CN103599566A - 一种组织工程天然凝胶支架材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了豆腐柴叶在制备组织工程天然凝胶支架材料中的应用，提供了一种组织工程天然凝胶支架材料制备方法，步骤简单易行，无需大型设备，采用水相反应无毒无害，不污染环境，在工业上有很高的应用前景和实用价值。按照本发明制备方法制得的组织工程天然凝胶支架材料与传统的凝胶支架相比，具有大量孔洞结构，具有很好的生物相容性的同时具有很好的力学性能，使用寿命长。

Description

一种组织工程天然凝胶支架材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于组织工程领域，具体涉及一种组织工程天然凝胶支架材料制备方法和应用。 

背景技术

生物材料和种子细胞是组织工程技术中的两大关键因素。作为种子细胞支架的生物可降解材料，是对细胞外基质的仿生，是保证组织工程化组织形成的前提。细胞与生物材料直接接触后，产生一系列在细胞和分子水平上的反应，因此支架材料的物化性质直接影响着细胞增殖和分化，进而影响体内和体外组织构建效果，最终影响组织工程化组织的形成。由于生物材料在组织工程中是起到负载细胞的支架的作用，一般需要具有相应组织、器官的复杂外形，高空隙率，合适的降解速率，良好的生物相容性。 

目前可供使用的支架材料有：胶原、纤维蛋白、壳聚糖、透明质酸、蚕丝、明胶、聚乳酸、聚轻基乙酸和聚酸配等。这些材料来源丰富、造价低，但是生物相容性以及力学强度仍难以满足组织工程临床应用的需求。因此本领域迫切需要提供一种简单易行、能够精确控制凝胶性能的组织工程天然凝胶支架材料的制备方法。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，公开豆腐柴叶在制备组织工程天然凝胶支架材料中的应用。 

本发明的第二个目的在于公开一种组织工程天然凝胶支架材料制备方法。 

本发明的第三个目的在于提供一种组织工程天然凝胶支架材料。 

本发明的第四个目的在于提供一种组织工程天然凝胶支架材料在组织工程移植物中的应用。 

本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现： 

豆腐柴叶在制备组织工程天然凝胶支架材料中的应用。

豆腐柴是一种药食兼用植物，豆腐柴叶富含胶、蛋白质和纤维素，叶绿素和维生索C，特别是果胶含量高。果胶、糖及水富含的羧基可以形成氢键交联，确保凝胶结构的形成。果胶分子上带有数目不等的羧基集团和不带电荷的甲氧基基团，羧基基团以不带电荷的-COOH 及带负电荷的-COO-形式存在，带负电荷的基团可以与其它带正电荷的物质（如蛋白质、金属离子等）发生反应，果胶中的高聚半乳糖醛酸（HG）部分交联可以形成一个三维晶型网状结构，水和其它溶质被包裹在网格之中时，果胶就会形成凝胶。 

豆腐柴经过一定工艺步骤除杂，分离得到的凝胶液可以用于制备天然凝胶支架材料。细胞实验和力学测试结果表明，豆腐柴叶制得的天然凝胶支架材料对细胞有非常好的相容性，同时凝胶支架材料的力学强度较大，可以满足组织工程临床应用的需求。 

一种组织工程天然凝胶支架材料制备方法，包括如下步骤： 

S1. 取豆腐柴叶研磨，离心取上清液与乙醇混合，震荡混合均匀，再次离心得到提取液；

S2. 将步骤S1制得的混合液装入准备好的半透膜在超纯水中进行透析，透析完毕的提取液平铺、干燥，得到组织工程凝胶支架材料。

步骤S1中所述离心的条件为以4000~5000 r/min的转速离心5~10min。 

步骤S2中所述透析的条件为每4小时换水一次，总透析时间为72小时。 

步骤S2中所述干燥为冷冻干燥，冷冻干燥时间为48~72小时；在冷冻干燥前，透析液先在-4℃环境下预冻2~3小时，然后置于-80℃的环境下继续冷冻24~36小时。 

一种根据上述制备方法制备得到的组织工程天然凝胶支架材料。 

所述组织工程天然凝胶支架材料为片状或颗粒状，含有果胶多糖的重量百分比为1~25%。 

根据上述制备方法制备得到的组织工程天然凝胶支架材料在组织工程移植物中的应用。 

所述组织工程移植物为软骨移植物或结缔组织移植物。 

所述组织工程移植物的制备步骤如下： 

S3. 将步骤2制得的组织工程凝胶支架材料粉碎，用35目筛网过滤得凝胶颗粒，所得凝胶颗粒的粒径为500μm以下；

S4. 将步骤S3制得的凝胶颗粒与含有海藻酸钠-酪蛋白的溶液混合，所述溶液和凝胶颗粒的体积比为1:3~1:1；

S5. 将含有种子细胞的细胞悬液加入步骤S4制备得到的混合液中搅拌制得组织工程移植物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 

