CN103627757B - 提高小豹斑鹅膏菌丝体产毒能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高小豹斑鹅膏菌丝体产毒能力的方法，属于大型真菌培养技术领域。其特征为：将经过固体诱导并扩繁的菌丝体，转入液体培养，直接在液体培养基中，加入复合氨基酸及微量的子实体干粉，即可使菌丝体的产毒能力提高5.5～7.2倍。本发明具有操作简单易实现、周期短、生产成本低、效益明显、生态等特点。鹅膏毒素价值大应用范围广，在开发新特效药如抗肿瘤、抗菌抗病毒、镇静或麻醉药等领域具有潜在地应用，但至今因鹅膏资源珍稀、难以人工驯化、毒素的化学合成品无活性等问题尚难以开发应用。本发明通过简单的培养，即可使菌丝体的鹅膏毒肽产量明显提高，为今后鹅膏毒素的有益生物转化及可持续性开发利用等奠定了重要基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高小豹斑鹅膏菌丝体产毒能力的方法，属于生物技术领域，具体地说是属于有毒大型真菌室内培养范畴。
背景技术
鹅膏菌属（Amanita）隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、鹅膏菌科（Amanitaceae），是有毒的大型真菌中较特殊、较有价值的一个世界性广布大属，其物种多样性是非常丰富的。全球已报道近400种，中国已记录的近100种（含亚种、变种及变型）。据考证，目前中国仍有不少种尚未研究和命名。但是如今随着全球生态危机的出现，我国的许多大型真菌资源已告危，处于严重衰退及濒危状态，而部份种面临着可能还没有被人类认识或发现其价值时，就已灭绝的风险。
鹅膏菌属中的大部份种属于著名剧毒菌，据知，因误食野生蕈菌中毒死亡者95%是因鹅膏菌所致。科学家们对鹅膏菌真正感兴趣的是其毒性，因此，大约在140年前，人们就开始了鹅膏菌毒素的研究。鹅膏菌毒素可分为四类，其中最主要也是最重要的是肽类毒素，肽类毒素又包括鹅膏毒肽（amatoxins）、鬼笔毒肽（phallotoxins）和毒伞素类（virotoxins）三种，鹅膏毒肽是一类双环八肽，已分离纯化的天然鹅膏毒肽有9种。
鹅膏毒素的应用研究主要体现在以下几方面：①可用于研究真核生物基因的表达、调控及细胞定位，因鹅膏毒肽对真核生物RNA聚合酶Ⅱ的活性有专一性抑制作用；②可开发抗菌、抗病毒特效新药，已证明，疱疹病毒、腺病毒、12猿病毒、禽支气管炎病毒等对amatoxins很敏感；③可筛选抗肿瘤药物，已报道了α-鹅膏毒肽的抗肿瘤活性；④可开发镇静、麻醉及其它特效药，西伯利亚、印度、日本、美国等报道将毒蝇伞作为梦幻剂、镇静或麻醉药、安眠药等；⑤可用于生物防冶等，鹅膏子实体对典型农作物害虫有明显的杀灭及抑制活性。
目前导致鹅膏难以开发及可持续性利用的主要瓶颈问题有：①鹅膏资源珍稀，其种群小，个体少，产量低，分布数量极其有限，加之对生境敏感，一旦生境受到破坏，极易消失或灭绝，属于特殊的致危生物类群，这增加了其进一步被研究、利用的难度；②鹅膏菌属，大多属于外生菌根真菌，目前尚不能人工栽培，其绝大部份种仍属于自然界中难培养或未能培养的微生物，难以人工、半人工栽培，虽然已有少数的种能进行菌丝的纯培养，但也存在一些问题，如菌丝生长缓慢、菌丝中毒素含量不高；③鹅膏多肽毒素，是一种由7-8个被修饰了的稀有氨基酸组成的环肽，可能不是基因编码的直接产物，而是经过加工后的次级产物，要克隆毒素的基因是复杂而困难的；④目前毒素的化学合成品几乎没有活性。因此，至今国内外还没有一种能规模化开发的毒素产品，现作为生化试剂的肽类毒素依然价格昂贵（10多年前每克在10万美元左右—陈作红等，1999），难以满足科研和应用所需。
本发明在小豹斑鹅膏纯培养技术有明显突破的基础上，对培养菌丝毒素产量低的问题进行了重点研究和攻关，使菌丝体的鹅膏毒肽产量明显提高，为鹅膏毒素的可持续性开发利用等奠定了重要基础。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种简单、易实现、成本不高，能使鹅膏菌丝体产毒能力明显增强的方法。
本发明的技术任务是，结合培养方式的改变及特殊物质的添加，以共同提高菌丝体的产毒能力，主要按以下方式实现：将经过固体培养诱导并扩繁的菌丝体，转入液体培养，在液体培养阶段，培养基中同时加入复合氨基酸及微量的子实体干粉，可使菌丝体的产毒能力提高5.5～7.2倍；
所述菌丝体的固体诱导及扩繁方法如下：在云南武定狮子山，采摘生长健状、未完全开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.3cm2大小，嵌入诱导培养基，所述培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、NH4NO30.35g/L、KNO30.35g/L、维生素B10.10mg/L、16.0波美的麦芽汁180ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6，在23～24℃下暗培养40～45天，组织块隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将菌丝在固体扩大培养基中扩繁8～10代，每代培养48～55天后，扩繁的菌丝及培养基中α-鹅膏毒肽总含量平均为420±25μg/g.干重，其所述的扩大培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、腐熟滇青冈叶子粉40～50g/L、16.0波美的麦芽汁180ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6；
