CN103596439A - 制备乳蛋白质组合物的方法 - Google Patents

Abstract

本申请描述了从原料动物乳中提供乳蛋白质的方法。所述方法包括对所述乳进行两个微滤步骤。一个步骤为在25℃～65℃下的温微滤，另一个步骤为在0℃～25℃下的冷微滤。所述步骤可以以任一顺序进行，其中对在第一步骤中获得的渗余物进行第二步骤。所得乳血清蛋白和β-酪蛋白适合用于婴儿或幼儿配方。

Description

制备乳蛋白质组合物的方法

技术领域

本发明涉及提供乳蛋白质的方法。特别地，本发明涉及制备用于婴儿和幼儿配方之乳蛋白质组合物的方法。

背景技术

已经确认，人母乳对于婴儿和幼儿来说是优选食物。然而，在许多情况中，人乳是不能充足得到的，或者出于其他原因母乳是不可能的或不期望的。在这些情况中，基于牛乳的婴儿食品通常被认为是良好的替代物。由于牛乳和人乳在组成、尤其是蛋白质组成上显著不同，所以已经进行了大量研究以使婴儿食品的组成尽可能好地接近人乳的组成。该方法也被称为牛乳人乳化（humanizingcow'smilk）。

关于使牛科动物乳（bovinemilk）转化成可用于模拟人乳蛋白质之蛋白质组合物的背景参照为US5,169,666。其中，在将牛科动物乳在约4℃下预处理四小时或更久的情况下，对所述乳进行低温超滤或微滤。据称所述预处理作用为β-酪蛋白的微团离解，其结果为所得到的渗透物中其他酪蛋白减少。优选地，减少了β-乳球蛋白，这是通过pH调节和氯化钠添加来进行的。

另一个背景参照为EP1133238。其中，来源于乳清的蛋白质组合物通过以下制备：在较高温度（通常为50℃）下对未经热处理或最多已经历适度热处理的乳进行微滤。

另一个背景参照为WO2008/127104。其涉及适合作为用于例如婴儿食品之成分的血清蛋白产品，其通过在10℃～20℃的温度下利用孔径为0.3至0.5μm的膜对牛科动物乳进行微滤来获得。

尽管本领域（包括前述参照）在提供满足人乳化牛科动物乳之目的的特定蛋白质组合物的方法中做出了很好的改进，但是所公开的方法很少适合与不断增长的知识保持一致。为此，随着基于乳的蛋白质在婴儿配方中之期望组成的知识在不断改进，期望提供这样的方法，可由该方法产生具有比本领域可得的功能性更强的不同蛋白质组合物。另外，基于现有知识，期望提供这样的方法，通过所述方法特别地使α-乳清蛋白和β-酪蛋白以分别相对于β-乳球蛋白和α-酪蛋白高的量存在。

发明内容

为了更好地满足一个或更多个前述期望，在一个方面，本发明提供了提供乳蛋白质的方法，所述方法包括对动物乳（其中所述乳包含非变性的乳蛋白质）进行第一微滤步骤，从而获得第一渗透物和第一渗余物，并且对所述第一渗余物进行第二微滤步骤，从而形成第二渗透物和第二渗余物，其中所述微滤步骤包括25℃～65℃下的温微滤（warm microfiltration）和0℃～25℃下的冷微滤（cold microfiltration）。

在另一个方面，本发明示出了包含能够由前述方法获得的乳蛋白质的组合物，所述组合物包含至少一部分所述第二渗余物和/或至少一部分所述第二渗透物。

在另一个方面，本发明提供了能够由前述方法获得的乳蛋白质作为婴儿或幼儿配方中之成分的用途。

发明详述

广义上，本发明涉及在组合方法中明智地选择使用两个分开的微滤步骤，所述两个分开的微滤步骤允许分开收获乳血清蛋白和β-酪蛋白。这些步骤可以以任一顺序进行。

所涉及的两个步骤为“温”微滤步骤（即在25℃～65℃的温度下）和“冷”微滤（即在0℃～25℃的温度下）。微滤通常使用具有以下孔径的微型过滤器进行：0.01μm至5μm，优选0.05至1.2μm，更优选0.1μm至0.5μm，仍更优选0.2μm至0.45μm。

