了容积的和无表面的构架，并且因而它们本质上是快速而划算的。图1示意性描绘了基于磁性纳米粒子MP的磁约束而使得能够有效形成簇团的典型的磁性簇团测定的四个连续步骤。

作为第一步骤（图1的左上方），提供被涂覆有抗体的磁性粒子MP。在第二步骤中（图1右上方），加入抗原AG，并且其与磁性粒子结合。在第三步骤中（图1右下方），将样本暴露于磁场B，使得形成粒子链或簇团C。在最后的步骤中（图1左下方），利用光源L照射所述样本，并且检测被簇团散射的光。

文献描述了这样的事实：磁性链的形成尤其有力地增强了粒子-粒子结合过程的动力学，允许十分快速的测定（Baudry et al.,Proceedings of theNational Academy of Sciences2006,103,(44),16076.）。磁性链的形成使得能够通过聚集磁性粒子并且无论其互斥性质而迫使它们彼此之间保持紧密接触来有效地形成簇团。

典型的磁性驱动方案例如包括将均匀磁场应用于包含已经利用将要检测的靶生物分子孵育的纳米粒子的样本。当场激活时，纳米粒子将其本身布置为链，并且在彼此紧密接近的同时自由地振动和旋转。因此，能够有效地形成特异性结合，如图1所描绘的。

当磁性纳米粒子MP被涂覆具有不同的单克隆抗体AB1和AB2时，如图2中图示的，发生了特殊的情形。抗体能够特异性地结合抗原AG的不同位点，因而形成具有三明治配置的双-粒子簇团（图2）。

尤其针对前述测定，在此提出使用根据重复脉冲的“动态”驱动。如将在下文中更加详细解释的，重复脉冲的应用能够令人惊讶地降低非特异性相互作用，并且增强结合事件的数量。

在磁性簇团测定中引入脉冲驱动有两重目的。首先，通过三明治配置来捕获将要检测的生物分子，在该三明治配置中使用与抗原的不同表位特异性结合的单克隆抗体（参考图2）。为了使特异性结合的数量最大化，在磁性驱动阶段期间，需要使碰撞的次数最大化，从而大量的随机相遇使得被涂覆具有互补抗体的粒子能够遇到并且有效地与抗原相互作用的概率更大。

第二相关方面涉及这样的事实：当超顺磁性粒子被分散在水溶液中时，它们保持小的负电荷，这帮助它们保持分离并且避免非特异性簇团。搅拌粒子的磁力的使用允许它们克服静电排斥并且它们被迫使保持彼此紧密接近；这对于加速簇团形成的动力学是有利的，然而这也引入了不可忽略数量的非特异性相互作用。因此，需要谨慎地评估和平衡磁力的使用，以优化特异性簇团的生成，并使非特异性簇团的数量最小化。

由本发明提出的方法能够在如图3中描绘的传感器设备100（光磁平台）中实现。该传感器设备100包括具有样本体积111的样本容器或盒体110，在所述样本体积中能够提供具有磁性粒子或珠子MP的样本流体。在示出的范例中，样本盒体110是正方形横截面的玻璃管。

传感器设备100还包括读取器，仅示意性地描绘出了其最相关的部件。这些部件包括：

-磁场发生器120，在示出的例子中所述磁场发生器由四个电磁体120a、120b、120c、120d构成。这些磁体被布置在矩形或正方形的角处，并且以它们的轴朝向样本体积111内的某个中心的方式来对齐。通过适当地顺序控制电磁体中的电流，能够在所述样本体积内生成均匀的旋转磁场B。

-光源，例如激光二极管130或LED，其发射输入光L1的经校准的（激光）光束，所述输入光L1被透镜131聚焦在样本体积111中。

-光检测器140，例如光电二极管或图像传感器。来自样本体积111的输出光L2通过薄透镜141被聚焦至光检测器的激活表面。在示出的实施例中，输出光L2由被样本体积的成分散射的输入光L1构成，尤其是由被磁性粒子MP和/或这些粒子的簇团C散射的输入光L1构成。

-控制单元150，其被耦合至磁场发生器120和光检测器140，以便控制它们并且处理由光检测器140提供的测量信号。

当描述的传感器设备运行时，磁场发生器120生成诱发磁性粒子的簇团C的相应旋转的旋转磁场B。当旋转时，这些簇团C将时间相关的横截面暴露于入射光L1，因此引入对被样本散射的光强L2的调制。由于它们是对称的并且其横截面在旋转180°之后还是一样的，这种调制通常是簇团的旋转频率的两倍。能够将快速傅里叶变换（FFT）算法应用于记录的信号，并且磁场频率两倍的FFT幅值能够被定义为信号S，其指示感兴趣的簇团的总量。

为了证明描述的想法，利用500nm的磁性粒子MP进行实验，所述磁性粒子被涂覆具有抗前列腺特异性抗原（PSA）的表位10和66的抗体。采用的驱动方案包括应用2秒20次的25mT均匀旋转磁场脉冲。此外，在随之发生的脉冲的发射之间应用不存在场的变化的“暂停”。对于0s的暂停持续时间，在将以1Hz旋转的均匀旋转场应用于驱动方案的全部持续时间的意义上而言，驱动是“连续的”。

