CN103588977A - 一种提取制备泥炭黄腐殖酸的方法和药物应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开泥炭黄腐殖酸的提取方法和药物应用；方法A：泥炭、极端嗜热(3-13CFU)、嗜压(5-11CFU)、嗜盐(6-12CFU)、嗜碱(7-13CFU)、嗜酸菌(3-10CFU)混合，条件一（10-130℃、0.05-0.18MPa）、二（5-75℃、0.05-0.12MPa）和三（5-65℃0.05-0.12MPa）处理1-2、1-3和1-2天；方法B：将泥炭和部分菌混合，条件一二1-2和1-3天，与嗜酸菌混合，条件三1-2天；方法C：将泥炭、极端嗜热菌和嗜压菌混合，条件一1-3天，与嗜盐、碱菌混合，条件二1-3天，与嗜酸菌混合，条件三1-2天。该方法得到的黄腐殖酸的纯度高。

Description

一种提取制备泥炭黄腐殖酸的方法和药物应用

技术领域

本发明涉及提取制备泥炭黄腐殖酸的方法及其制得的产品和药物应用。

背景技术

泥炭腐植酸属于沼泽植物遗体转变成的具有多组分、多级分、半胶体特性的生物高分子（摘自Biopolymers，[芬]M.霍夫里特[德]A.斯泰因比歇尔主编，郭圣荣主译，化学工业出版社，现代生物技术与医药科技出版中心，2004.6第一版，第1卷木质素、腐殖质和煤）。含羧基、酚羟基、醌基等官能团的泥炭腐殖酸又可分级为黄腐殖酸、棕腐殖酸和黑腐殖酸。黄腐殖酸分子量较小，活性官能团较多。

上世纪80-90年代北京海淀医院、同仁医院、黑龙江中医药大学附属医院、海军总医院和云南一平浪煤矿医院等，已有用泥炭、褐煤的腐殖酸用于临床试验的数据（摘自：成绍鑫，2007年化学工业出版社，腐植酸物质概论），近几年也有相关的报道是关于腐殖酸用于胃粘膜保健、辅助治疗烫伤，口疮炎，小鼠造血系统障碍，对免疫反应和甲状腺功能的影响，以及用于抗HIV、癌症实验治疗的研究。但是由于黄腐殖酸结构的不确定性，造成了黄腐殖酸活性组分作为医药应用的瓶颈。

在现有技术中，由于煤地质演变程度不同，造成矿化、风化过程后泥炭、褐煤和风化煤中含腐殖酸量的不同，现有分离黄腐殖酸的技术不能满足分离的要求。黄腐殖酸的分离始终是技术难点。

现有技术中，分离黄腐殖酸的工艺一般是从水溶和酸溶性的黄腐殖酸、醇溶性的棕腐酸以及碱溶酸析性的黑腐酸中分离，离子交换树脂精制等。上述各方法普遍存在黄腐殖酸的提取量较少且分离得到的黄腐殖酸的纯度不高的缺陷。并且，上述方法中，低沸点的酮是不能用于制备药用级黄腐酸的，醇溶剂也存在挥发损失大，离子交换树脂精制过程树脂易污染、废水量大、不易工业化。

专利ZL02158189.4（中国农业大学）以褐煤、风化煤及煤矸石为原料，采用微生物降解生产黄腐酸（黄腐殖酸）的方法，不产生污染环境的二次废料，经7-9天的发酵，产量比化学法高，但是该专利的原料不是泥炭，并且还存在发酵时间长，产品纯度低。这些缺陷，都极大地制约了黄腐殖酸分离及应用技术的发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中黄腐殖酸的分离工艺中提取量较少，分离得到的黄腐殖酸的纯度不高，低沸点的醇溶剂挥发损失大，离子交换树脂精制过程树脂易污染，废水量大，不易工业化生产，而微生物降解的方法发酵时间长，产品纯度低等诸多缺陷，提供一种提取制备泥炭黄腐殖酸的方法及医药用途。本发明的提取制备黄腐殖酸的方法，节能减排，避免了工艺过程中的高温、高压、需要加入酸碱等溶剂或者在离子交换精制中产生酸碱废水的问题，无污染，操作简便，能够分离得到大量的黄腐殖酸，且得到的包括黄腐殖酸在内的有效物质的纯度达98%以上，分离的得到的黄腐殖酸中富含糖苷、氨基酸和核苷酸等物质。

