CN103608679B - 用于诊断退行性关节病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在动物中诊断退行性关节病的方法，其包括收集动物的唾液样品；测定唾液样品中选自干扰素γ、干扰素诱导蛋白质10、白介素‑2和总唾液蛋白质的至少一种诊断剂的量；比较唾液样品中发现的诊断剂的所述量与未患退行性关节病的一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一诊断剂的相应量；并且如果所述动物的唾液样品中的诊断剂的量大于一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一诊断剂的量，那么诊断该动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。

Description

用于诊断退行性关节病的方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年5月10日提交的美国临时申请系列号61/518707的优先权，将所述临时申请的公开内容并入本文作为参考。
发明背景
发明领域
本发明一般涉及用于诊断疾病的方法，尤其涉及用于诊断退行性关节病（degenerative joint disease）的方法。
相关领域的描述
用于诊断关节相关病症的方法是本领域已知的。WO28049225A1公开了通过确定样品例如关节软骨细胞样品中垂体同源框转录因子1（pitx-1）阻抑蛋白或复合体（例如抑制素或prohibitone）的细胞定位，来预测骨关节炎的方法。US20070248986A1公开了通过测定一组临床参数值，并且通过关联参数值和预定义的与参数值的范围相关的风险值（例如，C反应蛋白的血清水平、类风湿因子、抗CCP抗体、年龄、性别、关节疼痛的位置、晨僵的时长，以及触痛和/或肿胀关节的数量）预测的发展成类风湿性关节炎的风险，来预测患初发的未分化关节炎（undifferentiated arthritis）的个体发展成类风湿性关节炎的概率。US7005274公开了在人类中早期检测发展成关节炎病症的风险的方法，以及通过比较改变的线粒体功能的一种或多种指示物（例如酶如线粒体酶、ATP生物合成因子、线粒体质量、线粒体数量、线粒体DNA含量、对升高的胞内钙和对凋亡因子（apoptogen）的细胞应答，以及游离的自由基的水平）而进行的用于治疗关节炎病症的治疗剂的筛选测定法。US20040242987A1公开了通过获得的微观和宏观结构或者从关节影像获得的生物力学参数，并分析至少两种参数例如宏观解剖学参数和生物力学参数，来预测影响肌骨骼系统的骨或关节疾病（例如，骨质疏松）的方法。其他已知的方法包括体格检查、X线平片（plainfilm radiography）、计算机控制轴向x线断层摄影术（computed axial tomography）（CAT）扫描、磁共振成像（MRT）扫描、X线造影照相术（contrast radiography）和关节镜检查。
在动物中使用体格检查和X线平片诊断关节相关的病症如退行性关节病是常见的。特别地，这些方法在多种动物如狗中是诊断骨关节炎的主要工具。然而，受影响的动物通常并不表现出明显跛瘸或指示退行性关节病的其他症状。不幸地，这意味着观察到的临床病征不足以支持退行性关节病，例如骨关节炎的推定诊断。此外，X线平片（其是最常用的筛选技术）虽然显示了骨的改变，但通常不能显示软组织如关节囊的改变，因此复杂化了常规诊断。相似地，CAT和MRI扫描是昂贵的，并且通常并不是广泛可用的。X线造影照相术和关节镜检查增加了侵入性的程度。在一些动物如狗中，这些额外的物理疗法经常需要一些形式的约束如麻醉，因此增加了花费、复杂性和风险。鉴于已知方法的这些局限，通常不能确诊退行性关节病。因此，存在用于在动物中诊断退行性关节病的新方法的需求。
发明概述
因此，本发明的目的是提供用于在动物中诊断退行性关节病的方法。
使用用于在动物中诊断退行性关节病的方法实现了这些目的，所述方法包括收集动物的唾液样品；测定唾液样品中至少一种诊断剂的量，所述诊断剂选自干扰素IFNγ、IP-10、IL-2和TSP；比较唾液样品中发现的诊断剂的量与未患退行性关节病的一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一诊断剂的相应量；如果该动物的唾液样品中的诊断剂的量大于一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一诊断剂的量，那么诊断该动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。