所述扩大培养基中，腐熟滇青冈叶子粉的制备方法如下：武定狮子山收集滇青冈叶子，带回实验用地，按4：1～5：1的比例与猪粪拌匀，按叶子重量的0.5～1.0%加入尿素，混匀，加水至叶子湿透，上面覆盖遮阴网，前1个月每隔4～5天揭开遮阴网，里外翻匀，加水湿透，然后再静止发酵2～3个月，其间，看情况10～15天补水一次，90～120天后，将已腐熟的叶子摊开，晒干，粉碎，过80目分样筛即可；
所述液体培养方法如下：将经过固体平板培养的菌丝体，用直径为6mm的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种6块，置于转速为150r/min、温度为24℃的摇床上培养，其所述的液体培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、腐熟滇青冈叶子粉水提液200～250ml/L、16.0波美的麦芽汁180ml，控制培养基PH值为5.6，其中，腐熟滇青冈叶子粉水提液的制备方法如下：取以上腐熟滇青冈叶子粉100g，加入800～1000ml蒸馏水，加热煮沸1～1.5hr，过滤，滤液加热浓缩成200～250ml；
所述的复合氨基酸组成为谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸，四种氨基酸的加入量分别为谷氨酸0.40～0.60g/L，甘氨酸1.00～1.20g/L，丙氨酸1.00～1.20g/L，异亮氨酸0.50～0.60g/L；
所述子实体干粉的加入方法如下：将小豹斑鹅膏子实体在50～60℃下烘干，粉碎，按0.005～0.008g/L的量加入到液体培养基中。
本发明的有益效果是：直接在液体培养基中，添加少量特殊物质，即可使菌丝的产毒能力明显提高，其特点如下：
（1）操作简单易实现：将固体扩繁的菌丝体，转入液体培养，直接在液体培养基中添加少量特殊物质，常规培养即可；
（2）周期比较短：相对于前期的固体培养，液体培养的时间缩短了近2倍；
（3）生产成本不高；本发明液体培养基中所添加的特殊物质，为常见及普通的四种氨基酸，材料易得，价格便宜，小豹斑鹅膏子实体用量很微小，其野外采摘及贮备容易满足规模化生产所需，不会影响生产成本；
（4）效益明显、生态：毒素产量明显提高，这种生物转化比化学合成直接、有效，且有很好的生态优势及潜力，值得推广。
具体实施方式
以下的实施例子是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实例一：
菌丝体的诱导及扩繁：在云南武定狮子山，采摘生长健状、未完全开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.3cm2大小，嵌入诱导培养基，所述培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、NH4NO30.35g/L、KNO30.35g/L、维生素B10.10mg/L、16.0波美的麦芽汁180ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6，在23～24℃下暗培养40天，组织块隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将菌丝在固体扩大培养基中扩繁8代，每代培养48天后，扩繁的菌丝及培养基中α-鹅膏毒肽总含量平均为420±25μg/g.干重，其所述的扩大培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、腐熟滇青冈叶子粉40g/L、16.0波美的麦芽汁180ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6；
腐熟滇青冈叶子粉的制备方法如下：武定狮子山收集滇青冈叶子，带回实验用地，按5：1的比例与猪粪拌匀，按叶子重量的1.0%加入尿素，混匀，加水至叶子湿透，上面覆盖遮阴网，前1个月每隔4天揭开遮阴网，里外翻匀，加水湿透，然后再静止发酵2个月，其间，10天补水一次，90天后，将已腐熟的叶子摊开，晒干，粉碎，过80目分样筛即可；
将经过固体培养诱导并已扩繁的菌丝体，转入液体培养，液体培养方法如下：将经过固体平板培养的菌丝体，用直径为6mm的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种6块，置于转速为150r/min、温度为24℃的摇床上培养，其所述的液体培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、腐熟滇青冈叶子粉水提液200ml/L、16.0波美的麦芽汁180ml，补充谷氨酸0.40g/L、甘氨酸1.00g/L、丙氨酸1.00g/L、异亮氨酸0.50g/L、小豹斑鹅膏子实体干粉0.005g/L，控制培养基PH值为5.6，其中，腐熟滇青冈叶子粉水提液的制备方法如下：将以上腐熟滇青冈叶子粉100g，加入800ml蒸馏水，加热煮沸1hr，过滤，滤液加热浓缩成200ml；小豹斑鹅膏子实体干粉的准备方法如下：将子实体在50℃下烘干，粉碎，过120目分样筛。
实例二：