合适的微型过滤器为本领域已知并且包括例如有机螺旋卷式膜（organic spiral wound membrane，例如，除了Koch、Synder、DSS的那些）、板框系统（plate and frame system）（例如，如由Novasep提供的）或者陶瓷膜（例如，来自TAMI、Pall、Atech等）。

对于微滤，可使用用于横流微滤的任何常规装置。因此，例如可使用螺旋卷式微滤膜（例如，如EP-A-1673975中所述）或者可使用陶瓷膜。优选地，使用具有多螺旋卷式模块的方法系统。发现有帮助的是在横流微滤方法中采取措施以降低跨膜的跨膜压，在该方式中跨膜压最大为2.5巴。因此，优选地，在根据本发明的方法中微滤期间的跨膜压（transmembranepressure，TMP）保持相对低，即最大2.5巴。例如在2巴的最大跨膜压下获得了关于渗透物之蛋白质组成的良好结果。平均跨膜压可以变化并且例如为1.5或1.3或0.5巴。在一个特定的实施方案中，最大跨膜压为1巴，在另一些实施方案中为0.9巴或更低。

替代降低跨膜压，一种不同的解决方案可以是使用在膜层的孔隙率或厚度上具有梯度的微滤膜。

在根据本发明的方法中，可使用孔径为0.05至1.0μm的标准微滤膜。通常已知的是，孔径影响渗透物和渗余物的最终蛋白质组成。根据本发明，表明孔径尤其对血清蛋白与酪蛋白的比率和β-酪蛋白在酪蛋白级分中的比例具有影响。在一个实施方案中，使用具有以下孔径的膜（例如，螺旋卷式膜）：0.05至1.0μm，优选0.1至0.5μm。另一些优选的孔径范围为0.01μm至5μm，优选0.1μm至1.2μm，最优选0.2μm至0.45μm。

以包含非变性的乳蛋白质的乳为起始进行组合的微滤步骤。这可涉及原料（raw）（未处理）乳或已经历温和热处理的乳。乳可以是全乳或者较大或较小程度脱脂的乳、原料乳、离心除菌乳或者过滤除菌乳（bactofiltered milk）或者在温和条件下巴氏消毒的乳或由在低温下干燥的经粉末化的乳重新形成的乳。优选地，使用未加热处理的脱脂原料乳。如果加热处理，在低于相关乳蛋白质之变性温度的温度、优选低于65℃下进行。

原则上，提供用于本发明之方法的乳可来自任何产乳动物。这主要是牛并且特别是奶牛（成年母牛），但是除了牛以外，以下动物提供由人用于乳制品的乳：骆驼、驴、山羊、马、驯鹿（reindeer）、绵羊、水牛（waterbuffalo）、牦牛（yak）和驼鹿（moose）。最优选地，用于本发明的乳为牛乳。

在一个实施方案中，温微滤作为第一步骤进行。优选地使用陶瓷膜作为微型过滤器进行。当对乳进行该步骤时，所得第一渗透物包含乳血清蛋白。之后对所得第一渗余物进行冷微滤步骤，所述第一渗余物包含乳固体，乳血清蛋白的至少一部分已从所述乳固体中除去。通常，在冷微滤步骤之前所述渗余物将例如通过透析进行稀释。通常，温微滤可进行按重量计多至35%、优选按重量计多至25%的蛋白质浓度。因为可从冷微滤获得的蛋白质浓度较低（通常按重量计多至20%，优选按重量计多至15%），所以来自待进行冷微滤之温微滤步骤的渗余物将稀释至按重量计低于15%、通常为5～15重量%、优选不高于10重量%的蛋白质浓度。

