CN103623428A - 一种包含ERβ的重组病毒的改造方法及其用途 - Google Patents

一种包含ERβ的重组病毒的改造方法及其用途 Download PDF

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本发明涉及包含ERβ的重组病毒的改造方法，其包含病毒载体以及选自如下的基因构建体：1）人ERβ基因或其功能片段基因，或其简并性序列；和2）含有人ERβ基因或其功能性片段基因，或其简并性序列的嵌合基因。本发明还涉及人ERβ基因或其功能性片段基因的基因构建体用于制备人乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及结直肠癌肿瘤疾病基因治疗的药物及对该基因治疗药物进行改造得到的具有靶向性的基因治疗药物。本发明还涉及一种利用所述重组病毒或其改造物进行乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及结直肠癌肿瘤疾病的靶向基因治疗的方法。

Description

一种包含ERβ的重组病毒的改造方法及其用途
技术领域
本发明涉及哺乳动物乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及结直肠癌肿瘤疾病的基因治疗领域。 
背景技术
乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的恶性肿瘤，其发病率位居女性恶性肿瘤的首位，近年来发病率呈直线上升并呈低龄趋势，大中城市尤为突出，已成为城市女性的第一杀手。从病理学角度，乳腺癌是一种异质性肿瘤，在组织形态、免疫表型、生物学行为及治疗反应上存在着极大的差异。2004年Nielsen等提出了三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)的概念。三阴性乳腺癌是指雌激素受体α（estrogen receptor，ERα），孕激素受体（progesterone receptor，PR）与人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factorreceptor-2，HER-2）均阴性的乳腺癌，具有独特的生物学行为及临床病理特征，占全部乳腺癌总数的10％～15％，具有恶性程度高、复发转移快、对内分泌治疗不敏感、需要化疗、预后差、死亡率高等特点，目前国内外仍缺乏针对这类特殊类型乳腺癌的有效治疗手段。大量研究证实，ERα表达与乳腺癌细胞的分化程度、恶性程度、转移部位密切相关，现已公认为乳腺癌分类、评估预后、指导内分泌治疗的重要指标。ERα阳性乳腺癌中，60％的患者对他莫昔芬术后辅助内分泌治疗有效，40％的患者对内分泌治疗原发抗拒；而ERα阴性乳腺癌中，只有10％的患者对内分泌治疗有效。且ERα阴性的病人术后易有复发，不论淋巴结有无转移，ERα阴性者预后较阳性者差。 
ERβ是1996年瑞典的Kuiper等在研究孤儿核受体时，从鼠前列腺癌细胞cDNA文库中首先发现的一种雌激素受体新亚型，与ERα同属于核受体超家族成员，但在基因、结构、功能、作用机制、分布等方面均有不同，对雌激素靶器官和组织的生理、病理产生不同的影响。近年来研究发现，ERβ可通过多种机制产生抑瘤作用，具有对抗乳腺癌发展的保护性作用，可能成为一个肿瘤抑制基因。通过转染在ERα阳性乳腺癌细胞系MCF-7、T47D和ERα阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、SK-BR-3中表达ERβ可改变C-myc、细胞周期蛋白A、D1和Cdk2、p21waf1/cip1、p27kip1、FasL等相关蛋白因子的表达，引起细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，从而显著抑制肿瘤细胞的生长，降低肿瘤细胞浸润转移能力，并抑制裸鼠体内移植瘤的形成。此外，通过转染在乳腺癌细胞中表达ERβ还可引起血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子(PDGFβ)表达下调，减少微血管密度，显著抑制肿瘤血管发生，协同其抑制肿瘤细胞生长的作用，可进一步提高体内抑瘤效果。因此，向肿瘤细胞中导入ERβ基因并表 达可通过多种机制产生显著的抑瘤效果。 