本案中，所述的黄腐殖酸又名黄腐植酸。

本发明的目的在于，提供一种泥炭黄腐殖酸的提取方法；所述的提取方法为方法A、方法B和方法C中任一种；

所述的方法A包括以下步骤：

将泥炭的水溶液、极端嗜热菌、嗜压菌、嗜盐菌、嗜碱菌和嗜酸菌混合均匀，依次保持第一处理条件1-2天，第二处理条件1-3天和第三处理条件1-2天，去除杂质，脱水，即可；

所述的方法B包括以下步骤：

（1）将泥炭的水溶液、极端嗜热菌、嗜压菌、嗜盐菌和嗜碱菌混合均匀，保持第一处理条件1-2天，再保持第二处理条件1-3天，得泥炭-菌的混合液；

（2）将步骤（1）中所述的泥炭-菌的混合液与嗜酸菌混合均匀，保持第三处理条件1-2天，去除杂质，脱水，即可；

所述的方法C包括以下步骤：

（1）将泥炭的水溶液、极端嗜热菌和嗜压菌混合均匀，保持第一处理条件1-3天，再与嗜盐菌和嗜碱菌混合均匀，保持第二处理条件1-3天，得泥炭-菌的混合液；

（2）将步骤（1）中所述的泥炭-菌的混合液与嗜酸菌混合均匀，保持第三处理条件1-2天，去除杂质，脱水，即可；

其中，所述的第一处理条件为：温度10-130℃和压力0.05-0.18MPa；所述的第二处理条件为：温度5-75℃和压力0.05-0.12MPa；所述的第三处理条件为：温度5-65℃和压力0.05-0.12MPa；

所述的极端嗜热菌的添加量为3-13CFU/g泥炭；所述的嗜压菌的添加量为5-11CFU/g泥炭；所述的嗜盐菌的添加量为6-12CFU/g泥炭；所述的嗜碱菌的添加量为7-13CFU/g泥炭；所述的嗜酸菌的添加量为3-10CFU/g泥炭；所述的极端嗜热菌、嗜压菌、嗜盐菌、嗜碱菌和嗜酸菌均为处于对数期的菌株。

以下针对上述内容做进一步的说明：

本发明中，所述的对数期的各菌株的培养方法为：将各菌株置于培养基中培养至对数生长期，即可；其中，所述的培养基包括：黄腐殖酸2-10g、琼脂粉1-10g、蛋白胨1-5g和去离子水200-1000mL；所述的培养的温度较佳地为10-38℃，更佳地为38℃；所述的培养的压力较佳地为0.09-0.102MPa，更佳地为0.1MPa；所述的培养较佳地为震荡驯化培养，所述的振荡培养的震荡速度较佳地为60-300rpm，更佳地为300rpm；所述的各菌株培养至对数期后，较佳地按10倍体积扩增，所述的扩增时的培养基为本领域常规的培养基，所述的扩增时的培养基较佳地包括：黄腐殖酸2-10g、琼脂粉1-10g、蛋白胨1-5g和去离子水200-1000mL；所述的扩增较佳地在种子罐中进行；所述的扩增较佳地为按I、II、III三级扩增。所述的扩增后，菌株即可使用。

本发明中，所述的泥炭较佳地包括：20%-60%的有机物、0%-10%的矿物质、0%-10%的无机物、0%-5%的重金属和15%-80%的水，所述百分比为占泥炭的质量百分比；其中，所述的有机物主要包括2%-15%的纤维素、1%-10%的半纤维素、1%-15%的木质素、15%-55%的腐殖酸和1%-5%的沥青，所述百分比为占所述的有机物的质量百分比；所述的无机物主要包括：5%-20%的粘土、25%-40%的石英和10%-20%的矿物杂质，所述百分比为占所述无机物的质量百分比。所述的泥炭较佳地为云南石屏泥炭、四川若尔盖泥炭、黑龙江桦林泥炭和吉林敦化泥炭中的一种或多种，更佳地为云南石屏泥炭。