本发明其他的目的、特征和优点对于本领域技术人员而言是显而易见的。
发明详述
定义
术语“动物”意为易患退行性关节病或者罹患退行性关节病的任何动物，其包括人类、禽鸟、牛、犬、马（hicrine）、猫科动物、山羊、狼、鼠、绵羊或猪动物。
术语“相当的对照动物”意为相同物种和类型的动物或者在两个不同时间评价的各个动物。
术语“关节”意为动物骨骼（无论是骨还是软骨）的一个或多个连接部分之间的连接。
术语“退行性关节病”意为由于关节的软骨的炎症、破坏和最终丧失而引起的疾病或其他病症。退行性关节病还称作骨关节炎或退行性关节炎。
术语“伴侣动物”意为由人类持有的驯养动物，例如狗、猫、鸟、兔子、豚鼠、雪貂、仓鼠、小鼠、沙鼠、观赏马（pleasure horse）、牛、山羊、绵羊、驴、猪以及更多的外来种，用于陪伴、娱乐、心理支持、向外展示，以及人类需要与其他物种的动物共享的全部其他功能。
如本文中所述，在本文中以简写方式使用范围，以避免必须显示和描述该范围内的每一个值。可以根据需要选择该范围内的任意适当的值作为该范围的上限值、下限值或终值。
如本文中所用，除非文章中另外清楚指明，单词的单数形式包括其复数，并且反之亦然。因此，指代词“一个”和“所述”一般包括各个术语的复数。例如，提到“关节”或“方法”时包括此类“关节”、“方法”的复数。类似地，应当将词语“包含”解释为包含在内而不是排除在外。同样地，应将术语“包括”理解为包括在内，除非上下文明确禁止此种解释。
此处公开的方法和组合物以及其他进展并不限于本文中所述的特定方法、方案和试剂，因为，本领域技术人员应当理解，它们是可以变化的。此外，本文中所用的术语仅用于描述特定的实施方案的目的，并不意在限制和限制公开的或要求保护的本发明的范围。
除非另外定义，本文中所用的所有技术和科学术语，专业术语和缩写具有本领域中或使用该术语的领域中的普通技术人员通常理解的含义。尽管可以将与本文中所述的组合物、方法、生产的物品、其他方法或材料相似的或等同的那些任一组合物、方法、生产的物品、其他方法或材料用于本发明的实践，但在本文中描述了优选的组合物、方法、生产的物品、其他方法和材料。
将本文中引用的或提及的所有专利、专利申请、出版物、技术和/或学术文章，以及其他参考文献在法律允许的程度上以其整体并入本文作为参考。这些参考文献的讨论仅用于总结其中所进行的推断。并未承认任一此类专利、专利申请、出版物或参考文献或其任何部分是相关的、原料或现有技术。特别保留了对此类专利、专利申请、出版物和其他参考文献为相关的、原料或现有技术中的任一主张的准确性和针对性提出质疑的权利。
发明
在一个方面，本发明提供了用于在动物中诊断退行性关节病的方法。所述方法包括收集动物的唾液样品；测定唾液样品中至少一种诊断剂的量，所述诊断剂选自干扰素γ（IFNγ）、干扰素诱导蛋白-10（IP-10）、白介素-2（IL-2）和总唾液蛋白（TSP）；比较唾液样品中发现的诊断剂的量与未患退行性关节病的一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一诊断剂的相应量；如果该动物的唾液样品中的诊断剂的量大于一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一诊断剂的量，那么诊断该动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。
本发明基于这样的发现：动物唾液中存在本发明的诊断剂，并且通过指示或预测退行性关节病的阈值，将唾液中诊断剂的量用作诊断退行性关节病的生物化学指示物。本发明允许兽医和其他临床医师对唾液中这些“生物标记”进行测试，并确定动物是否易患退行性关节病或者罹患退行性关节病，以及是否需要进一步的诊断或治疗。一旦确立了进一步诊断或治疗的需求，那么此类进一步的诊断或治疗的花费和风险就是有正当理由的。
在多个实施方案中，评价了一个或多个相当的对照动物（其不是用于评价退行性关节病的动物，并且已经确定未患退行性关节病）中的至少一种诊断剂，并将此类评价的结果用作基线值，以与从正在对一种或多种诊断剂进行评价的动物获得的结果进行比较。在优选的实施方案中，通过评价大量的相当的对照动物，来确定诊断剂的基线值。
在另一个实施方案中，在动物生命期间的不同时间测定动物中的至少一种诊断剂的量，并将结果用于确定动物是否易患退行性关节病或者罹患退行性关节病，例如如果至少一种诊断剂的量随动物年龄增加，那么可诊断该动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。在优选的实施方案中，周期性地评价动物，并记录诊断剂的结果。然后，如果自上次评价以来，后续的评价显示出一种或多种诊断剂的量具有增加，那么诊断该动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。
