CN103614360B

CN103614360B - 一种复合型包埋剂固定用于抑制藻类的光合细菌的固定方法

Info

Publication number: CN103614360B
Application number: CN201310576832.3A
Authority: CN
Inventors: 吴珊; 任丽艳; 厉智成
Original assignee: Beijing University of Technology
Current assignee: Beijing University of Technology
Priority date: 2013-11-18
Filing date: 2013-11-18
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2033-11-18
Also published as: CN103614360A

Abstract

一种复合型包埋剂固定用于抑制藻类的光合细菌的固定方法，属于水处理和微生物固定化技术领域。选择海藻酸钠为包埋剂，沸石和碳酸钙为添加剂，氯化钙的饱和硼酸溶液为交联剂，固定化温度为4℃，固定化1h后，通过调节pH进行二次交联24h后成球洗涤备用；同时本发明公开了其抑制富营养化水体中藻类的应用。本发明所提出的固定化方法适应了光合细菌的生理特性，能使其维持良好的生理活性；提供的最佳包埋比例使颗粒的密度、机械强度、含水率、传质性、细胞活性和膨胀性都能维持在良好的水平；其制作工艺简单，成本低，易于大范围推广；其抑藻效果显著优于游离光合细菌，不产生二次污染，为富营养化的治理提供一条有效的途径。

Description

一种复合型包埋剂固定用于抑制藻类的光合细菌的固定方法

技术领域

本发明属于水处理和微生物固定化技术领域，具体地涉及一种复合型包埋剂及固定化光合细菌的方法及其对富营养化水体常见藻类的抑制作用。

背景技术

随着城市化水平和工业化程度的提高，水资源短缺和水污染日益加重，再生水已经成为很多缺水城市稳定的第二水源。在再生水的利用中，作为补给景观水体的生态用水是其最主要的应用范围之一。而由于再生水水质特殊的物理化学性质，在使用过程中比天然水体更容易引起水体由于藻类过度繁殖导致的富营养化问题。

常见水体藻类控制技术可分为：物理方法、物理化学法、化学方法和生物方法。这些方法都在不同程度上存在费用高，不易控制等缺点。近年来，通过向水体中投加微生物，利用菌藻相互影响来控制藻类的过度繁殖的绿色控藻技术开始受到关注，其中光合细菌(PSB)是最常使用的。光合细菌适应性强，它既不像好氧活性污泥菌胶团细菌那样受污水中氧浓度的限制，因其可以利用光能进行高效的能量代谢，即使在微弱的光照条件下也能进行，其中有机物作为供氢体被利用；又不像严格厌氧的甲烷细菌那样对氧的存在高度敏感，可以在有氧条件下分解有机物，通过氧化磷酸化取得能量供其生长。因此，光合细菌在抑藻、水产养殖、有机废水处理等方面具有其它微生物无法替代的优势。

目前，光合细菌主要以游离细胞的形式被应用。而游离细胞在流水条件下易被水流冲走,在静水条件下易被其他生物所食用，并且缺乏吸附和生长繁殖的载体时其难以稳定地长期发挥功能。固定化微生物技术的兴起为其应用增添了新的活力。固定化微生物是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域内，增大微生物密度并使其保持活性的方法，能够避免微生物流失,提高稳定性、耐毒害和抗冲击能力等，被广泛应用。目前采用的固定化方法主要有：吸附法、包埋法、交联法和共价结合法，其中包埋法具有操作简单,对细胞活性影响较小,效率高等特点,是细胞固定化研究和应用最广泛的方法。常用的包埋材料有：琼脂、海藻酸钠、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等。海藻酸铵固定化的细胞制备过程简便，不粘连，传质性能较好，但强度较低；海藻酸钠和聚乙烯醇联合固定化方法研究较多，但是制备过程中有较严重的粘连现象且水溶膨胀性严重，不利于应用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有固定化方法的不足，寻找一种专门用于控藻技术的光合细菌复合型固定化方法，以海藻酸钠为包埋剂，通过添加剂对固定化光合细菌进行改性，使固定化光合细菌的密度、机械强度、含水率、传质性、细胞活性和膨胀性都能维持在良好的水平，固定化后的光合细菌投加到水中以后，通过菌藻互作机理抑制藻类生长，为水体富营养化的治理提供一条新的途径。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：以海藻酸钠为包埋剂，沸石和碳酸钙为添加剂，用含有氯化钙的饱和硼酸为交联剂，在最佳包埋比例、交联时间、温度的条件下，将光合细菌进行固定化，进而进行抑藻。

一种复合型包埋剂用于光合细菌的固定方法，具体包括以下步骤：

（1）光合细菌浓缩液的制备：将光合细菌培养至对数期，使得OD₆₈₀值为1.5-1.8，将光合细菌悬液在8000-10000r·min^-1转速下离心8-12min，用生理盐水洗净沉淀后再离心，如此重复3次，用生理盐水配成OD₆₈₀为2.3-2.6的浓缩液；