本发明中，所述的泥炭的粒径较佳地为60-200目，更佳地为60-80目。所述的泥炭的水溶液中的水溶液较佳地为去离子水。所述的泥炭的水溶液中的泥炭与水的质量比较佳地为（1:2）-（1:10），更佳地为（1:5）-（1:10）。

按照本领域常规，本发明中，所述的极端嗜热菌为最适生长温度在65℃以上，最低生长温度在40℃以上的微生物。所述的极端嗜热菌为本领域常规的极端嗜热菌，较佳地包括栖热袍菌（Thermotoga）、热棒菌（Pyrobaculum）和丁醇栖高温菌（Hyperthermus）中的一种或多种。所述的极端嗜热菌的添加量较佳地为每克泥炭添加6-10CFU。

本发明中，所述的嗜压菌为本领域常规的嗜压菌，较佳地包括固氮螺菌（A.brasilense）、屈桡杆菌（Flexibacter）、生孢食纤维菌（Sporocytophaga）和圆杆菌（Cyclobacterium）中的一种或多种，更佳地为固氮螺菌（A.brasilense）。

按照本领域常规，本发明中，所述的嗜盐菌为在盐浓度下能够生长的更好的一类微生物。所述的嗜盐菌为本领域常规的嗜盐菌，较佳地包括极端嗜盐菌、中度嗜盐菌和轻度嗜盐菌中的一种或多种；其中，所述的极端嗜盐菌（也称古细菌）较佳地为盐厌氧杆菌（Haloanaerobiaceae）、极端嗜盐古生菌（Halobacterium salinarum）和外硫红螺菌（Ectothiorhodospira）中的一种或多种；所述的中度嗜盐菌较佳地为副球菌（Paracoccus halodenitrificaus）；所述的轻度嗜盐菌较佳地为放线菌（Actinomyces）、青霉菌（Penicillium）和曲霉菌（Aspergillus）中的一种或多种。

按照本领域常规，本发明中，所述的嗜碱菌为在生活在碱湖（地）、盐碱湖（地）等碱性环境以及高碳酸土壤环境的微生物。所述的嗜碱菌较佳地包括中度嗜碱菌和/或轻度嗜碱菌；其中，所述的中度嗜碱菌较佳地为肠球菌（Strepoccus faecalis）和/或芽孢杆菌（Bacillus spp）；所述的轻度嗜碱菌较佳地为芽孢杆菌（Bacillus firmus RAB）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）和/或环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）中的一种或多种。所述的嗜碱菌的添加量较佳地为每克泥炭添加7-13CFU。

按照本领域常规，本发明中，所述的嗜酸菌为能生活在pH0.7-4的酸性环境的微生物。所述的嗜酸菌为本领域常规的嗜酸菌，较佳地包括极端嗜酸菌、中度嗜酸菌和轻度嗜酸菌中的一种或多种；其中，所述的极端嗜酸菌较佳地为古生硫酸还原菌（sulfate reducing bacteria）和/或疣微菌（Verrucomicrobia)；所述的中度嗜酸菌较佳地为喜温硫杆菌（Thiobacilluscaldus）、嗜酸杆菌（Acidiphillum ferrooxida）和脂环酸芽孢杆菌（Alcyclobacillus）中的一种或多种；所述的轻度嗜酸菌较佳地为嗜乳酸杆菌（T.acidophilus）和嗜酸化能异养菌（A.organovorum）。

本发明中，所述的第一处理条件中的温度较佳地为30-110℃。

本发明中，所述的第一处理条件中的压力较佳地为0.07-0.15MPa。

本发明中，所述的第二处理条件中的温度较佳地为10-70℃。

本发明中，所述的第二处理条件中的压力较佳地为0.09-0.11MPa。

本发明中，所述的混合均匀的方法为本领域常规的方法；所述的混合均匀的方法较佳地为将菌株以0.5-2L/h的流速流入泥炭的水溶液中，更佳地将菌株以0.5-1L/h的流速流入泥炭的水溶液中。本发明中，所述的将泥炭的溶液、极端嗜热菌和嗜压菌混合均匀后，较佳地保持第一处理条件2-3天。