在一个实施方案中，如果正在评价的动物的唾液中IFNγ的量是一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的IFNγ的量的至少1.2倍，那么确定该动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。在多个实施方案中，正在评价的动物中IFNγ的量是一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的IFNγ的量的约1.2至约20倍。
在另一个实施方案中，如果正在评价的动物的唾液中IP-10的量是一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的IP-10的量的至少1.4倍，那么确定该动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。在多个实施方案中，正在评价的动物中IP-10的量是一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的IP-10的量的约1.4至约20倍。
在其他实施方案中，如果正在评价的动物的唾液中IL-2的量是一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的IL-2的量的至少1.6倍，那么确定该动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。在多个实施方案中，正在评价的动物中IL-2的量是一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的IL-2的量的约1.6至约20倍。
在另一个实施方案中，如果正在评价的动物的唾液中TSP的量是一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的TSP的量的至少1.8倍，那么确定该动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。在多个实施方案中，正在评价的动物中TSP的量是一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的TSP的量的约1.8至约20倍。
尽管一种诊断剂的使用足以诊断退行性关节病，但本发明包括了两种或多种此类诊断剂的使用，并且在许多情况下是优选的。在一个实施方案中，诊断基于两种诊断剂，在另一个实施方案中，诊断基于三种诊断剂，在另一个实施方案中，诊断基于全部四种诊断剂。可以以任意组合评价诊断剂，并用于诊断。在一个优选的实施方案中，诊断基于两种诊断剂，即IFNγ和IP-10。在另一个优选的实施方案中，诊断基于全部四种诊断剂。
可以使用本发明方法诊断易于破坏的任何关节。通常，关节包括但不限于，滑动关节（摩动关节）、屈戌关节（枢纽关节）、髁状关节（椭圆关节）、马鞍形关节（鞍状关节）、球窝关节（杵臼关节）和车轴关节（车轴关节）。特定的关节包括但不限于，膝关节、肘关节、指间关节、掌指关节、腕关节、腕掌关节、拇指关节、肩关节、髋关节、颞下颌关节和桡尺关节（radio-ulnar joint）。肩关节和髋关节尤其易患退行性关节病。
在多个实施方案中，动物是人类或伴侣动物。优选地，伴侣动物是犬科动物（如狗）或者猫科动物（如猫）。
用于从动物收集的唾液的方法是本领域技术人员已知的，例如使用作为游戏活动的与动物在口头上相互作用的玩具或相似装置或者简单地使用棉签或相似装置收集唾液样品。一种此类装置公开于标题为Oral Engagement Assembly的美国临时专利申请系列号61/455152中。
用于测定唾液中诊断剂的量的方法是本领域熟知的。对于本领域技术人员而言，用于测量唾液中本发明诊断剂的浓度的多种化学分析仪（手动的或自动的），例如ELISA测试是商业可得到的。在本文的实施例中给出了此类方法的实例。
实施例
通过以下实施例进一步进行说明本发明，然而应当理解，除非另外特别指出，包含的这些实施例仅用于说明的目的，并不意在限制本发明的范围。
实施例1
唾液收集：将名为（SARSTEDT，德国）的市售唾液收集装置用于收集狗的唾液。使狗的嘴张开，并将棉签插入到口中，以使动物咀嚼所述棉签约30至45秒。然后，移除并将其转移到收集管中。通过在1,000g旋转收集管2分钟，立即分离唾液。最后，将收集管的尖底中收集的唾液样品转移到新的微管中，并将微管立即冷冻于-80℃，用于进一步的分析。