基因治疗是近年来兴起的一种治疗肿瘤的新方法。所谓基因治疗是指运用分子生物学方法，将具有治疗作用的目的基因导入至靶细胞，赋予或增加其某种功能，从而达到治疗疾病的目的。肿瘤是一种多基因参与的分子疾病，基因治疗或许可为ERα阴性乳腺癌的治疗提供一较为有效的治疗策略。腺病毒载体具有高效低毒、容量大、易于分离等优点而成为基因治疗中应用最为广泛的载体。目前世界上进入III期临床试验的基因治疗制品有80％是采用腺病毒载体。与逆转录病毒家族载体不同，腺病毒载体介导的基因转移是非整合型的，以附加体的形式存在，不随宿主细胞分裂而复制，是典型的一过性表达载体，因此它安全性高、致瘤性低。 
近年来，已经有大量的荧光材料被开发出来作为荧光生物成像的探针，包括：荧光蛋白、有机染料、金属复合物以及半导体量子点。这些传统的荧光染料一般都是基于单光子激发，由高能量的光激发出低能量的荧光。这些单光子激发染料存在以下缺点：(i)长时间的暴露在高能量的激发光下会造成生物体的DNA损伤和细胞死亡；（ii）来自生物组织的毛发、血液、组织和皮肤产生的本底荧光使得生物探针的信噪比很低；（iii）对生物组织的穿透能力低。稀土上转换荧光纳米粒子（UCNPs）是以无机基质为主体，镧系掺杂元素为客体，且掺杂元素嵌入主体晶格的内部而合成的纳米晶。 
这种性能独特的UCNPs在做生物标记成像时具有独特的优势：发射峰窄；发光易调控；光学稳定性好；寿命长；毒性低；对组织损伤小；组织穿透性强；降低本底辐射干扰。UCNPs能够将连续吸收的两个或多个泵浦光子转换成短波长辐射，实现上转换过程。 
在含有掺杂元素的客体中，又存在敏化剂-活化剂体系，敏化剂（如Yb3+）首先接收近红外光（NIR），又通过非辐射能量传递，将能量传递给活化剂(如Er3+,Tm3+)，使其跃迁到更高的能级,最终活化剂以辐射的形式释放出能量，发射出可见光。目前，氟化物化学性能稳定，声子能量低（～350cm-1），发光效率较高，成为最常用的基质。在980nm近红外光下，以NaYF4作为基质，吸收横截面较大的Yb3+作为敏化剂，Er3+、Tm3+等稀土元素作为活化剂所合成UCNPs，已经得到广泛的应用。最近已经有研究报道了UCNPs在生物成像和药物研究中的一些新的应用。因此，UCNPs已经成为了一类新型的生物成像标记染料。本项目首次制备出激发光谱和发射光谱均在近红外区的具有肿瘤靶向性及治疗作用的上转换纳米荧光探针FA-Ad5-ERβ-UCNP，并将其导入乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231中，体外实验考察其对ERα阴性乳腺癌细胞的靶向基因治疗作用，并对其抑瘤机制进行系统的研究。另外，借助双光子激光扫描共聚焦显微镜体外监测以实时优化感染效率，为后期将探针应用于深层肿瘤组织的 诊断和监控治疗研究提供理论依据。 
发明内容：
（1）上转换纳米荧光粒子标记的靶向基因治疗药物FA-Ad5-ERβ-UCNP的构建及表征 
对重组腺病毒进行叶酸修饰，形成叶酸-重组腺病毒（FA-Ad5-ERβ）。用溶剂热法合成OA-UCNP（NaYF4:Yb,Tm）后，采用聚丙烯酸(PAA)进行配体交换反应，对共掺杂了Yb,Tm的NaYF4纳米晶体粒子进行了有效的表面修饰，形成上转换荧光纳米探针（PAA-UCNPs）。利用PAA上的羧基和叶酸修饰的重组腺病毒（FA-Ad5-ERβ）上的氨基进行反应，构建激发和发射均在近红外区的上转换纳米荧光粒子标记的靶向基因治疗药物FA-Ad5-ERβ-UCNP。 
重组腺病毒包括腺病毒载体及如下的基因构建体 
1)人ERβ基因，或其简并性序列；和 
2）人ERβ基因功能性片段ERβ-DBDmut或其简并性序列的嵌合基因。 
（2）考察FA-Ad5-ERβ-UCNP对ERα阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的作用及机制研究 
FA-Ad5-ERβ-UCNP体外感染ERβ低表达、ERα阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231，通过双光子激光扫描共聚焦显微镜检测荧光阳性细胞百分率以优化感染条件，提高病毒感染效率。并用显微镜进行荧光成像分析,考察药物的靶向性。进一步，通过药理学检测手段，研究转染ERβ基因的乳腺癌细胞的生长情况，如细胞增值、运动能力、细胞周期以及细胞凋亡，以探索ERβ的抑瘤效率及作用机制。并进一步用实时定量PCR和Western Blot的方法考察肿瘤微血管密度、细胞周期、细胞凋亡相关的基因表达，以探索其抑瘤机制。 