冷微滤步骤产生了包含β-酪蛋白、小微团材料和钙的渗透物。该步骤的渗余物包含α-酪蛋白，其可以以规律方式进行例如乳酪制作或酪蛋白酸（盐）生产。

该实施方案的一个实例在下述方案1中举例说明。这里的缩写“CN”表示上述酪蛋白级分，“SP”表示上述血清蛋白，“DM”表示干物质。另外，“Ret”表示“渗余物”，“Perm”表示渗透物。

方案1

在另一个实施方案中，首先进行冷微滤。在该情况中，第一渗透物将包含乳血清蛋白（尤其是α-乳清蛋白和β-乳球蛋白）和β-酪蛋白的一部分（大致一半）。之后，对包含α-酪蛋白和乳血清蛋白之剩余部分的第一渗余物进行温微滤步骤，从而获得包含乳血清蛋白的渗透物和包含α-酪蛋白的渗余物。

该实施方案的实例在下述方案2和3中举例说明。这里的缩写与上文具有相同涵义，由此应理解“CN”和“SP”级分具有如关于本实施方案所讨论的组成。

方案2

方案3

上述方案1～3还表明，在任一实施方案中，可以以任何期望的组合将来自两个微滤步骤的渗透物用于提供包含乳蛋白质的组合物。根据微滤条件（例如，孔径、温度、跨膜压），血清蛋白与酪蛋白的比率和/或β-酪蛋白含量可以变化。通常，在婴儿食品中预期血清蛋白与酪蛋白的比率为约60:40，从而带来与人乳尽可能好地相符的蛋白质组成。在本发明之方法的基础上，这可通过将脱脂乳添加至第一微滤步骤和第二微滤步骤的渗透物中（例如按体积计5～15%、优选约10%）来实现。或者，可使用血清蛋白和或酪蛋白的其他来源，从而提供任何类型乳蛋白质之间的期望比率。

进行微滤步骤之后，还可根据一种或更多种常规方法处理微滤渗透物，所述常规方法例如超滤、纳米过滤、离子交换、电渗析、反渗透、脱盐、蒸发和喷雾干燥。例如，除去Na和K。同样地，还可通过滤出细菌来进行陶瓷微滤，满足温和保存的目的。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法提供了一个或更多个另外的步骤，用于以β-乳球蛋白为代价优化α-乳清蛋白的比率。事实上可以进行这样的进一步优化是本发明之组合微滤方法的优点之一。因此，其中温微滤是第一步骤之实施方案的益处是获得了这样的渗透物，其包含相对大量的可得乳血清蛋白（通常为按重量计0.3%至0.5%），可对该量进行使得α-乳清蛋白与β-乳球蛋白相分离的技术，例如β-乳球蛋白的沉淀或微颗粒化或者具有50～70kDa截留（cut-off）的顺序超滤（sequentialultrafiltration）。这些技术为技术人员已知，并且可对温微滤步骤的渗透物进行这些技术，不论所述步骤是第一微滤步骤还是第二微滤步骤。

在一个实施方案中，其中首先进行冷微滤步骤，对冷微滤的渗余物进行温微滤步骤，另一个优选的实施方案是还对冷微滤的渗透物进行温微滤步骤。不希望受到理论的束缚，主要蛋白质的分子量表明第三微滤步骤能够以β-乳球蛋白为代价产生α-乳清蛋白的进一步改进比率。因此，来自冷微滤之渗透物的温微滤提供了获得作为渗透物之α-乳清蛋白和β-酪蛋白并且β-乳球蛋白主要存在于渗余物中的可能性。

在另一个方面，本发明示出包含可通过根据任一上述实施方案之方法所获得乳蛋白质的组合物，所述组合物包含至少一部分第二渗余物和/或至少一部分第二渗透物。优选地，整个组合物包含如通过本发明方法获得的乳蛋白质。在一个优选的实施方案中，在组合物中将至少一部分第一渗余物和至少一部分第二渗余物组合在一起。在另一个优选的实施方案中，在组合物中将至少一部分第一渗透物和至少一部分第二渗透物组合在一起。