犬细胞因子分析：使用由Millipore生产的，目录号为CCYTO-90K的Luminex多通道犬细胞因子板（multiplex canine cytokine panel）测量14种细胞因子。按照厂商的标准方法进行操作。在微型离心机中将全部唾液样品以14,000g旋转2分钟，之后立即使用所述样品。然后，将上清液小心地转移到新的微管中，用Luminex测定缓冲液（Millipore目录号L-AB）以1比3的稀释度稀释所述上清液。将各个样品与犬细胞因子质量控制（CanineCytokine Quality Control）1&2（Millipore目录号LCC-6090）以及标准品（Millipore目录号LCC-8090）一起装载到预湿润的96孔过滤板（由厂商提供）上。按厂商的手册，处理平板。将唾液样品与珠子混合，并在4℃，在实验室滴定板振荡器（Lab-Line Instruments型号4625）上剧烈振荡温育过夜，所述珠子上固定有针对14种细胞因子/趋化因子（GM-CSF、IFNγ、KC、IP-10、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-15、IL-18、MCP-1和TNFα）的抗体。第二天，用Luminex洗涤缓冲液（目录号L-WB）洗涤平板后，将犬细胞因子检测抗体（CanineCytokine Detection Antibody）（目录号LCC-1090）加入到平板中。然后，密封平板，并在滴定板振荡器上，在室温剧烈振荡温育1小时。然后，将链霉抗生物素-藻红蛋白（目录号L-SAPE3）加入到平板中，并用盖子（由厂商提供）盖住平板，以防止暴露于光线。然后，在剧烈搅拌的情况下温育已盖住的平板30分钟。温育后，用Luminex洗涤缓冲液洗涤平板，将孔中的珠子重悬在Luminex鞘液中，并且在Luminex100IS读取器上读数。通过命名为LuminexxPONENT（版本3.1.871.0）的软件，计算唾液样品的细胞因子浓度。
P物质（Substance P）ELISA：用市售的ELISA试剂盒-参数P物质测定法（ParameterSubstance P Assay）（R&D Systems，目录号KGE007）分析犬唾液。对于该测定，将全部犬唾液样品以20倍稀释在校准器稀释液（Calibrator Diluent）RD5-45（包含在试剂盒中）中。如试剂盒中所指导的，在相同的稀释液中制备标准品和检测抗体（包含在试剂盒中）。该测定法是竞争ELISA。在3小时的温育期间，样品或标准品中的P物质（SP）将与固定量的辣根过氧化物酶标记的P物质（HRP-SP）竞争小鼠抗P物质（SP）抗体上的结合位点。3小时温育后，洗去未结合的/过量的SP-HRP，仅结合的SP和SP-HRP可以通过包被抗体的平板和小鼠抗SP抗体之间的相互作用连接至预包被抗体的96孔板（包含在试剂盒中）上。最后，将生色团（四甲联苯胺）溶液加入到96孔板中。只有结合的SP-HRP（而不是未结合的SP）可以与生色团底物反应从而显示蓝色。用2N硫酸终止反应后，通过酶标仪（Bio-TEK PowerWave X）在450nm波长测量光密度（OD）。样品中SP的浓度与OD成反比，并且通过标准曲线计算，所述标准曲线通过使用命名为KC Junior（版本1.41）的软件由连续稀释的SP标准溶液产生。
IgA ELISA：使用市售犬ELISA试剂盒（Bethyl Laboratories，Inc.，目录号E40-104）分析唾液IgA，全部抗体和标准品都包含在试剂盒中。使用购自Sigma-Aldrich（SaintLouis，MO）或者直接购自如上所述的其他供应商的
化学品内部地制备常规的ELISA缓冲液：
(1)包被缓冲液，0.05M碳酸盐-碳酸氢盐，pH9.6；
(2)洗涤液，50mM Tris，0.14M NaCl，0.05%Tween20，pH8.0；
(3)封闭液，50mM Tris，0.14M NaCl，1%牛血清白蛋白（BSA），pH8.0；4)样品/酶联物稀释液（Conjugate Diluent），50mM Tris，0.14M NaCl，1%BSA，0.05%Tween20；
(4)酶底物TMB，预制备的溶液SureBlueTM（KPL，目录号52-00-03）；和
(5)终止液，4N硫酸溶液。
进行标准的夹层ELISA方法。用在包被缓冲液中新鲜配制的抗犬IgA抗体溶液包被96孔ELISA板1小时，然后用洗涤液洗涤平板，加入封闭液并温育30分钟。洗涤后，将预稀释的样品或标准溶液加入到平板的孔中。将大多数唾液样品以1比5000稀释于样品/酶联物稀释液中，当测量的IgA浓度超出了标准曲线的动态范围时，进行调整。1小时温育和进行另一次洗涤步骤后，将HRP缀合的检测抗体溶液（稀释在样品/酶联物稀释液中）加入到平板中，并温育1小时。洗涤后，通过加入酶底物TMB开始该平板的比色显色。显色10至15分钟后（直到合适的深蓝色出现），通过加入终止液终止颜色反应。最后，通过酶标仪（Bio-TEKPowerWave X）在450nm测量该平板的OD。使用KC Junior软件（版本1.41）计算样品中IgA的浓度。