本发明公开了豆腐柴叶在制备组织工程天然凝胶支架材料中的应用，提供了一种组织工程天然凝胶支架材料制备方法，步骤简单易行，无需大型设备，采用水相反应无毒无害，不污染环境，在工业上有很高的应用前景和实用价值。按照本发明制备方法制得的组织工程天然凝胶支架材料与传统的凝胶支架相比，具有大量孔洞结构，具有很好的生物相容性的同时具有很好的力学性能，使用寿命长。

附图说明

图1 为实施例1组织工程天然凝胶支架材料产品照片； 

图2为组织工程天然凝胶支架材料的细胞培养细胞活力检测结果图；

图3为组织工程天然凝胶支架材料复合软骨细胞后FDA染色图（其中，图2A为100倍放大，图2B为40倍放大）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。 

实施例1  组织工程天然凝胶支架材料的制备 

取豆腐柴叶30g，冰冻24小时，将冷冻过的豆腐柴叶及20ml去离子水放入研钵中，捣碎，边研磨边加水，直至成糊状。将研磨好的豆腐柴汁液及残渣装入离心管中，以转速4000 r/min离心5min，然后将上清液吸出，残渣装入袋中，密封-4℃冷冻保存，以备后用。将粗提取得到的上清液加入50ml的90%乙醇中，震荡混合均匀，然后装入离心管中以转速5000 r/min离心10min，然后将上清液吸出，取3ml上一步中得到的上清液滴加到1mol/L的CaCl₂溶液中凝胶原理进行检验，如果无明显凝胶现象，将得到的沉淀用水溶解，并在60℃环境中加热，每半小时取出震荡一次，让液体混合均匀，处理2小时，然后重复提取至凝胶状。将得到的凝胶提取液装入截留分子量为8000~14000的半透膜中进行透析，透析时间48h，每4h换一次透析液。将透析完毕的凝胶提取液取出装入小试管中用滤纸封好口，先在-4℃环境下预冻2小时，然后置于-80℃的环境下继续冷冻36h，最后将冷冻处理过的凝胶提取液放入低温冷冻干燥机中进行冻干处理，冻干处理48h即可得到的组织工程天然凝胶支架材料，产品如图1所示。

实施例2 组织工程移植物的制备 

新鲜猪后腿剔除多余脂肪和肌肉，保留膝盖软骨和股骨，切断十字韧带，小心打开髌骨，暴露关节腔，继续分离组织至完全显露关节软骨面，注意勿伤及关节软骨。小心切取方形软骨组织，用镊子夹住浸泡于10ml PBS中清洗。取材完毕后，用双抗清洗软骨组织3遍，弃上悬液。将软骨组织转移至10ml培养皿中，用镊子固定软骨，移液枪去除液体。在培养皿中加入少量PBS，没过组织即可，切碎软骨组织，比米粒更小些的颗粒用枪头将切碎组织移入50ml离心管中，摇匀清2-3次，倒去液体，加入约20ml完全培养基，轻轻摇晃，置于培养箱中4-6小时，倒去上清液，加入20ml Ⅱ型胶原酶，培养箱中过夜。取培养瓶，分别加入培养基。将组织从培养箱中取出，离心（1400r/min，5min），弃上清，加入15ml软骨培养基后转入培养瓶中，37℃ 5%CO₂培养箱中孵育。培养箱中取出细胞，培养瓶中加入0.25%胰蛋白酶消化液3ml后培养箱中消化3min，消化后继续培育，取第3代细胞用于组织工程移植物的制备。

将实施例1中制得的组织工程凝胶支架材料通过超声波破碎仪粉碎，用35目筛网过滤得凝胶颗粒，所得凝胶颗粒的粒径为400μm，制得的凝胶颗粒与含有海藻酸钠-酪蛋白的溶液按3:1的体积比混合，将第3代软骨细胞悬液加入凝胶颗粒混合液中，混合液移入直径为10cm的培养皿中，放入37℃ 5%CO₂培养箱中培养7天，每2天换一次培养基。由以上过程得到组织工程移植物。 

