CN103616383A - 食品批量发酵过程中菌群结构稳定性的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食品批量发酵过程中菌群结构稳定性的定量检测方法，包括以下步骤：采集对照菌群的高光谱图像；理化检测对照菌群结构；建立菌落种属鉴别模型；采集待测菌群的高光谱图像；快速检测待测菌群结构；定量检测待测菌群稳定性。根据对照菌群对应的各单菌落的高光谱图像信息X，以及采用理化检测方法鉴定得到的对照菌群对应的各单菌落的种属信息Y，通过化学计量学方法得到单菌落的种属鉴别模型Y=F _种属 (X)。通过获取待测菌群对应的各单菌落的高光谱图像信息X’，将其代入单菌落的种属鉴别模型Y=F _种属 (X)即可计算出待测菌群的结构及稳定性。本发明提出的方案具有检测过程简单、检测周期短的特点。

Description

食品批量发酵过程中菌群结构稳定性的定量检测方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种利用高光谱图像技术检测食品批量发酵过程中菌群结构及稳定性的方法。

背景技术

发酵食品是人类利用有益微生物与原料的相互作用而生产的一类食品，常见的发酵食品主要有谷物发酵制品、豆类发酵制品和乳类发酵制品。在食品发酵过程中，微生物菌群利用发酵原料(基质)中的营养并产生特定的代谢产物，而微生物菌群的代谢产物直接决定了发酵食品的营养、风味、口感及安全性。由于微生物菌群极易受到污染，因此在食品批量发酵过程中定量检测菌群结构及其稳定性对确保发酵食品的质量与安全至关重要。

现有的微生物菌群检测方法主要有基于菌落形态特征的检测方法、基于菌悬液光谱特征的检测方法和基于微生物分子生物学特征的检测方法三大类。基于菌落形态特征检测菌群结构的相关专利有“微生物菌群结构的快速定性与定量方法及其在中国白酒生产中的应用”(申请号：201210455542.9)；该方法分别利用酵母、细菌、霉菌的鉴别培养基分离微生物菌群中的酵母、细菌和霉菌，然后根据酵母、细菌和霉菌在各自的鉴别培养基上的形态特征来鉴别微生物的种属，从而得到微生物菌群的结构。该方法仅给出了若干种微生物的一幅菌落形态特征图，有的菌落形态特征图非常相似，加上缺乏具体的形态特征参数对菌落的形态特征进行描述，所以该方法难以应用于微生物菌群结构及稳定性的定量检测。

基于菌悬液光谱特征检测微生物菌群的相关专利有“大肠菌群近红外光谱快速检测技术”(申请号：200610048468.3)；该方法首先取一定体积的液体试样置于50ml的烧杯，用红外光谱仪获取试样的光谱特征并对其中的大肠菌群进行分析。由于该方法利用红外光谱仪获取的是试样液体中所有成分的光谱信息，表征的主要是溶液中蛋白质、脂肪等生物分子的特征，难以对试样溶液内大肠菌群的结构及稳定性进行检测。

基于微生物分子生物学特征检测微生物菌群的相关专利有“一种快捷有效的窖泥古菌群分析方法”(申请号：201210435362.4)、“一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法”(申请号：201210065532.4)等。该类方法主要利用分子生物学技术获取微生物菌群的DNA信息，利用不同种属的微生物对应的DNA信息不同的特点，对微生物的菌群进行检测。该方法能够准确的鉴别出微生物菌群中微生物的种属，但是难以检测某一种属微生物的具体数量；同时微生物菌群DNA信息的检测过程非常复杂、所需的仪器和试剂均比较昂贵，所以分子生物学方法也难以快速定量检测批量发酵过程中菌群结构及其稳定性。

鉴于此，本发明提出一种食品批量发酵过程中菌群结构及稳定性的定量检测方法以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供食品批量发酵过程中菌群结构及稳定性的定量检测方法，以实现微生物菌群结构及稳定性的定量检测。

为了解决以上技术问题，本发明利用高光谱图像技术以定量检测食品批量发酵过程中菌群的结构及稳定性。利用不同种属的微生物对应的高光谱图像信息不同，通过表征菌群中各种属微生物的高光谱图像信息的差异，定量检测菌群的结构；通过比较不同发酵批次中菌群的结构差异，定量检测食品批量发酵过程中菌群结构的稳定性。具体技术方案如下：