使用市售BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific，目录号23225）按说明书指导测定总的唾液蛋白测量。使用试剂盒中提供的BSA标准原液，在蒸馏水和去离子水水中制备连续稀释的牛血清白蛋白（BSA）标准品（0至2mg/ml的范围）。然后，将唾液样品稀释到合适的倍数，以使检测的蛋白质浓度适合BSA标准曲线。可能需要稀释几次，以发现各个样品的合适稀释度。此后，通过涡旋，在新的塑料测试管中以每孔50比1（v/v）混合BCA蛋白测定试剂A（Thermo Scientific，目录号23221）和试剂B（Thermo Scientific，目录号23224）。此后，将稀释的样品或BSA标准品加入到透明底塑料96孔板的孔中，然后将试剂A和B的混合物加入到这些孔中，室温温育平板30分钟。温育期间，试剂B中的五水合硫酸铜与样品中的蛋白质反应，使Cu2+还原成Cu1+，然后试剂A中的二喹啉甲酸（Bicinchonic acid）（BCA）与还原的（一价铜）阳离子反应，从而形成了紫色溶液，其随着蛋白质浓度的增加在562nm处显示出强烈的线性吸收。可以在酶标仪（Bio-TEK PowerWave X）上在562nm波长处对具有样品和标准品的平板读数。使用KCJunior软件（版本1.41）计算样品中总的唾液蛋白的浓度。
统计学分析：使用分析软件包“R”（www.r-project.org）对该研究中产生的全部数据进行Student T检验。针对各个唾液的生物标记，研究了两组之间的统计学显著差异。结果显示于表1和表2中。提及表1和表2，数据显示，IFNγ、IP-10、IL-2和总唾液蛋白在患退行性关节病的动物和未患退行性关节病的动物之间存在显著差异。因此，可以将IFNγ、IP-10、IL-2和总唾液蛋白用作动物中退行性关节病的生物标记。
表1
表1续
表1续
DUA=数据不可用
表2
DJD=退行性关节病
**=显著；*=勉强显著
在本说明书中，已经公开了本发明一般优选的实施方案。尽管使用了特定的术语，但所述术语仅以一般性和描述性含义使用，而不用于限制的目的。权利要求中给出了本发明的范围。显然，在以上教导下，本发明的许多修改和变化是可能的。因此，应当理解在所附权利要求的范围内，可以以与具体描述不同的方式实施本发明。

Claims (18)

1.诊断剂在制备用于在动物中诊断退行性关节病的试剂中的用途，所述诊断剂是诊断选自IFNγ、IP-10、IL-2和TSP的生物标记的诊断剂，所述诊断包括：
收集所述动物的唾液样品；
测定所述唾液样品中至少两种生物标记的量，其中所述两种生物标记是IFNγ和IP-10；
比较所述唾液样品中发现的生物标记的量与未患退行性关节病的一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的相应量；并且
如果所述动物的唾液样品中的生物标记的量大于一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的量，那么诊断所述动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。
2.权利要求1的用途，其中所述诊断基于测定至少三种生物标记的量。
3.权利要求1的用途，其中所述诊断基于测定全部四种生物标记的量。
4.权利要求1的用途，其中如果所述唾液中IFNγ的量为所述一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的量的至少1.2倍，所述唾液中IP-10的量为所述一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的量的至少1.4倍，所述唾液中IL-2的量为所述一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的量的至少1.6倍，或者所述唾液中TSP的量为所述一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的量的至少1.8倍，那么诊断所述动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。
5.权利要求1的用途，其中如果所述唾液中IFNγ的量为所述一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的量的至少1.2倍，并且所述唾液中IP-10的量为所述一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的量的至少1.4倍，那么诊断所述动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。