实施例3  组织工程凝胶支架材料用于软骨细胞培养细胞毒性MTT检测 

将实施例2中得到的软骨细胞的浓度配成1x10⁴Cell/mL，按100uL每孔接种于96孔板中，培养24小时后换成含l mg/ml由实施例1得到的组织工程天然凝胶支架(得到的经蒸汽灭菌后的凝胶支架颗粒)的培养液，单纯DMEM培养基作为阴性对照，含649g/L苯酚的DMEM培养液作为阳性对照，每个样本在每个时间点重复8个样。分别培养2，4和7天后，每个孔板加入 100μL的0.5mg/ml的3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)溶液。37℃孵育4小时后，吸弃每个孔板中的培养液，加入150μL的DMSO（二甲基亚砜）。96孔板在摇床摇晃5分钟后，把每个孔内的液体移至另一新96孔板，在免疫酶标仪上用490nm波长测定每孔的吸光值。结果如图2所示。

结果表明，凝胶支架无细胞毒性，和阴性对照组即单纯DMEM的增殖在不同时间点均无显著性差别。随着时间的增加，凝胶组的细胞和阴性对照组一样，呈正常的增殖趋势。因此，本发明提供的凝胶支架可用于负载细胞的组织工程支架。 

实施例4  组织工程天然凝胶支架材料用于软骨细胞培养FDA染色实验 

称5mgFDA(二乙酸荧光素)加入1mL丙酮溶解，摇匀，避光4℃保存；使用时用PBS将FDA溶液稀释1000倍，得到5μg/mL FDA溶液，将实施例2中得到的组织工程移植物的培养基吸走，用无菌PBS溶液清洗三次，待用。在每孔材料中加入200μl的FDA溶液，培养箱中放置10min，尽量避光；取出培养皿，吸去染色液，用PBS清洗三次，置于荧光显微镜下观察。激发波长484nm，发射波长 520nm。

结果见图3结果表明，在凝胶材料内分布着密集的干细胞，细胞生长状态好；细胞形态饱满，可观察到细胞在凝胶内部均匀分布生长。 

Claims (10)

1.豆腐柴叶在制备组织工程天然凝胶支架材料中的应用。

2. 一种组织工程天然凝胶支架材料制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1. 取豆腐柴叶研磨，离心取上清液与乙醇混合，震荡混合均匀，再次离心得到提取液；

S2. 将步骤S1制得的混合液在超纯水中进行透析，透析完毕后干燥即得到所述组织工程凝胶支架材料。

3. 根据权利要求2所述组织工程天然凝胶支架材料制备方法，其特征在于，步骤S2中所述干燥为冷冻干燥。

4. 根据权利要求2所述组织工程天然凝胶支架材料制备方法，其特征在于，步骤S1中所述离心的条件为以4000~5000 r/min的转速离心5~10min。

5. 根据权利要求2所述组织工程天然凝胶支架材料制备方法，其特征在于，步骤S2中所述透析的条件为每4小时换水一次，总透析时间为72小时。

6. 一种根据权利要求2所述组织工程天然凝胶支架材料制备方法制备得到的组织工程天然凝胶支架材料。

7. 根据权利要求6所述组织工程天然凝胶支架材料，其特征在于，所述组织工程天然凝胶支架材料为片状或颗粒状，含有1~25%重量百分比的果胶多糖。

8. 根据权利要求2所述组织工程天然凝胶支架材料制备方法制备得到的组织工程天然凝胶支架材料在组织工程移植物中的应用。

9. 根据权利要求8所述组织工程天然凝胶支架材料在组织工程移植物中的应用，其特征在于，所述组织工程移植物为软骨移植物或结缔组织移植物。

10. 根据权利要求8或9所述组织工程天然凝胶支架材料在组织工程移植物中的应用，其特征在于，所述组织工程移植物的制备步骤如下：

S3. 将步骤2制得的组织工程凝胶支架材料粉碎，用35目筛网过滤得凝胶颗粒；

S4. 将步骤S3制得的凝胶颗粒与含有海藻酸钠-酪蛋白的溶液混合，所述溶液和凝胶颗粒的体积比为1:3~1:1；

S5. 将含有种子细胞的细胞悬液加入步骤S4制备得到的混合液中搅拌制得组织工程移植物。

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