食品批量发酵过程中菌群结构稳定性的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，采集对照菌群的高光谱图像；

步骤二，理化检测对照菌群结构；

步骤三，建立菌落种属鉴别模型；

步骤四，采集待测菌群的高光谱图像；

步骤五，快速检测待测菌群结构；

步骤六，定量检测待测菌群稳定性。

所述步骤一采集对照菌群的高光谱图像过程如下：

过程一，配制培养对照菌群所需的培养基，并置于培养皿中；

过程二，将对照菌群接种于所述培养基上，置于37±1℃的培养箱中培养24h～48h，得到对照菌群中各种属微生物的单菌落；

过程三，将所述培养皿置于高光谱成像系统中进行高光谱图像采集，得到对照菌群中各单菌落的高光谱图像信息。

所述步骤二中理化检测对照菌群结构的过程如下：

过程一，针对步骤一中培养皿中的对照菌群的单菌落，培养皿中共有n个单菌落，对培养皿内的n个单菌落逐一进行编号；n大于等于1；

过程二，按照所述编号的顺序采用理化检测方法逐一鉴定各单菌落的种属名称，鉴别出步骤一中培养皿上n个单菌落的种属名称记为Y_0i，i=1,2,……n。

所述步骤三中建立单菌落的种属的鉴别模型过程如下：

过程一，对步骤一中得到的对照菌群中n个单菌落的高光谱图像信息，按照步骤二过程一中的编号规则对高光谱图像中的单菌落进行编号，并使得菌落的编号顺序与步骤二中过程一的编号完全一致；

过程二，对步骤一中得到的对照菌群中n个单菌落的高光谱图像信息，按照编号顺序分别提取高光谱图像中各单菌落所在区域内的平均光谱X_i，i=1,2,……,n；

过程三，以各单菌落的平均光谱作为自变量X_i，以步骤二中各单菌落的种属名称作为因变量Y_0i，利用化学计量学方法确定平均光谱与单菌落的种属之间的对应关系F_种属，得到单菌落的种属鉴别模型Y=F_种属(X)。

所述步骤四采集待测菌群的高光谱图像的过程如下：

过程一，配制与步骤一中配方完全一致的培养基并置于培养皿中；

过程二，将待测菌群接种于培养基上，置于37±1℃的培养箱中培养24h～48h，培养时间与步骤一中过程二的培养时间完全一致，得到待测菌群对应的m个单菌落；m大于等于1；

过程三，将培养皿置于高光谱成像系统中进行高光谱图像采集，得到待测菌群对应的高光谱图像信息。

所述步骤五中快速检测待测菌群结构的过程如下：

过程一，针对步骤四得到的待测菌群对应的高光谱图像信息，逐一提取高光谱图像中m个菌落所在区域内的平均光谱X’_i,i=1,2,……,m；

过程二，将提取到的各菌落的平均光谱X’_i代入步骤三中建立的单菌落的种属鉴别模型Y=F_种属(X)，得到待测菌群中各单菌落的种属名称Y_0i’，即Y_0i’=F_种属(X’_i)；

过程三，根据各单菌落的种属名称Y_0i’,i=1,2,……,m，将Y_0i’中种属名称相同的单菌落归为一类，从而得到待测菌落中微生物的种类数；计算每一类微生物的单菌落占总菌落数的比例，从而得到每一类微生物在待测菌群中占的比例；待测菌落中微生物的种类数和各类微生物在待测菌群中占的比例即为待测菌群的结构信息。

所述步骤六中定量检测待测菌群稳定性的过程如下：

过程一，取食品N发酵批次中的菌群作为待测菌群，执行步骤四和步骤五，得到N发酵批次中的菌群作为待测菌群的结构Y_1i’、Y_2i’、……、Y_N-1i’、Y_Ni’；N大于等于2,i=1,2,……,m；

过程二，根据不同发酵批次中的菌群作为待测菌群的结构信息，以对照菌群的结构信息为标准，计算上述待测菌群在微生物种属和数量上的增减情况，进而实现食品批量发酵过程中菌群稳定性的定量检测。

