CN103609529A - 一种评价生物蛋白对绿盲蝽影响的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种评价生物蛋白对绿盲蝽影响的方法，包括：1）将待测生物蛋白稀释成不同浓度，与绿盲蝽人工饲料混合，制得生物蛋白测定饲料，并以不添加生物蛋白的饲料组作为对照；2）用拉伸的封口膜分别包裹测定饲料和对照饲料，制成胶囊；3）将胶囊粘在无盖饲育盒的侧壁上，4）在饲育盒中接入绿盲蝽若虫，用纱布封口，进行培养；5）从第0天开始记录绿盲蝽的死亡情况或体重变化，从而评价生物蛋白对绿盲蝽的影响。本方法适用范围广，对具有胃毒、内吸作用的药剂及溶于人工饲料的化学物质均能够有效测定，解决了包括绿盲蝽在内的刺吸式口器昆虫难于直接接触不同浓度的生物蛋白等问题，能准确测定生物蛋白对绿盲蝽的影响，具有很强的实用性。

Description

一种评价生物蛋白对绿盲蝽影响的方法

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体地说，涉及一种评价生物蛋白对绿盲蝽影响的方法。

背景技术

盲蝽蟓是一类重要的农业害虫，在我国主要有绿盲蝽（Apolyguslucorum Meyer-Dür）、中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis Jakovlev）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus Goeze）、三点盲蝽（Adelphocorisfasciaticollis Reuter）等几种。20世纪后半叶，我国棉田盲蝽蟓的发生数量很低，一直作为棉铃虫（Helicoverpa armigera Hübner）化学防治的兼治对象进行控制。90年代末，我国开始商业化种植转Bt基因棉，棉铃虫得到了有效控制，但是作为棉田次要害虫的盲蝽蟓的发生数量却急剧增加，危害加重，成为当前转Bt棉上的主要害虫。不仅是棉田，盲蝽蟓种群暴发还波及到其他农业作物，近年来盲蝽蟓对枣、葡萄、樱桃、茶树等的危害也日益严重，已经成为影响多种作物生产的重大问题。

转基因棉花对非靶标昆虫的生态效应一直受到人们的广泛关注，主要是采用田间调查的方法进行研究比较。Lu YH等研究结果表明，Bt棉花（表达Cry1Ac蛋白）对盲椿象种群发生没有明显影响，Bt棉花种植后盲椿象出现区域性种群剧增、在多种作物上猖獗为害的现象，主要是由于防治棉铃虫化学农药的减少使用直接导致棉田盲椿象种群上升，危害加重。目前，为了延缓棉铃虫、红铃虫等靶标害虫抗性的发展，转双价抗虫棉花已陆续在美国等国家种植，因此准确及时的评价新型生物蛋白对绿盲蝽的影响，可为转双价抗虫棉的安全性评价奠定基础。

绿盲蝽属于刺吸式害虫，其取食特征与咀嚼式害虫差异很大，而且绿盲蝽若虫和成虫都比较活跃，对其进行生物测定具有一定的难度；绿盲蝽的继代饲养通常是利用新鲜的四季豆或玉米等在室内饲养，测定的蛋白通过浸泡、涂抹等只能存在于四季豆或玉米的表面，很难被绿盲蝽刺吸到。如果利用转基因棉花等植物评价生物蛋白对绿盲蝽的影响，只能限定植物中表达的一定范围内的蛋白浓度，难以准确评价不同蛋白浓度，尤其是高浓度蛋白对绿盲蝽的影响。因此，建立适用于不同浓度梯度生物蛋白的生物测定方法，是准确评价生物蛋白对绿盲蝽影响的关键，为转基因作物的安全性评价奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种评价生物蛋白对绿盲蝽影响的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种评价生物蛋白对绿盲蝽影响的方法，包括如下步骤：

1）根据生物蛋白的作用效果，将待测生物蛋白稀释成不同浓度，与绿盲蝽人工饲料混合，制得生物蛋白测定饲料，并以不添加生物蛋白的饲料组作为对照；

2）用拉伸的封口膜分别包裹不同浓度的生物蛋白测定饲料和对照组饲料，制成大小一致的饲料胶囊；

3）将上述饲料胶囊粘在无盖饲育盒的侧壁上或置于与所述饲育盒相匹配的网架上，每个饲育盒对应于不同的生物蛋白浓度；

4）向饲育盒中接入绿盲蝽若虫（优选1龄）若虫或成虫，用纱布封口，置于温度27±2℃，湿度75±10%，光照14h，黑暗10h的条件下培养；

5）从第0天开始记录绿盲蝽的死亡情况或体重变化。

前述方法中，步骤2）中所述封口膜大小为2.5cm×2.5cm，拉伸成6cm×8cm，在膜中央滴加0.4-0.6mL饲料。

前述方法中，所述饲育盒为无色透明烧杯，直径4.0cm，高6.0cm。

前述方法中，步骤4）中所述纱布为150目纱网。

具体地，将绿盲蝽放入烧杯中，用细纱布和橡胶圈封口防止绿盲蝽逃逸，使其取食饲料，观察绿盲蝽取食饲料情况，并记录绿盲蝽的致死情况或体重抑制效果，评价生物蛋白对绿盲蝽的影响作用。