在另一个方面，本发明提供了可通过根据任一上述实施方案之方法所获得的乳蛋白质作为婴儿或幼儿配方中之成分的用途。

除了人母乳之外或代替人母乳，婴儿（Infant或baby）配方通常用于至多12个月大的婴儿（第一阶段+第二阶段（starter+follow-on））。幼儿配方通常是指用于12～48个月儿童的成长乳（growing-up milk，GUM）。明显地，根据本发明不排除使用所获得的乳蛋白质和乳蛋白质组合物另外用于其他目的，例如肠食物（enteral food）、儿童或老年人的医学营养物。

应理解，根据本发明提供的任何营养组合物（如婴儿或幼儿配方）可包含任何其他常规成分。例如，常规添加至婴儿食品和治疗组合物的是碳水化合物（例如乳糖和寡糖），脂质和例如维生素、氨基酸、矿物质、牛磺酸、肉碱、核苷酸和聚氨的成分，以及抗氧化剂（例如BHT、抗坏血酸棕榈酸酯、维生素E、α-胡萝卜素及β-胡萝卜素），叶黄素，玉米黄素，番茄红素和卵磷脂。脂质主要来源于蔬菜。另外，食物或治疗组合物可富集有多不饱和脂肪酸，例如γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、亚麻油酸（stearidonic acid）、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸。为了适当地形成肠菌丛，可添加益生菌（例如乳酸杆菌和/或双歧杆菌）以及益生质（prebiotic）。益生菌的一个优选组合为例如乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）与干酪乳杆菌（L.casei）、副干酪乳杆菌（L.paracasei）、唾液乳杆菌（L.salivarius）或罗伊氏乳杆菌（L.reuter）。益生质的实例包括岩藻糖-寡糖、果糖-寡糖和/或半乳糖-寡糖、短链和长链的(岩藻糖)唾液酸寡糖、支链(寡)糖、富含唾液酸的乳产品或其衍生物、菊粉、角豆粉（carob bean flour），可水解或不可水解的胶、纤维、蛋白质水解物、核苷酸，所述内容总体上不应理解为穷举。

将在下述非限制性实施例中举例说明本发明。

实施例

在62℃热处理后，对脱脂乳进行第一微滤步骤。在温和压力条件（通常为约0.6巴）且低于10℃下进行经0.14μm Tami等通量膜（isofluxmembrane）的第一批量过滤。将乳浓缩3倍（体积减缩系数=3）。该渗透物被称为渗透物I。

该微滤后，渗余物用水稀释3倍（1份渗余物和2份水），然后对其进行第二微滤步骤。也在温和压力条件（TMP为约0.6巴）下在50℃经0.14μm Tami等通量陶瓷膜批量过滤该渗余物，直到浓缩系数为4。分别将该步骤的渗透物称为渗透物II，将渗余物称为渗余物II。

对于渗透物I、渗透物II和渗余物II，测量蛋白质组成。

方法1-酪蛋白

使样品溶解于或混合于水中，然后在pH4.6下沉淀酪蛋白和变性蛋白质。从溶液中滤出蛋白质沉淀，使用方法2分别进行测量。

方法2-根据凯氏定氮法（Kjeldahl）的总蛋白质

通过使用具有浓硫酸和硫酸钾的混合物的模块式消化装置（block-digestion apparatus）、使用硫酸铜(II)作为催化剂来消化测试部分，从而使存在的有机氮转化成硫酸铵。硫酸钾的功能是提高硫酸的沸点并且提供较强的氧化环境。将过量的氢氧化钠添加至冷却的消化物中以释放氨。使用半自动蒸汽蒸馏设备使释放的氨蒸汽蒸馏至过量的硼酸溶液中，之后经盐酸滴定。由所产生氨的量计算氮含量。

方法3-非蛋白质-氮（nonprotein-nitrogen，NPN）含量

通过添加三氯乙酸溶液从测试部分沉淀蛋白质，使得三氯乙酸在混合物中的终浓度为约12%。经沉淀的乳蛋白质通过过滤除去，剩余滤液包含非蛋白质氮组分。通过方法2中所述程序测定滤液的氮含量。