（3）FA-Ad5-ERβ-UCNP介导ERβ基因靶向诊断和治疗ERα阴性乳腺癌 
将MDA-MB-231乳腺癌细胞接种于裸鼠腋窝皮下，建立人乳腺癌细胞移植瘤裸鼠模型。以PBS为空白对照，FA-Ad5-UCNP为空载体对照，FA-Ad5-ERβ-UCNP为实验组，尾静脉注射给药。通过上转换荧光在体成像系统实时在位监测ERβ基因的表达，考察FA-Ad5-ERβ-UCNP的感染效率。不断优化给药方案，提高肿瘤感染效率。同时，利用该系统实时在位跟踪考察FA-Ad5-ERβ-UCNP对肿瘤的靶向诊断作用，跟踪肿瘤的生长状态以考察治疗效果。进一步用药理学和细胞生物学以及免疫组化等常规方法考察肿瘤微血管密度、细胞周期、细胞凋亡以及与之相关的基因表达，以探索其抑瘤机制。 
上转换纳米荧光粒子标记的靶向基因治疗药物FA-Ad5-ERβ-UCNP用途：用于制备针对哺乳动物肿瘤疾病的靶向基因治疗药物的疫苗。人的乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及结直肠癌均可治疗。 
本发明的技术摘要如图3所示。 
有益效果： 
（1）首次将ERβ基因导入活体肿瘤模型中，考察其对ERα阴性乳腺癌的抑制生长作用，并对其抑瘤机制进行系统的研究。 
（2）目前，大多数基因治疗的给药方案都是瘤内注射，这限制了基因治疗方法应用于一些深层肿瘤的治疗。本项目利用叶酸的靶向作用，通过静脉注射给药，实现对三阴性乳腺癌的靶向基因治疗。 
（3）传统的基因治疗方法存在转染效率低下，转染效率及治疗结果要等到后期的药理学实验结束之后才能获知的缺陷。本项目借助上转换纳米荧光探针在体成像系统无损实时在位监测转染效率、转染范围、肿瘤组织血氧等以实时优化治疗方案，并实现对深层肿瘤组织的诊断和监控治疗。 
附图说明
图1.pAdxsi-ERβ重组腺病毒质粒构建流程图； 
图2FA-Ad5-ERβ-UCNP构建的流程图； 
图3本发明的技术摘要附图。 
具体实施方式
实施例1上转换纳米荧光粒子标记的靶向基因治疗药物FA-Ad5-ERβ-UCNP的构建及表征 
对重组腺病毒进行叶酸修饰，形成叶酸-重组腺病毒（FA-Ad5-ERβ）。用紫外可见分光光度计分别对FA、Ad5和FA-Ad5-ERβ进行光吸收分析，以确认是否成功构建FA-Ad5-ERβ。并用SDS-PAGE法确定FA是否成功地连接到了Ad5-ERβ上。 
用溶剂热法合成OA-UCNP（NaYF4:Yb,Tm），并用高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）、能量弥散X射线分析（EDXA）、X射线衍射（XRD）对其形貌、粒径、组成及晶相结构进行分析。采用聚丙烯酸(PAA)进行配体交换反应,对共掺杂了Yb,Tm的NaYF4纳米晶体粒子进行了有效的表面修饰，形成上转换荧光纳米探针（PAA-UCNPs），并用同样的方法进行分析。利用PAA上的羧基和叶酸修饰的重组腺病毒（FA-Ad5-ERβ）上的氨基进行反应，构建了上转换纳米荧光粒子标记的靶向基因治疗药物FA-Ad5-ERβ-UCNP。用TEM对FA-Ad5-ERβ-UCNP进行分析，以确认是否成功构建FA-Ad5-ERβ-UCNP，如图2所示。并用980nm激发对其上转换发光光谱进行分析。 
具体实验方法，如图1所示： 
A.叶酸（FA）的活化。 
①称取22mg FA溶于3ml DMSO中，再加入15.47mg二环己基碳二亚胺（DCC）与15.3mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS），待溶解后添加0.05ml三乙醇胺(TEA)。 
②置于水浴中40度过夜。 
③4000rpm离心20分钟 
④取1ml上清液加入4ml丙酮及2～3滴氨水，至析出FA晶体。 
⑤将丙酮吹干得到FA晶体，溶于1ml Tris。 
B.叶酸（FA）修饰重组腺病毒。 
活化后的FA1ml加入1ml重组腺病毒（Ad5-ERβ）(浓度为2×108pfu/ml)中，4度反应4小时，形成叶酸-重组腺病毒（FA-Ad5-ERβ）。 
C.Sephadex G25柱层析分离纯化叶酸-重组腺病毒（FA-Ad5-ERβ）。 
D.OA-UCNP（NaYF4:Yb,Tm）的制备。 
①按照表格中的量量取①,②,③,④,⑤，加入到烧瓶内，升温到150℃，搅拌，待所有物质完全溶解，降温至室温。 
②称取⑥,⑦溶解于10mL甲醇，滴加至烧瓶内，升温到50℃，持续30min。 
③升温到100℃，持续30min，除去甲醇。抽真空40min，在N2保护下，快速升温到290℃，反应一小时。 