菌丝体的诱导及扩繁：在云南武定狮子山，采摘生长健状、未完全开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.3cm2大小，嵌入诱导培养基，所述培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、NH4NO30.35g/L、KNO30.35g/L、维生素B10.10mg/L、16.0波美的麦芽汁180ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6，在23～24℃下暗培养45天，组织块隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将菌丝在固体扩大培养基中扩繁10代，每代培养55天后，扩繁的菌丝及培养基中α-鹅膏毒肽总含量平均为420±15μg/g.干重，其所述的扩大培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、腐熟滇青冈叶子粉50g/L、16.0波美的麦芽汁180ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6；
腐熟滇青冈叶子粉的制备方法如下：武定狮子山收集滇青冈叶子，带回实验用地，按4：1的比例与猪粪拌匀，按叶子重量的0.5%加入尿素，混匀，加水至叶子湿透，上面覆盖遮阴网，前1个月每隔5天揭开遮阴网，里外翻匀，加水湿透，然后再静止发酵3个月，其间，15天补水一次，120天后，将已腐熟的叶子摊开，晒干，粉碎，过80目分样筛即可；
将经过固体培养诱导并已扩繁的菌丝体，转入液体培养，液体培养方法如下：将经过固体平板培养的菌丝体，用直径为6mm的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种6块，置于转速为150r/min、温度为24℃的摇床上培养，其所述的液体培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、腐熟滇青冈叶子粉水提液250ml/L、16.0波美的麦芽汁180ml，补充谷氨酸0.60g/L、甘氨酸1.20g/L、丙氨酸1.20g/L、异亮氨酸0.60g/L、小豹斑鹅膏子实体干粉0.008g/L，控制培养基PH值为5.6，其中，腐熟滇青冈叶子粉水提液的制备方法如下：将以上腐熟滇青冈叶子粉100g，加入1000ml蒸馏水，加热煮沸1.5hr，过滤，滤液加热浓缩成250ml；小豹斑鹅膏子实体干粉的准备方法如下：将子实体在60℃下烘干，粉碎，过120目分样筛。
实例三：
菌丝体的诱导及扩繁：在云南武定狮子山，采摘生长健状、未完全开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.3cm2大小，嵌入诱导培养基，所述培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、NH4NO30.35g/L、KNO30.35g/L、维生素B10.10mg/L、16.0波美的麦芽汁180ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6，在23～24℃下暗培养43天，组织块隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将菌丝在固体扩大培养基中扩繁9代，每代培养50天后，扩繁的菌丝及培养基中α-鹅膏毒肽总含量平均为420±10μg/g.干重，其所述的扩大培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、腐熟滇青冈叶子粉45g/L、16.0波美的麦芽汁180ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6；
腐熟滇青冈叶子粉的制备方法如下：武定狮子山收集滇青冈叶子，带回实验用地，按4：1的比例与猪粪拌匀，按叶子重量的0.8%加入尿素，混匀，加水至叶子湿透，上面覆盖遮阴网，前1个月每隔5天揭开遮阴网，里外翻匀，加水湿透，然后再静止发酵2.5个月，其间，15天补水一次，100天后，将已腐熟的叶子摊开，晒干，粉碎，过80目分样筛即可；
将经过固体培养诱导并已扩繁的菌丝体，转入液体培养，液体培养方法如下：将经过固体平板培养的菌丝体，用直径为6mm的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种6块，置于转速为150r/min、温度为24℃的摇床上培养，其所述的液体培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、腐熟滇青冈叶子粉水提液230ml/L、16.0波美的麦芽汁180ml，补充谷氨酸0.50g/L、甘氨酸1.10g/L、丙氨酸1.10g/L、异亮氨酸0.55g/L、小豹斑鹅膏子实体干粉0.007g/L，控制培养基PH值为5.6，其中，腐熟滇青冈叶子粉水提液的制备方法如下：将以上腐熟滇青冈叶子粉100g，加入900ml蒸馏水，加热煮沸1.5hr，过滤，滤液加热浓缩成230ml；小豹斑鹅膏子实体干粉的准备方法如下：将子实体在55℃下烘干，粉碎，过120目分样筛。
实例四：