本发明中涉及的人工饲料为根据ZL201010556195.X制备的绿盲蝽人工饲料。人工饲料在0-4℃的条件下储存，储存时间不超过30天。

本发明提供的生物测定方法，适用范围广，对具有胃毒、内吸作用的药剂及溶于人工饲料的化学物质均能够进行有效测定，并解决了包括绿盲蝽在内的刺吸式口器昆虫难于直接接触不同浓度的生物蛋白等问题，能准确测定生物蛋白对绿盲蝽的影响，具有很强的实用性。

附图说明

图1为本发明实施例1中饲料球位于烧杯中的位置。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中使用的绿盲蝽人工饲料按照ZL201010556195.X中公开的方法制备。

实施例1评价生物蛋白对绿盲蝽影响的方法

制备绿盲蝽人工饲料100mL，将其放入4℃冰箱中储存，备用。

在人工饲料里加入不同剂量的Cry1Ac蛋白，制备成浓度分别为4.1μg/mL、12.3μg/mL、37.0μg/mL、111.1μg/mL、333.3μg/mL、1000μg/mL的生物测定饲料。并以不含Cry1Ac的人工饲料为对照。将预先裁剪的2.5cm×2.5cm封口膜拉伸成6cm×8cm，在膜中央滴加0.4mL各个浓度的生物测定饲料，密封成饲料球。将2个饲料球上的封口膜拉伸粘在烧杯（直径4.0cm，高6.0cm的无盖透明烧杯）中间位置的侧壁上。（图1）

处理组和对照组（CK）分别接入12头1龄绿盲蝽若虫，并用细纱布（150目纱网）和橡胶圈封口防止其逃逸。置于温度27±2℃，湿度75±10%，光照14h，黑暗10h的条件下培养。培养过程中，饲料不用更换，每天记录烧杯中的绿盲蝽剩余数目，第7天记录剩余虫数并回收剩余若虫，重复3次，评价不同浓度的Cry1Ac对绿盲蝽的影响。其中第7天的毒杀效果如表1所示。

表1生物蛋白Cry1Ac对绿盲蝽的生物测定效果

注：利用DPS分析试验数据，将死亡率经反正弦转换后进行ANOVA分析，并用Tukey进行多重比较。表内数据为平均值±标准误。字母不同表示处理组间差异显著，P＜0.05。

由表1可以看出，Cry1Ac在低浓度时对绿盲蝽的影响较小，处理间差异不显著；但随着处理浓度升高到300μg/mL以上时，死亡率出现明显增长的现象，1000μg/mL的Cry1Ac造成88.9%的绿盲蝽若虫死亡，与其他处理差异显著。数据具有规律性，各个处理的三次重复间差异不大，能够真实反映生物蛋白Cry1Ac对绿盲蝽的毒杀作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种评价生物蛋白对绿盲蝽影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）根据生物蛋白的作用效果，将待测生物蛋白稀释成不同浓度，与绿盲蝽人工饲料混合，制得生物蛋白测定饲料，并以不添加生物蛋白的饲料组作为对照；

2）用拉伸的封口膜分别包裹不同浓度的生物蛋白测定饲料和对照组饲料，制成大小一致的饲料胶囊；

3）将上述饲料胶囊粘在无盖饲育盒的侧壁上或置于与所述饲育盒相匹配的网架上，每个饲育盒对应于不同的生物蛋白浓度；

4）向饲育盒中接入绿盲蝽若虫或成虫8-12头，用纱布封口，置于温度27±2℃，湿度75±10%，光照14h，黑暗10h的条件下培养；

5）从第0天开始记录绿盲蝽的死亡情况或体重变化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述封口膜大小为2.5cm×2.5cm，拉伸成6cm×8cm，在膜中央滴加0.4-0.6mL饲料。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述饲育盒为无色透明烧杯，直径4.0cm，高6.0cm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中所述纱布为150目纱网。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中向饲育盒中接入1龄绿盲蝽若虫。