④降温至室温，加入适量乙醇和环己烷，离心多次，得OA-UCNP产物。 
E.PAA-UCNP（NaYF4:Yb,Tm）的制备。 
①称取200mg PAA-1800加入到25mL DEG中，Ar气保护，升温至110度，搅拌至PAA溶解。 
②取OA-UCNP分散于氯仿中，加入甲苯，之后逐滴滴加至烧瓶内，反应1h。 
③升温至240℃，保持1.5h。 
④降低至室温，加入少量丙酮，乙醇离心分离多次得到PAA-UCNP产物。 
F.将步骤C中得到的FA-Ad5-ERβ和步骤E中的PAA-UCNP分散于除水的DMSO中，加入DCC、HNS，闭光，50℃下避光反应6h，离心洗涤，得到最终产物FA-Ad5-ERβ-UCNP。 
实施例2考察FA-Ad5-ERβ-UCNP对ERα阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的作用及机制研究 
将实验分为空白细胞培养组、Ad5-ERβ-UCNP无叶酸对照组、FA-Ad5-UCNP空载体对照组以及FA-Ad5-ERβ-UCNP实验组。各组体外感染ERβ低表达、ERα阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞，通过双光子激光扫描共聚焦显微镜检测荧光阳性细胞百分率以考察重组腺病毒对细胞的转染效率。通过优化感染复数、感染方式以及感染次数以提高转染效率，为制定基因治疗给药方案提供参考。通过激光扫描共聚焦荧光显微镜进行荧光成像分析,考察药物的靶向性。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)、软琼脂集落生长实验和细胞划痕法考察ERβ高表达对细胞生长和运动能力的影响。采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，并根据检测结果，进一步采用RT-PCR和western blot方法检测细胞周期或细胞凋亡相关基因的表达水平，以探索ERβ的作用机制。 
具体实验方法： 
A.激光共聚焦扫描显微镜检测FA-Ad5-ERβ-UCNP对细胞的转染效率和靶向性 
将MDA-MB-231细胞接种于共聚焦培养皿，培养过夜后分别用FA-Ad5-ERβ-UCNP和Ad5-ERβ-UCNP重组腺病毒进行转染，培养24h。将对照组和实验组的细胞用于共聚焦显微镜成像，随机选取5个高倍视野，在显微镜下观察荧光阳性的细胞数，计数阳性细胞数。比较修饰了叶酸和没修饰叶酸的重组腺病毒对细胞的趋向能力以考察FA-Ad5-ERβ-UCNP对细胞的靶向感染作用。 
B.四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定细胞抑制率 
96孔板培养MDA-MB-231，培养过夜后对不同实验组分别用不同感染强度10、50、100、200和400转染重组腺病毒，继续培养细胞72h后用MTT法检测的乳腺癌细胞的生长率，并绘制剂量效应曲线。 
C.软琼脂集落生长实验 
在6孔板中每孔加2mL1:1混合的1.2％低溶点琼脂糖和含20％胎牛血清的2×培养基，室温30min凝固。加细胞悬液于1∶1混合0.7％低溶点琼脂糖和含20％小牛血清的2×培养基中，细胞终浓度为1×104，滴入已铺有底层胶的6孔板中，每孔加1mL。每种细胞制备3个复孔，置37℃5％CO2培养箱培养3周，相差显微镜计数细胞集落。 
D.细胞划痕法测定细胞迁移 
接种约5×105乳腺癌细胞于6孔板中，培养过夜至形成细胞单层，用移液器滴头沿培养板底部呈“一”字形划痕，显微镜下拍照，记录划痕区距离，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，继续培养，于多个时间点取样、拍照，测量迁移距离并计算分析。 
E.流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡 
将MDA-MB-231细胞接种于培养板，培养一定时间后用重组腺病毒进行转染，胰酶消化收集细胞并进行样品制备，采用PI+Annexin-V双染法检测细胞凋亡以及PI染色检测细胞周期。 
F.实时定量PCR法 
经FA-Ad5-ERβ-UCNP感染的乳腺癌细胞培养2d后，用TRIzol试剂提取对照组和实验组细胞总mRNA，进行逆转录反应得到cDNA。用cDNA做模板，合成ERβ基因的引物进行PCR反应，采用10μl体系，扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并采用凝胶成像系统进行成像、分析。 