本发明具有有益效果：高光谱图像技术在样品信息的获取方面具有独特的优势，不仅能获取待测样品整个表面区域的图像信息，又能获取样品表面不同区域的光谱信息。本发明将微生物菌群接种于培养基上获得其单菌落，利用高光谱图像技术同时获取培养皿内所有菌落的高光谱图像信息，提取各单菌落所在区域内的平均光谱代入已建立的菌落种属鉴别模型，即可快速的鉴别各菌落的种属名称，从而计算出食品批量发酵过程中菌群的结构及其稳定性。虽然在建立菌落种属鉴别模型的过程中需要采用理化方法鉴别菌落的种属名称，但是在菌落种属鉴别模型建立好了以后，仅需要获取待测菌落的高光谱图像信息结合菌落种属鉴别模型即可快速的计算出菌落的种属名称。因此，本发明提出利用高光谱图像技术以定量检测食品批量发酵过程中菌群结构及稳定性方案具有检测过程简单、检测周期短的特点。

附图说明

图1为本发明的方法流程图。

具体实施方式

以下将结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。

以定量检测香醋固态发酵过程中菌群的结构及稳定性为例子，详细阐述本发明的具体实施方式。

所述一种利用高光谱图像技术定量检测香醋固态发酵过程中菌群结构及稳定性的方法包括以下六个步骤：

步骤一，对照菌群的高光谱图像采集；

步骤二，对照菌群结构的理化检测；

步骤三，菌落种属鉴别模型的建立；

步骤四，待测菌群的高光谱图像采集；

步骤五，待测菌群结构的快速检测；

步骤六，待测菌群稳定性的定量检测；

所述步骤一对照菌群的高光谱图像采集包括以下过程：

过程一，配制培养对照菌群所需的培养基，培养基的具体配方为葡萄糖1%，酵母膏1%，蛋白胨0.3%，琼脂2%，无水乙醇6%；将配制好的培养基置于5个培养皿中；

过程二，为了让对照菌群具有很好的代表性，在发酵产物质量好的情况下分3次取发酵基质中的菌群作为对照菌群，并接种于培养基上，置于37℃的培养箱中培养48h，得到对照菌群中各种属微生物的单菌落，共60个；

过程三，将培养皿置于高光谱成像系统中进行高光谱图像采集，得到对照菌群中各单菌落的高光谱图像信息；

所述步骤二对照菌群结构的理化检测包括以下过程：

过程一，针对步骤一培养皿中的对照菌群单菌落，培养皿中共有60个单菌落，对培养皿内的60个单菌落逐一进行编号；

过程二，采用DNA序列测序技术，按照编号逐一鉴定各单菌落的种属名称，鉴别出步骤一中培养皿上60个单菌落来源于5个属，分别为醋酸菌属、乳酸菌属、酵母菌属、芽孢杆菌属和霉菌属；

所述步骤三菌落种属鉴别模型的建立包括以下过程：

过程一，对步骤一中得到的对照菌群中60个单菌落的高光谱图像信息，按照步骤二过程一中的编号规则对高光谱图像中的单菌落进行编号，并使得菌落的编号顺序与步骤二中过程一的编号完全一致；

过程二，对步骤一中得到的对照菌群中60个单菌落的高光谱图像信息，按照编号顺序分别提取高光谱图像中各单菌落所在区域内的平均光谱X_i(i=1,2,……,60)；

过程三，以各单菌落的平均光谱作为自变量X_i(i=1,2,……,60)，以步骤二中各单菌落的种属名称作为因变量Y_0i(i=1,2,……,60)，Y_0i的取值为1、2、3、4、和5；Y_0i的值为1时表示菌落的名称为醋酸菌属；Y_0i的值为2时表示菌落的名称为乳酸菌属；Y_0i的值为3时表示菌落的名称为酵母菌属；Y_0i的值为4时表示菌落的名称为芽孢杆菌属；Y_0i的值为5时表示菌落的名称为霉菌属；利用化学计量学方法确定平均光谱与单菌落的种属之间的对应关系F_种属，得到单菌落的种属的鉴别模型Y=F_种属(X)；