（2）包埋剂的配制：将海藻酸钠溶于60-80℃水，制备成2-3g/ml（优选2.4g/ml）的海藻酸钠水溶解后，加入沸石和碳酸钙，其中沸石为1-2g/ml，碳酸钙1-2g/ml，搅拌混合均匀，制成混合包埋剂；

（3）交联剂的配制：将氯化钙溶解于饱和硼酸溶液中，于4℃冰箱中冷却备用，其中氯化钙2-4g/ml饱和硼酸；

（4）一次交联：待步骤（2）所制混合包埋剂冷却至35℃-40℃，与步骤（1）所制的光合细菌浓缩液以5:1(最佳包埋比)的体积比混合制成菌胶混合液，放入35℃-40℃恒温水浴中，通过蠕动泵压力传送到12号针头的造粒器中，通过调节流速，制成直径为3-5mm的颗粒，从10cm高处滴入步骤（3）的氯化钙的饱和硼酸溶液中，在4℃冰箱中固定1h后；

（5）二次交联：，用氢氧化钠溶液将一次交联后的交溶液pH值调到8-9再继续在4℃冰箱中固定化20-24h；

（6）洗涤：收获的颗粒用无菌水洗涤，保存在0.85%生理盐水中。

将上述制备的固定化光合细菌用于抑藻。

抑藻实验：将扩大培养10d后的藻液混匀后分装入500mL的三角瓶中，每瓶装200-300mL的等浓度藻液，加入9-36g步骤（6）得到的固定化光合细菌，以不加光合细菌和相同菌量的游离光合细菌作为对照，摇匀后培养于光照培养箱中，培养条件为（25±1）℃，光暗比为12L:12D，光照强度为2000lux。每天定时摇动2～3次，随机改变三角瓶的位置。抑藻效果相对抑制率表示，根据藻细胞密度计算。藻类的相对抑制率计算公式如下：

IR（%）=(1－N/N₀)×100

其中，IR为相对抑制率，N为加入光合细菌实验组的藻细胞密度（cell·mL^-1），N₀为对照组藻密度（cell·mL^-1）。

本发明与现有技术相比显著优点是：

1.本发明固定化方法中，以海藻酸钠为主剂，同时加入沸石和碳酸钙2种辅剂制成复合型包埋剂。该复合包埋剂由于利用了2中辅剂特性，成球过程中不粘连，分散了海藻酸钠的粘度，不易产生气泡，增加了包埋体密度，且操作简便；

2.沸石颗粒表面凹凸不平，具有很多大小均匀的孔穴，且内部有碱金属和碱土金属的含水铝硅酸盐类，有利于离子进入颗粒内部提供细菌生长；

3.碳酸钙的加入一方面可以增加固定化光合细菌的通透性、细胞活性、颗粒的比重，另一方面碳酸钙的加入使颗粒内部微环境变为微碱性，有利于光合细菌生长；

4.碳酸钙的加入相对增加了钙离子的浓度，加大了海藻酸钠与钙离子螯合作用，增加了固定化光合细菌的机械强度；

5.本发明处理方法通过二次交联，减少硼酸对光合细菌的毒性作用；

6.本发明处理方法中采用的固定化光合细菌方法不含有害物质，不会对水体造成二次污染；

7.本发明利用的原料来源丰富，生产工艺简单，容易加工，价格低廉，易于大范围推广；

8.本发明所制成的固定化光合细菌包埋体用于抑制藻类生长可以克服传统投加游离态光合细菌的弱点，数量稳定，在静水条件下不易被其他生物所吞噬，且增加了吸附和生长繁殖的载体有助于其稳定地长期发挥功效。

同时本发明公开了其抑制富营养化水体中藻类的应用。本发明所提出的固定化方法适应了光合细菌的生理特性，能使其维持良好的生理活性；提供的最佳包埋比例使颗粒的密度、机械强度、含水率、传质性、细胞活性和膨胀性都能维持在良好的水平；其制作工艺简单，成本低，易于大范围推广；其抑藻效果显著优于游离光合细菌，不产生二次污染，为富营养化的治理提供一条有效的途径。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步描述本发明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

（1）光合细菌浓缩液的制备：将光合细菌培养至对数期（OD₆₈₀值为1.5-1.8），将光合细菌悬液在8000-10000r·min^-1转速下离心8-12min，用生理盐水洗净沉淀后再离心，如此重复3次。用生理盐水配成OD₆₈₀为2.3-2.6的浓缩液；