血清蛋白浓度计算为总蛋白质-酪蛋白-NPN。

方法4-通过CZE测量的血清蛋白

在包含6M尿素和甲基羟乙基纤维素的水溶液中在pH8.6下通过毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，CZE）获得了乳蛋白质的测定，导致蛋白质的完全分离。在UV214nm处进行测定。基于保留时间鉴定多种组分并且通过外标使用峰面积对所述多种组分进行测定。

方法5-牛IgG，ELISA

分析物特异性抗体（捕获抗体）与使用者提供的聚苯乙烯微板相结合。洗去未结合的捕获抗体。封闭板并进行洗涤。添加样品或标准物，然后任何存在的分析物被固定化之抗体所结合。洗去未结合材料。HRP缀合的牛IgG检测抗体用作最后步骤。洗去未结合检测Ab。将四甲基联苯氨（tetramethylbenzidine，TMB）底物溶液添加至孔中，然后以与样品中所存在分析物的量成比例地显示蓝色。显色停止，孔中的颜色转变成黄色。在450nm处测量颜色的吸光度。

方法6-牛IgA，ELISA

分析物特异性抗体（捕获抗体）与使用者提供的聚苯乙烯微板相结合。洗去未结合的捕获抗体。封闭板并进行洗涤。添加样品或标准物，然后任何存在的分析物被固定化之抗体所结合。洗去未结合材料。HRP缀合的牛IgA检测抗体用作最后步骤。洗去未结合检测Ab。将四甲基联苯氨（TMB）底物溶液添加至孔中，然后以与样品中所存在分析物的量成比例地显示蓝色。显色停止，孔中的颜色转变成黄色。在450nm处测量颜色的吸光度。

方法7-牛TGF-β1，乳，ELISA

分析物特异性抗体（捕获抗体）与使用者提供的聚苯乙烯微板相结合。洗去未结合的捕获抗体。封闭板并进行洗涤。添加样品和标准物，然后任何存在的分析物被固定化之抗体所结合。洗去未结合材料。链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）用于结合检测抗体。洗去未结合链霉亲和素-HRP。将四甲基联苯氨（TMB）底物溶液添加至孔中，然后以与样品中所存在分析物的量成比例地显示蓝色。显色停止，孔中的颜色转变成黄色。在450nm处测量颜色的吸光度。

方法8-牛TGF-β2，乳，ELISA

分析物特异性抗体（捕获抗体）与使用者提供的聚苯乙烯微板相结合。洗去未结合的捕获抗体。封闭板并进行洗涤。添加样品和标准物，然后任何存在的分析物被固定化之抗体所结合。洗去未结合材料。链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）用于结合检测抗体。洗去未结合链霉亲和素-HRP。将四甲基联苯氨（TMB）底物溶液添加至孔中，然后以与样品中所存在分析物的量成比例地显示蓝色。显色停止，孔中的颜色转变成黄色。在450nm处测量颜色的吸光度。

方法9-牛乳铁蛋白，ELISA

分析物特异性抗体（捕获抗体）与使用者提供的聚苯乙烯微板相结合。洗去未结合的捕获抗体。封闭板并进行洗涤。添加样品或标准物，然后任何存在的分析物被固定化之抗体所结合。洗去未结合材料。HRP缀合的牛乳铁蛋白检测抗体用作最后步骤。洗去未结合检测Ab。将四甲基联苯氨（TMB）底物溶液添加至孔中，然后以与样品中所存在分析物的量成比例地显示蓝色。显色停止，孔中的颜色转变成黄色。在450nm处测量颜色的吸光度。

结果：

上述表格显示出组合低温下和高温下微滤步骤的优点。在低温下所获得渗透物之特定蛋白质组成的优点可以与在高温下渗透物之特定蛋白质组成和在高温下过滤系统的较高能力二者相组合。