图4报告了根据暂停的持续时间d（横轴）的在100pM的PSA浓度时的（三个独立测量的）平均信号与0pM时的（三个独立测量的）平均信号之间的信号差ΔS。可以清楚看出的是引入脉冲驱动，特异性信号改进了几乎3倍。

所述实验还示出了存在相对于脉冲持续时间d的特异性信号的最佳效果（其依赖于实际粒子浓度以及粒子的磁性性质）。在示出的范例中，所述优最佳效果位于约1s处。因此，诸如此类的实验能够用作校准过程，以找出磁性驱动的最佳操作参数。

脉冲驱动的使用和信号的随之增大也是很重要的，以便实现可重现的且灵敏的测定。这相对于图5来图示，其示出了针对基于脉冲驱动的PSA测定的剂量响应曲线。（初步）实验证实了大约10pM的检测限制。

为了证明脉冲驱动能够有利于降低非特异性相互作用的总量，执行另外的实验，在该实验中测量包含PSA为0pM的样本在磁性驱动之前和之后的信号。在连续驱动的情况下，登记簇团数量的增大接近3.5倍，然而当利用脉冲驱动时，信号的增大低于2倍。

前述实验通过应用以下的脉冲序列来执行：在2s内施加幅值为3.5mT的磁场，然后暂停4s，该场的幅值为零。使用的粒子浓度是0.1mg/ml的500nm磁性粒子（AdemTech）。

虽然已经在附图和前述描述中详细图示和描述了本发明，但是这种图示和描述将被认为是说明性或范例性的，而不是限制性的；本发明不限于公开的实施例。本领域技术人员在实施主张权利的发明时，通过对附图、公开内容和所附权利要求的研究，能够理解和实现对公开的实施例的其他变型。在权利要求中，“包括”一词不排除其他元件或步骤，并且不定冠词“一”或“一个”不排除多个。有些手段记载在相互不同的从属权利要求中，这一事实并不表示不能用这些手段的组合来获益。在权利要求中的任何附图标记不应当被解释为是对范围的限制。

Claims (10)

1.一种用于检测样本体积（111）中的磁性粒子（MP）的簇团（C）的方法，所述方法包括以下步骤：

a）利用输入光（L1）辐照所述样本体积（111）；

b）通过磁驱动场（B）来驱动所述样本体积（111）中的磁性粒子（MP、C），其中，所述驱动场通过暂停被中断至少一次；

c）检测源自于所述输入光（L1）与所述样本体积（111）中的磁性粒子（MP）的簇团（C）进行的相互作用的输出光（L2）。

2.一种用于检测样本中的磁性粒子（MP）的簇团（C）的传感器设备（100），包括：

a）具有样本体积（111）的样本容器（110），在所述样本体积中能够提供具有磁性粒子（MP、C）的样本；

b）光源（130），其用于向所述样本体积（111）发射输入光（L1）；

c）磁场发生器（120），其用于生成驱动所述样本体积（111）中的磁性粒子（MP）的簇团（C）的磁驱动场（B）；

d）控制单元（150），其用于控制所述磁场发生器（120），使得对所述簇团（C）的所述驱动通过暂停被中断至少一次；

e）光检测器（140），其用于检测源自于所述输入光（L1）与所述样本体积（111）中的磁性粒子的簇团（C）进行的相互作用的输出光（L2）。

3.如权利要求1所述的方法或者如权利要求2所述的传感器设备（100），

其特征在于，通过校准测量确定暂停的持续时间和/或暂停的数量。

4.如权利要求1所述的方法或者如权利要求2所述的传感器设备（100），

其特征在于，暂停的所述持续时间在约0.1s到约10s之间的范围内，优选在约1s到约2s之间。

5.如权利要求1所述的方法或者如权利要求2所述的传感器设备（100），

其特征在于，所述磁驱动场（B）通过约10个到约50个暂停被中断。

6.如权利要求1所述的方法或者如权利要求2所述的传感器设备（100），

其特征在于，所述磁驱动场（B）旋转。

7.如权利要求1所述的方法或者如权利要求2所述的传感器设备（100），

其特征在于，检测到的簇团（C）由两个磁性粒子（MP）形成。

8.如权利要求1所述的方法或者如权利要求2所述的传感器设备（100），

其特征在于，所述样本包括两种类型的磁性粒子（MP），其能够以三明治配置与所述样本中的目标成分（AG）相结合。

9.如权利要求1所述的方法或者如权利要求2所述的传感器设备（100），

其特征在于，所述输出光（L2）包括被磁性粒子的簇团（C）散射的输入光（L1）。

10.如权利要求2-9中的任一项所述的传感器设备（100）用于分子诊断、生物样本分析、化学样本分析、食物分析和/或法医分析的用途。

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