本发明中，在所述的第二处理条件下，混合体系中的pH较佳地为pH6.0-12.0，更佳地为pH7.0-12.0。

本发明中，所述的第三处理条件的温度较佳地为15-60℃。

本发明中，所述的第三处理条件的压力较佳地为0.10MPa。

本发明中，较佳地，在所述的第三处理条件下，混合体系中的pH较佳地为pH4.0-7.5。

本发明中，所述的杂质一般为菌丝体和/或游离盐。所述的去除杂质的方法较佳地为微孔过滤；较佳地，在所述的微孔过滤后，还进行超滤和/或纳滤。所述的微孔过滤的压力较佳地为0.7-6.5Kpa，所述的微孔过滤的滤膜的孔径较佳地为0.2-10um；所述的超滤的截取分子量较佳地为1500-6500Dr；所述的超滤的滤膜的孔径较佳地为50-50000um；所述的纳滤的截取分子量较佳地为200-1000Dr。所述的纳滤的压力较佳地为0.10-0.28MPa。

所述的脱水较佳地为经LGJ-25C冷冻干燥机脱水；所述的脱水的时间较佳地为5-36h。所述的脱水后即可得到黄腐殖酸干粉。

本发明的目的之二在于，提供所述的泥炭黄腐殖酸的提取方法提取制得的黄腐殖酸。本发明中，较佳地，所述的黄腐殖酸中包括糖苷、氨基酸和核苷酸等物质；较佳地，所述的糖苷的含量为1-5%，所述的氨基酸的含量为2-7%，所述的核苷酸的含量为3-8%；所述百分比为占总量的质量百分比。

本发明的目的之三在于，提供所述的黄腐殖酸在制备治疗胃溃疡、关节炎、肿瘤、白血病或免疫力低下的药物中的应用。较佳的，所述的黄腐殖酸经分子柔性衍接修饰后，再在制备所述的药物中应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的黄腐殖酸的分离方法节能减排，避免了工艺过程中的高温、高压、需要加入酸碱等溶剂或者在离子交换精制中产生酸碱废水的问题，无污染，操作简便，能够分离得到大量的黄腐殖酸，且得到的包括黄腐殖酸在内的有效物质的纯度达98%以上，黄腐殖酸的含量达80%以上，分离的得到的黄腐殖酸中富含糖苷、氨基酸和核苷酸等物质。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中，以下实施例中的极端嗜热菌、嗜压菌、嗜盐菌、嗜碱菌和嗜酸菌可按照本领域常规的提取方法提取，或者购买得到。

下述实施例中，各细菌的提取方法参考以下专利文件：

极端嗜热菌的提取方法参考：ZL200910093084.7处理稠油污水的方法及嗜热菌在该方法中的应用；嗜压菌的提取方法参考：中国专利申请201210049773.X哈氏噬纤维菌的电转化方法；嗜盐菌的提取方法参考：中国专利申请200610010486.2一种快速高效筛选嗜盐菌的方法；嗜碱菌的提取方法参考：中国专利申请201010599724.4一种来自极端嗜碱菌的β-葡萄糖苷酶基因及其合成、表达和纯化；嗜酸菌的提取方法参考：中国专利申请201010611798.5柠檬酸及其盐类中耐热嗜酸菌的检测方法。

嗜酸菌也可以市售得到，购买厂家为杰能科（中国）生物工程有限公司。

实施例1

一种提取制备泥炭黄腐殖酸的方法；

本实施例中的泥炭为云南石屏泥炭；泥炭的水溶液中的泥炭与水的质量比为1:5；使用的菌种如下表所示：

所述的提取方法包括以下步骤：

（1）将各菌株置于培养基中培养至对数生长期；培养基包括：黄腐殖酸10g、琼脂粉10g、蛋白胨5g、去离子水1000mL；在38℃、压力0.1MPa条件下，以300rpm的震荡速度震荡驯化培养，培养至对数期后，按I、II、III三级进行10倍体积扩增，扩增时的培养基包括：黄腐殖酸10g、琼脂粉5g、蛋白胨5g、去离子水1000mL；