所述步骤四待测菌群的高光谱图像采集包括以下过程：

过程一，配制与步骤一中配方完全一致的培养基并置于培养皿中；

过程二，将待测菌群接种于培养基上，置于37℃的培养箱中培养48h，得到待测菌群对应的40个单菌落；

过程三，将培养皿置于高光谱成像系统中进行高光谱图像采集，得到待测菌群对应的高光谱图像信息；

所述步骤五待测菌群结构的快速检测包括以下过程：

过程一，针对步骤四得到的待测菌群对应的高光谱图像信息，逐一提取高光谱图像中40个菌落所在区域内的平均光谱X’_i(i=1,2,……,40)；

过程二，将提取到的各菌落的平均光谱X’_i(i=1,2,……,40)代入步骤三中建立的单菌落的种属鉴别模型Y=F_种属(X)，得到待测菌群中各单菌落的种属名称Y_i’，即Y_0i’=F_种属(X’_i)，(i=1,2,……,40)；

过程三，根据各单菌落的种属名称Y_0i’(i=1,2,……,40)，将Y_0i’中种属名称相同的单菌落归为一类，从而得到待测菌落中微生物的种类数为5，分别为醋酸菌属、乳酸菌属、酵母菌属、芽孢杆菌属和霉菌属；其中15个菌落为醋酸菌属、12个菌落为乳酸菌属、7个菌落为酵母菌属、5个菌落为芽孢杆菌属、1个菌落为霉菌属；得到待测菌群的结构信息醋酸菌属占37.5%、乳酸菌属占30%、酵母菌属占17.5%、芽孢杆菌属占12.5%、霉菌属占2.5%。

所述步骤六待测菌群稳定性的定量检测包括以下过程：

过程一，取食醋3发酵批次中的菌群作为待测菌群，执行步骤四和步骤五，得到食醋3发酵批次中菌群的结构Y_1i’(i=1,2,……,j)、Y_2i’(i=1,2,……,k)、Y_3i’(i=1,2,……,h)，其中j、k、h为食醋3发酵批次中菌群的单菌落数；得到食醋3发酵批次中菌群的结构信息如表1所示。

表1食醋3发酵批次的菌群结构

批次	醋酸菌属	乳酸菌属	酵母菌属	芽孢杆菌属	霉菌属
						第1批次Y1i’	40%	35%	12.5%	10%	2.5%
第2批次Y2i’	37.5%	32.5%	20%	5%	5%
						第3批次Y3i’	35%	35%	17.5%	10%	2.5%

过程二，比较上述3批次菌群结构与对照菌群Y_0i在种类数和所占比例方面的差异，结果如表2所示。

表2食醋3发酵批次的菌群结构与对照菌群的差异

批次	醋酸菌属	乳酸菌属	酵母菌属	芽孢杆菌属	霉菌属
						第1批次Y1i’	+2.5%	+2.5%	-2.5%	-2.5%	0%
第2批次Y2i’	0%	+2.5%	+2.5%	-7.5%	+2.5%
						第3批次Y3i’	-2.5%	+5%	0%	-2.5%	0%

表格2中，值为0%表示与对照菌群相比较，待测菌群中对应的微生物比例没有变化；值为+x%表示与对照菌群相比较，待测菌群中对应的微生物比例增加了x%；值为-x%表示与对照菌群相比较，待测菌群中对应的微生物比例减少了了x%。根据待测菌群的结构信息可为食醋的发酵过程提供参考，如表格2中第2批次发酵过程中，霉菌的比例与对照组相比增加了2.5%，这说明发酵过程中使用的辅料即麸皮或麦麸有发霉的现象，应该对变质的辅料进行替换以保障最终发酵成品的质量。

Claims (7)

1.食品批量发酵过程中菌群结构稳定性的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，采集对照菌群的高光谱图像；