6.权利要求1的用途，其中如果所述唾液中IFNγ的量为所述一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的量的至少1.2倍，所述唾液中IP-10的量为所述一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的量的至少1.4倍，所述唾液中IL-2的量为所述一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的量的至少1.6倍，并且所述唾液中TSP的量为所述一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的量的至少1.8倍，那么诊断所述动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。
7.权利要求1的用途，其中所述关节是滑动关节、屈戌关节、髁状关节、马鞍形关节、球窝关节或车轴关节。
8.权利要求1的用途，其中所述关节是膝关节、肘关节、指间关节、掌指关节、腕关节、腕掌关节、拇指关节、肩关节、髋关节、颞下颌关节或桡尺关节。
9.权利要求1的用途，其中所述关节是肩关节。
10.权利要求1的用途，其中所述关节是髋关节。
11.权利要求1的用途，其中所述动物是人类。
12.权利要求1的用途，其中所述动物是伴侣动物。
13.权利要求12的用途，其中所述动物是犬科动物。
14.权利要求13的用途，其中所述动物是狗。
15.权利要求12的用途，其中所述动物是猫科动物。
16.权利要求15的用途，其中所述动物是猫。
17.诊断剂在制备用于在动物中诊断退行性关节病的试剂中的用途，所述诊断剂是诊断选自IFNγ、IP-10、IL-2和TSP的生物标记的诊断剂，所述诊断包括：
收集所述动物的唾液样品；
测定所述唾液样品中至少两种生物标记的量，其中所述两种生物标记是IFNγ和IP-10；和
比较所述唾液样品中发现的生物标记的量与未患退行性关节病的一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的相应量；和
如果所述动物的唾液中IFNγ的量比所述一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的IFNγ的量增加至少1.2倍，所述动物的唾液中IP-10的量比所述一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的IP-10的量增加至少1.4倍，所述动物的唾液中IL-2的量比所述一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的IL-2的量增加至少1.6倍，或者所述动物的唾液中TSP的量比所述一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的TSP的量增加至少1.8倍，那么诊断所述动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。
18.诊断剂在制备用于在动物中诊断退行性关节病的试剂中的用途，所述诊断剂是诊断选自IFNγ、IP-10、IL-2和TSP的生物标记的诊断剂，所述诊断包括：
收集所述动物的唾液样品；
测定所述唾液样品中至少两种生物标记的量，其中所述两种生物标记是IFNγ和IP-10；和
比较唾液样品中发现的生物标记的量与未患退行性关节病的一个或多个相当的对照动物的唾液样品中发现的同一生物标记的相应量；和
如果所述动物中IFNγ的量比所述一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的IFNγ的量增加1.2至20倍、所述动物中IP-10的量比所述一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的IP-10的量增加1.4至20倍、所述动物中IL-2的量比所述一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的IL-2的量增加1.6至20倍、或者所述动物中TSP的量比所述一个或多个相当的对照动物的唾液中发现的TSP的量增加1.8至20倍，那么诊断所述动物易患退行性关节病或者罹患退行性关节病。
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