（2）将极端嗜热菌、嗜压菌、嗜盐菌、嗜碱菌和嗜酸菌（杰能科（中国）生物工程有限公司）以1L/h的流速流入泥炭的水溶液中，在温度50℃和压力0.1MPa下提取6天；

（3）经过微孔过滤超滤和纳滤去除杂质（菌丝体和/或游离盐），经LGJ-25C冷冻干燥机脱水15h，即可；其中，微孔过滤的压力为6.5Kpa，微孔的孔径为10um，超滤的滤膜的孔径为5000um，纳滤的压力为0.10-0.28MPa。

实施例2

一种提取制备泥炭黄腐殖酸的方法；

本实施例中的泥炭为四川若尔盖泥炭；泥炭的水溶液中的泥炭与水的质量比为1:10；使用的菌种如下表所示：

所述的提取方法包括以下步骤：

（1）将各菌株置于培养基中培养至对数生长期；其中，所述的培养基包括：黄腐殖酸10g、琼脂粉10g、蛋白胨5g、去离子水1000mL；在35℃、压力0.1MPa条件下，以300rpm的震荡速度震荡驯化培养，培养至对数期后，在种子罐中，按I、II、III三级，进行10倍体积扩增，扩增时的培养基包括：黄腐殖酸10g、琼脂粉10g、蛋白胨5g、去离子水1000mL；

（2）将极端嗜热菌、嗜压菌、嗜盐菌、嗜碱菌和嗜酸菌以1L/h的流速流入泥炭的水溶液中，在50℃和压力0.1MPa条件下提取6天；

（3）经过微孔过滤超滤和纳滤去除杂质（菌丝体和/或游离盐），经LGJ-25C冷冻干燥机脱水10h，即可；其中，微孔过滤的压力为1Kpa，微孔的孔径为10um，超滤的滤膜的孔径为1000um，纳滤的截取分子量为600Dr，纳滤的压力为0.2MPa。

实施例3

一种提取制备泥炭黄腐殖酸的方法；

本实施例中的泥炭为黑龙江桦林泥炭，泥炭的水溶液中的泥炭与水的质量比为1:2；使用的菌种如下表所示：

所述的提取方法包括以下步骤：

（1）将各菌株置于培养基中培养至对数生长期；其中，所述的培养基包括：黄腐殖酸10g、琼脂粉1-10g、蛋白胨5g、去离子水1000mL；在35℃38℃、压力0.1MPa条件下，以300rpm的震荡速度震荡驯化培养，培养至对数期后，在种子罐中，按I、II、III三级，进行10倍体积扩增；

（2）将极端嗜热菌、嗜压菌、嗜盐菌、嗜碱菌和嗜酸菌以1L/h的流速流入泥炭的水溶液中，在50℃、压力0.1MPa条件下提取6天；

（3）经过微孔过滤超滤和纳滤去除杂质（菌丝体和/或游离盐），经LGJ-25C冷冻干燥机脱水5h，即可；其中，微孔过滤的压力为1Kpa，微孔的孔径为10um，超滤的节流分子量为1500Dr，纳滤的截取分子量为600Dr，纳滤的压力为0.2MPa。

实施例4

一种提取制备泥炭黄腐殖酸的方法；

本实施例中的泥炭为吉林敦化泥炭；泥炭的水溶液中的泥炭与水的质量比为1:5；使用的菌种如下表所示：

所述的提取方法包括以下步骤：

（1）将各菌株置于培养基中培养至对数生长期；其中，所述的培养基包括：黄腐殖酸2g、琼脂粉10g、蛋白胨5g、去离子水200mL；在38℃、压力0.09MPa条件下，以60rpm的震荡速度震荡驯化培养，培养至对数期后，在种子罐中，按I、II、III三级，进行10倍体积扩增，扩增时的培养基包括：黄腐殖酸2g、琼脂粉10g、蛋白胨5g、去离子水200mL；