步骤二，理化检测对照菌群结构；

步骤三，建立菌落种属鉴别模型；

步骤四，采集待测菌群的高光谱图像；

步骤五，快速检测待测菌群结构；

步骤六，定量检测待测菌群稳定性。

2.如权利要求1所述的食品批量发酵过程中菌群结构稳定性的定量检测方法，其特征在于所述步骤一采集对照菌群的高光谱图像过程如下：

过程一，配制培养对照菌群所需的培养基，并置于培养皿中；

过程二，将对照菌群接种于所述培养基上，置于37±1℃的培养箱中培养24h~48h，得到对照菌群中各种属微生物的单菌落；

过程三，将所述培养皿置于高光谱成像系统中进行高光谱图像采集，得到对照菌群中各单菌落的高光谱图像信息。

3.如权利要求1所述的食品批量发酵过程中菌群结构稳定性的定量检测方法，其特征在于所述步骤二中理化检测对照菌群结构的过程如下：

过程一，针对步骤一中培养皿中的对照菌群的单菌落，培养皿中共有n个单菌落，对培养皿内的n个单菌落逐一进行编号；n大于等于1；

过程二，按照所述编号的顺序采用理化检测方法逐一鉴定各单菌落的种属名称，鉴别出步骤一中培养皿上n个单菌落的种属名称记为Y _0i  ，i=1, 2,……n。

4.如权利要求1所述的食品批量发酵过程中菌群结构稳定性的定量检测方法，其特征在于所述步骤三中建立单菌落的种属的鉴别模型过程如下：

过程一，对步骤一中得到的对照菌群中n个单菌落的高光谱图像信息，按照步骤二过程一中的编号规则对高光谱图像中的单菌落进行编号，并使得菌落的编号顺序与步骤二中过程一的编号完全一致；

过程二，对步骤一中得到的对照菌群中n个单菌落的高光谱图像信息，按照编号顺序分别提取高光谱图像中各单菌落所在区域内的平均光谱X_i，i=1, 2, ……, n；

过程三，以各单菌落的平均光谱作为自变量X_i，以步骤二中各单菌落的种属名称作为因变量Y _0i ，利用化学计量学方法确定平均光谱与单菌落的种属之间的对应关系F _种属，得到单菌落的种属鉴别模型Y=F _种属 (X)。

5.如权利要求1所述的食品批量发酵过程中菌群结构稳定性的定量检测方法，其特征在于所述步骤四采集待测菌群的高光谱图像的过程如下：

过程一，配制与步骤一中配方完全一致的培养基并置于培养皿中；

过程二，将待测菌群接种于培养基上，置于37±1℃的培养箱中培养24h~48h，培养时间与步骤一中过程二的培养时间完全一致，得到待测菌群对应的m个单菌落；m大于等于1；

过程三，将培养皿置于高光谱成像系统中进行高光谱图像采集，得到待测菌群对应的高光谱图像信息。

6.如权利要求1所述的食品批量发酵过程中菌群结构稳定性的定量检测方法，其特征在于所述步骤五中快速检测待测菌群结构的过程如下：

过程一，针对步骤四得到的待测菌群对应的高光谱图像信息，逐一提取高光谱图像中m个菌落所在区域内的平均光谱X’_i, i=1, 2, ……, m；

过程二，将提取到的各菌落的平均光谱X’_i代入步骤三中建立的单菌落的种属鉴别模型Y=F _种属 (X)，得到待测菌群中各单菌落的种属名称Y_0i ’，即Y_0i ’= F _种属(X’_i)；

过程三，根据各单菌落的种属名称Y_0i ’, i=1, 2, ……, m ，将Y_0i ’中种属名称相同的单菌落归为一类，从而得到待测菌落中微生物的种类数；计算每一类微生物的单菌落占总菌落数的比例，从而得到每一类微生物在待测菌群中占的比例；待测菌落中微生物的种类数和各类微生物在待测菌群中占的比例即为待测菌群的结构信息。

7.如权利要求1所述的食品批量发酵过程中菌群结构稳定性的定量检测方法，其特征在于所述步骤六中定量检测待测菌群稳定性的过程如下：

过程一，取食品N发酵批次中的菌群作为待测菌群，执行步骤四和步骤五，得到N发酵批次中的菌群作为待测菌群的结构Y_1i ’、Y_2i ’、……、Y_N-1i ’、Y_Ni ’； N大于等于2, i=1, 2, ……, m；

过程二，根据不同发酵批次中的菌群作为待测菌群的结构信息，以对照菌群的结构信息为标准，计算上述待测菌群在微生物种属和数量上的增减情况，进而实现食品批量发酵过程中菌群稳定性的定量检测。

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