结果示出，例如通过组合两个微滤步骤，多种血清蛋白的最终渗余物被高度耗尽。这将对于为最终产品选择血清蛋白级分给予很大自由。同时，最终渗余物的血清蛋白级分（例如乳铁蛋白）富集。

通过例如将两个微滤步骤的渗透物组合在一起，可获得具有改进的a-la、酪蛋白、TGFβ1和TGFβ2含量（与在较高温度的单一微滤步骤中所获得的血清蛋白产物相比）或者具有提高的IgA或酪蛋白含量（与在较低温度的单一微滤步骤中所获得的血清蛋白产物相比）的血清蛋白产物。

各种蛋白质的营养优势是明显的。免疫球蛋白可以与病原菌和病毒相结合。如此，它们可防止与肠上皮相黏附，但是它们还可通过巨噬细胞和树突细胞经由Ig受体促进摄入这些病原体。这促进了病原体清除，但是还需要其用于将病原体抗原呈递至免疫系统并且诱导免疫应答。需要有效的免疫应答以清除继发感染中的病原体。

TGF-β为具有多种功能的抗炎性细胞因子。其在肠上皮细胞的分化中很重要，因此在屏障功能中发挥作用。它也是促进诱导调节T细胞以及诱导IgA在肠中产生的关键细胞因子。因此，在TGF-β影响下的免疫应答并不过多，不诱导组织损害，并且事实上可下调强的免疫应答。另外，IgA产生并分泌至肠腔中对以非炎性方式清除病原体做出贡献。

乳铁蛋白是还可具有抗炎性质的蛋白质，但是其主要已知用于螯合铁。铁被病原菌使用，限制它们可使用的铁是恰当的。

TGF-β在变态反应中可具有主要益处。母乳中的TGF-β水平与针对变态反应的保护相关联。免疫球蛋白（初乳）可例如在患有复发性腹泻的AIDS患者中预防腹泻，但也针对大肠杆菌（E.coli）或轮状病毒感染使用经免疫之奶牛的初乳。最后，乳铁蛋白可预防低出生重量儿童的细菌感染。

Claims (15)

1.提供乳蛋白质的方法，所述方法包括对动物乳进行第一微滤步骤，从而获得第一渗透物和第一渗余物，其中所述乳包含非变性的乳蛋白质，并且对所述第一渗余物进行第二微滤步骤，从而形成第二渗透物和第二渗余物，其中这些微滤步骤包括在25℃～65℃下的温微滤和在0℃～25℃下的冷微滤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述温微滤在40℃～60℃下进行。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述冷微滤在0℃～20℃下进行。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用孔径为0.01μm至5μm、优选0.1μm至1.2μm、最优选0.2μm至0.45μm的微型过滤器进行所述温微滤。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用孔径为0.01μm至5μm、优选0.1μm至1.2μm、最优选0.2μm至0.45μm的微型过滤器进行所述冷微滤。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳为牛乳。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用水性组合物、优选用水将所述第一微滤步骤的渗余物稀释至5～15重量%、优选最多10重量%的蛋白质浓度，并将所述经稀释渗余物用于所述第二微滤步骤。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中先对所述乳进行所述温微滤步骤，并对其渗余物进行所述冷微滤步骤。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中先对所述乳进行所述冷微滤步骤，并对其渗余物进行所述温微滤步骤。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对所述冷微滤步骤的渗透物进行再一个温微滤步骤。

11.包含乳蛋白质的组合物，所述乳蛋白质能够通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得，所述组合物包含至少一部分所述第二渗余物和/或至少一部分所述第二渗透物。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中将至少一部分所述第一渗余物与至少一部分所述第二渗余物组合在一起。

13.根据权利要求11所述的组合物，其中将至少一部分所述第一渗透物与至少一部分所述第二渗透物组合在一起。

14.能够通过根据权利要求1至10中任一项所述之方法获得的乳蛋白质作为婴儿或幼儿配方中之成分的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述乳蛋白质在根据权利要求11至13中任一项所述的组合物中提供。