（2）将极端嗜热菌、嗜压菌、嗜盐菌和嗜碱菌以1L/h的流速流入泥炭的水溶液中，保持第一处理条件2天，再保持第二处理条件3天，得泥炭-菌的混合液；第二处理条件下，混合体系中的pH为pH7.0-12.0；

（3）将嗜酸菌以1L/h的流速流入步骤（2）中所述的泥炭-菌的混合液中，保持第三处理条件1-2天，在所述的第三处理条件下，混合体系中的pH为pH4.0-7.5；

(4)去除杂质，经LGJ-25C冷冻干燥机脱水36h，即可；去除杂质的方法为：在1Kpa压力下，微孔过滤，微孔的孔径为0.2-10um，再经过超滤和纳滤，超滤的滤膜的孔径为1000um，纳滤的截取分子量为200Dr，纳滤的压力为0.10MPa。

其中，所述的第一处理条件为：温度30℃和压力0.07MPa；所述的第二处理条件为：温度70℃和压力0.11MPa a；所述的第三处理条件为：温度15和压力0.10MPa。

实施例5

一种提取制备泥炭黄腐殖酸的方法；

本实施例中的泥炭的成分包括（百分比为占泥炭的质量百分比）：60%的有机物、10%的矿物质、10%的无机物、5%的重金属和水；其中，有机物包括（百分比为占有机物的质量百分比）：15%的纤维素、10%的半纤维素、1%的木质素、55%的腐殖酸和1%的沥青；无机物包括（百分比为占无机物的质量百分比）：5%的粘土、25%的石英和20%的矿物杂质；泥炭的粒径为60目，泥炭的水溶液中的泥炭与水的质量比为1:5。

本实施例中，使用的菌种如下表所示：

所述的提取方法包括以下步骤：

（1）将各菌株置于培养基中培养至对数生长期；其中，所述的培养基包括：黄腐殖酸2g、琼脂粉10g、蛋白胨5g、去离子水500mL；在10℃、压力0.09MPa条件下，以100rpm的震荡速度震荡驯化培养，培养至对数期后，在种子罐中，按I、II、III三级，进行10倍体积扩增，扩增时的培养基包括：黄腐殖酸2g、琼脂粉5g、蛋白胨3g、去离子水400mL；

（2）将极端嗜热菌、嗜压菌、嗜盐菌和嗜碱菌以1L/h的流速流入泥炭的水溶液中，保持第一处理条件1天，再保持第二处理条件3天，得泥炭-菌的混合液；第二处理条件下，混合体系中的pH为pH12.0；

（3）将嗜酸菌以1L/h的流速流入步骤（2）中的泥炭-菌的混合液中，保持第三处理条件2天，在所述的第三处理条件下，混合体系中的pH为pH7.5；

（4）去除杂质，经LGJ-25C冷冻干燥机脱水12h，即可；去除杂质的方法为：在6.5Kpa压力下，微孔过滤，微孔的孔径为2um，再经过超滤，超滤的截取分子量为1500Dr。

其中，所述的第一处理条件为：温度30℃和压力0.07MPa；所述的第二处理条件为：温度10℃和压力0.11MPa a；所述的第三处理条件为：温度15℃和压力0.10MPa。

实施例6

一种提取制备泥炭黄腐殖酸的方法；

本实施例中的泥炭的成分包括：20%的有机物、10%的矿物质、5%的重金属和15%-80%的水；其中，有机物包括2%的纤维素、10%的半纤维素、1%的木质素、55%的腐殖酸和1%的沥青；泥炭的粒径为80目；泥炭的水溶液中的泥炭与水的质量比为1:10。

本实施例中，使用的菌种如下表所示：

所述的提取方法包括以下步骤：

（1）将各菌株置于培养基中培养至对数生长期；其中，所述的培养基包括：黄腐殖酸5g、琼脂粉5g、蛋白胨3g、去离子水1000mL；在38℃、压力0.102MPa条件下，以60rpm的震荡速度震荡驯化培养，培养至对数期后，在种子罐中，按I、II、III三级，进行10倍体积扩增，扩增时的培养基包括：黄腐殖酸2g、琼脂粉10g、蛋白胨5g、去离子水400mL；