菌丝体的诱导及扩繁：在云南武定狮子山，采摘生长健状、未完全开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.3cm2大小，嵌入诱导培养基，所述培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、NH4NO30.35g/L、KNO30.35g/L、维生素B10.10mg/L、16.0波美的麦芽汁180ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6，在23～24℃下暗培养44天，组织块隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将菌丝在固体扩大培养基中扩繁9代，每代培养53天后，扩繁的菌丝及培养基中α-鹅膏毒肽总含量平均为420±20μg/g.干重，其所述的扩大培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、腐熟滇青冈叶子粉48g/L、16.0波美的麦芽汁180ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6；
腐熟滇青冈叶子粉的制备方法如下：武定狮子山收集滇青冈叶子，带回实验用地，按5：1的比例与猪粪拌匀，按叶子重量的0.65%加入尿素，混匀，加水至叶子湿透，上面覆盖遮阴网，前1个月每隔5天揭开遮阴网，里外翻匀，加水湿透，然后再静止发酵2个月，其间，13天补水一次，110天后，将已腐熟的叶子摊开，晒干，粉碎，过80目分样筛即可；
将经过固体培养诱导并已扩繁的菌丝体，转入液体培养，液体培养方法如下：将经过固体平板培养的菌丝体，用直径为6mm的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种6块，置于转速为150r/min、温度为24℃的摇床上培养，其所述的液体培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、腐熟滇青冈叶子粉水提液220ml/L、16.0波美的麦芽汁180ml，补充谷氨酸0.55g/L、甘氨酸1.15g/L、丙氨酸1.15g/L、异亮氨酸0.58g/L、小豹斑鹅膏子实体干粉0.006g/L，控制培养基PH值为5.6，其中，腐熟滇青冈叶子粉水提液的制备方法如下：将以上腐熟滇青冈叶子粉100g，加入850ml蒸馏水，加热煮沸1.2hr，过滤，滤液加热浓缩成220ml；小豹斑鹅膏子实体干粉的准备方法如下：将子实体在58℃下烘干，粉碎，过120目分样筛。
Claims (1)
1.一种提高小豹斑鹅膏菌丝体产毒能力的方法，其特征为，在液体培养基中同时加入4种氨基酸及微量的子实体干粉，培养25～28天，菌丝产生的α-鹅膏毒肽总量为2330～3015μg/g.干重，为固体培养时的5.5～7.2倍，实施步骤为：将菌丝体固体培养诱导并扩繁，然后转入液体培养，具体方法如下：
（1）菌丝体的诱导及扩繁：在云南武定狮子山，采摘生长健状、未完全开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.3cm2大小，嵌入诱导培养基，所述培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、NH4NO30.35g/L、KNO30.35g/L、维生素B10.10mg/L、16.0波美的麦芽汁180ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6，在23～24℃下暗培养40～45天，组织块隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将菌丝在固体扩大培养基中扩繁8～10代，每代培养48～55天后，扩繁的菌丝及培养基中α-鹅膏毒肽总含量平均为420±25μg/g.干重，其所述的扩大培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、腐熟滇青冈叶子粉40～50g/L、16.0波美的麦芽汁180ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6；所述腐熟滇青冈叶子粉的制备方法如下：在武定狮子山收集滇青冈叶子，带回实验用地，按4：1～5：1的比例与猪粪拌匀，按叶子重量的0.5～1.0%加入尿素，混匀，加水至叶子湿透，上面覆盖遮阴网，前1个月每隔4～5天揭开遮阴网，里外翻匀，加水湿透，然后再静止发酵2～3个月，其间，看情况10～15天补水一次，90～120天后，将已腐熟的叶子摊开，晒干，粉碎，过80目分样筛即可；
（2）液体培养：将经过固体平板培养的菌丝体，用直径为6mm的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种6块，置于转速为150r/min、温度为24℃的摇床上培养，其所述的液体培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g/L、KH2PO40.50g/L、腐熟滇青冈叶子粉水提液200～250ml/L、16.0波美的麦芽汁180ml，补充谷氨酸0.40～0.60g/L、甘氨酸1.00～1.20g/L、丙氨酸1.00～1.20g/L、异亮氨酸0.50～0.60g/L、小豹斑鹅膏子实体干粉0.005～0.008g/L、控制培养基PH值为5.6；所述腐熟滇青冈叶子粉水提液的制备方法如下：取以上腐熟滇青冈叶子粉100g，加入800～1000ml蒸馏水，加热煮沸1～1.5hr，过滤，滤液加热浓缩成200～250ml；所述子实体干粉的制备方法如下：将小豹斑鹅膏子实体在50～60℃下烘干，粉碎，过120目分样筛。
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