（2）包埋剂的配制：将7.0-7.5（g）（最佳量7.2g）海藻酸钠用300mL温度为60-80℃蒸馏水溶解后，分别加入3-3.5（g）（最佳量3.2g）的沸石和碳酸钙，搅拌混合均匀，制成混合包埋剂；

（3）交联剂的配制：将12g（最佳量）的氯化钙溶解于600mL（最佳体积）饱和硼酸溶液中，于4℃冰箱中冷却备用；

（4）一次交联：待步骤（2）所制混合包埋剂冷却至35-40℃，与步骤（1）所制的光合细菌浓缩液以5:1（最佳包埋比）的体积比混合制成菌胶混合液，放入40℃恒温水浴锅中，通过蠕动泵压力传送到12号针头的造粒器中，通过调节流速，制成直径为3-5mm的颗粒，从10cm高处滴入交联剂中，在4℃冰箱中固定1h后；

（5）二次交联：一次交联后，用氢氧化钠溶液将交联剂pH值调到8-9再继续在4℃冰箱中固定化20-24（h）；

（6）洗涤：收获的颗粒用无菌水洗涤，保存在0.85%生理盐水中

（7）抑藻实验：

以铜绿微囊藻为受试藻种：将扩大培养10d的铜绿微囊藻混匀后分装入500mL的三角瓶中，每瓶装250mL的等浓度藻液（初始藻细胞浓度为8.0×10⁵cell·mL^-1），分别加入9、18、27、36g固定化后的光合细菌载体，以不加光合细菌和相同菌量的游离光合细菌作为对照，摇匀后培养于光照培养箱中，培养条件为（25±1）℃，光暗比为12L:12D，光照强度为2000lux。每天定时摇动2～3次，随机改变三角瓶的位置。抑藻效果由藻液浓度表示，本发明结果表明，试验12天后，游离光合细菌对铜绿微囊藻抑制率为26.81%，不同投加量的固定化后的光合细菌的抑制率分别为55.38%（9g）、83.55%（18g）、89.37%（27g）、89.77%（36g）。综合考虑技术需求和经济性，9g固定化光合菌颗粒的投加量为最优，即36g·L^-1。

以蛋白核小球藻为受试藻种：将扩大培养10d的铜绿微囊藻混匀后分装入500mL的三角瓶中，每瓶装250mL的等浓度藻液（初始藻细胞浓度为8.0×105cell·mL^-1），分别加入9、18、27、36（g）固定化光合细菌，以不加光合细菌和相同菌量的游离光合细菌作为对照，摇匀后培养于光照培养箱中，培养条件为（25±1）℃，光暗比为12L:12D，光照强度为2000lux。每天定时摇动2～3次，随机改变三角瓶的位置。抑藻效果由藻液浓度表示，本发明结果表明，试验12天后，游离光合细菌对蛋白核小球藻的抑制率为13.53%，固定化光合细菌对其的抑制率分别为25.62%（9g）、35.54%（18g）、59.5%（27g）、57.02%（36g）。综合考虑技术需求和经济性，投加27（g）固定化后的光合菌颗粒为最优，即108g·L^-1。

Claims

1.一种复合型包埋剂用于光合细菌的固定方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)光合细菌浓缩液的制备：将光合细菌培养至对数期，使得OD₆₈₀值为1.5-1.8，将光合细菌悬液在8000-10000r·min^-1转速下离心8-12min，用生理盐水洗净沉淀后再离心，如此重复3次，用生理盐水配成OD₆₈₀为2.3-2.6的浓缩液；

(2)包埋剂的配制：将海藻酸钠溶于60-80℃水，制备成海藻酸钠水溶解后，加入沸石和碳酸钙，制成混合包埋剂，其中7.0-7.5g海藻酸钠用300mL温度为60-80℃蒸馏水溶解后，分别加入3-3.5g的沸石和碳酸钙；

(3)交联剂的配制：将氯化钙溶解于饱和硼酸溶液中，于4℃冰箱中冷却备用，其中12g的氯化钙溶解于600mL饱和硼酸溶液中；

(4)一次交联：待步骤(2)所制混合包埋剂冷却至35℃-40℃，与步骤(1)所制的光合细菌浓缩液以5:1的体积比混合制成菌胶混合液，放入35℃-40℃恒温水浴中，通过蠕动泵压力传送到12号针头的造粒器中，通过调节流速，制成直径为3-5mm的颗粒，从10cm高处滴入步骤(3)的氯化钙的饱和硼酸溶液中，在4℃冰箱中固定1h后；

(5)二次交联：用氢氧化钠溶液将一次交联后的交溶液pH值调到8-9再继续在4℃冰箱中固定化20-24h；

(6)洗涤：收获的颗粒用无菌水洗涤，保存在0.85％生理盐水中。

2.按照权利要求1的方法制备得到的固定化光合细菌。

3.按照权利要求1的方法制备得到的固定化光合细菌用于抑藻。