G.western blot蛋白质印迹法 
抽提对照组和实验组细胞蛋白，取上清液用于检测。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干电转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜。封闭后加入一抗、二抗孵育，显色发光，胶片曝光、显影和定影，以计算机行图像分析。 
实施例3FA-Ad5-ERβ-UCNP介导ERβ基因靶向诊断和治疗ERα阴性乳腺癌 
将MDA-MB-231乳腺癌细胞接种于裸鼠腋窝皮下，建立人乳腺癌细胞移植瘤裸鼠模型。接种细胞后10天左右肿瘤长至50～100mm3时，以PBS为空白对照，Ad5-ERβ-UCNP为无叶酸对照组，FA-Ad5-UCNP为空载体对照组，FA-Ad5-ERβ-UCNP为实验组。尾静脉注射重组腺病毒，通过上转换荧光在体成像系统实时在位监测上转换荧光信号以考察FA-Ad5-ERβ-UCNP对MDA-MB-231细胞的转染效率。不断优化给药方案，提高肿瘤感染效率。同时，利用该系统实时在位跟踪考察FA-Ad5-ERβ-UCNP对肿瘤的靶向作用以及肿瘤的生长状态。并进一步用药理学和细胞生物学以及免疫组化等常规方法考察肿瘤微血管密度、细胞周期、细胞凋亡、以及与之相关的基因表达，以探索其抑瘤机制。 
具体实验方法： 
A.上转换荧光在体成像系统实时在位监测重组腺病毒感染效率和范围，以研究其量效关系并实时评估疗效，探索最佳给药方案，提高治疗效果并考察其安全性。 
B.给治疗前后肿瘤不同生长期的裸鼠呼氧混合气体（Carbogen:95%的氧、5%二氧化碳），用本实验室配备的近红外血氧饱和仪（Oximeter,illinois university）测量肿瘤的血氧随氧刺激的变化，并与后续检测的肿瘤大小、ERβ表达水平、血管密度、细胞周期等进行比较，优化ERα阴性乳腺癌治疗预后参数。 
C.采用游标卡尺量取记录皮下瘤的长径(a)、短径(b)，按公式计算瘤体体积：(V=a×b2/2)，绘制肿瘤生长曲线，以考察其治疗效果。 
D.治疗5周后断颈处死裸鼠，进行解剖并用上转换荧光在体成像系统检测重组腺病毒在体内各组织的感染情况通过荧光显微镜检测转染效率，考察给药剂量与感染效率、抑瘤效果等的关系。剥取肿瘤称瘤重，考察治疗效果。 
E.采用TdT介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）原位检测细胞凋亡。通过免疫组化方法检测肿瘤组织的微血管密度及细胞周期、细胞凋亡、血管发生相关基因的表达，以探索ERβ体内抑瘤机制。 
F.取心、肝、肾等重要器官与肿瘤组织一起通过组织切片和HE染色进行常规病理学检查，初步探讨该治疗方案的安全性。 

Claims (5)

1.一种包含ERβ的重组病毒的改造方法，其特征在于，对重组腺病毒进行叶酸修饰，形成叶酸-重组腺病毒，用溶剂热法合成OA-UCNP（NaYF4:Yb,Tm）后，采用聚丙烯酸(PAA)进行配体交换反应，对共掺杂了Yb,Tm的NaYF4纳米晶体粒子进行了有效的表面修饰，形成上转换荧光纳米探针（PAA-UCNPs）；利用PAA上的羧基和叶酸修饰的重组腺病毒（FA-Ad5-ERβ）上的氨基进行反应，构建激发和发射均在近红外区的上转换纳米荧光粒子标记的靶向基因治疗药物FA-Ad5-ERβ-UCNP。
2.根据权利要求1所述的包含ERβ的重组病毒的改造方法，其特征在于，重组腺病毒包括腺病毒载体及如下的基因构建体
1)人ERβ基因，或其简并性序列；和
2）人ERβ基因功能性片段ERβ-DBDmut或其简并性序列的嵌合基因。
3.权利要求1或2中上转换纳米荧光粒子标记的靶向基因治疗药物FA-Ad5-ERβ-UCNP的应用，其特征在于，用于制备针对哺乳动物肿瘤疾病的靶向基因治疗药物的疫苗。
4.根据权利要求3所述上转换纳米荧光粒子标记的靶向基因治疗药物FA-Ad5-ERβ-UCNP的应用，其特征在于，其中所述哺乳动物是人。
5.根据权利要求3所述的上转换纳米荧光粒子标记的靶向基因治疗药物FA-Ad5-ERβ-UCNP的应用，其特征在于，其中所述肿瘤类型为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及结直肠癌。
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