（2）将极端嗜热菌和嗜压菌以1L/h的流速流入泥炭的水溶液中，保持第一处理条件2天，再将嗜盐菌和嗜碱菌以1L/h的流速流入，保持第二处理条件3天，得泥炭-菌的混合液；

（3）将步骤（2）中的嗜酸菌以1L/h的流速流入步骤（2）中的泥炭-菌的混合液中，保持第三处理条件2天；

（4）去除杂质（菌丝体和/或游离盐），经LGJ-25C冷冻干燥机脱水12h，即可；去除杂质的方法为：在6.5Kpa压力下，微孔过滤，微孔的孔径为50um，再经过超滤和纳滤，超滤的滤膜的孔径为50000um，纳滤的滤膜的截取分子量为1000Dr，纳滤的压力为0.1MPa；

其中，所述的第一处理条件为：温度110℃和压力0.18MPa；所述的第二处理条件为：温度70℃和压力0.09MPa a；所述的第三处理条件为：温度15℃和压力0.05MPa。

实施例7

使用的菌种如下表所示：

其余原料、方法和步骤同实施例1。

实施例8

使用的菌种如下表所示：

其余原料、方法和步骤同实施例2。

实施例9

取实施例1-6的方法提取得到的黄腐殖酸与氨基酸分子柔性衍接，螯合Se元素后，用于制备治疗胃溃疡、关节炎、肿瘤、白血病或免疫力低下的药物。

实验方法：取实施例1-6的方法提取得到的黄腐殖酸，利用DNA基本结构单元核苷酸（单链上碱基不受配对的限制），通过艾姆氏试验(Ames test)，完成酶切、交换、整合等修饰程序后，制备治疗胃溃疡、关节炎、肿瘤、白血病或免疫力低下的药物。

对比例1

第一处理条件为：温度5℃；其余同本发明实施例5。

对比例2

第一处理条件为：压力0.3MPa；其余同本发明实施例5。

对比例3

第二处理条件为：温度80℃，压力20MPa；其余同本发明实施例5。

对比例4

所述的第三处理条件为：温度75℃，压力0.15MPa；其余同本发明实施例5。

对比例5

极端嗜热菌的添加量为18CFU/g泥炭；其余同本发明实施例5。

对比例6

嗜酸菌的添加量为3-10CFU/g泥炭；其余同本发明实施例5。

效果实施例1

黄腐殖酸的纯度的检测。

取实施例1-6制得的黄腐殖酸，进行纯度的检测。此处的有效物质纯度为黄腐殖酸、糖苷、氨基酸和核苷酸的含量之和占总量的质量百分比。

黄腐殖酸的含量的检测方法参考：腐植酸产品分析及标准，李善祥，化学工业出版社，2007年出版。

糖苷含量的检测方法参考：甜菊糖苷化学分析法研究概况，常丽娟，王竹天，杨大进，国外医学（卫生学分册）2007，3

氨基酸含量的检测方法参考：国标GB/T18246-2000

核苷酸含量的检测方法参考：MM HS CNG0116化学试剂—核苷酸含量测定—通则

检测结果如下表所示：

由上表可知：本发明的提取方法提取得到的黄腐殖酸的纯度高，且有效成分中含有黄腐殖酸、糖苷、氨基酸和核苷酸，而不在本发明限定范围内的条件，得到的产品的纯度低，远比不在本发明的提取方法得到的产品。

Claims (10)

1.一种泥炭黄腐殖酸的提取方法，其特征在于：所述的提取方法为方法A、方法B和方法C中任一种；

所述的方法A包括以下步骤：

将泥炭的水溶液、极端嗜热菌、嗜压菌、嗜盐菌、嗜碱菌和嗜酸菌混合均匀，依次保持第一处理条件1-2天，第二处理条件1-3天和第三处理条件1-2天，去除杂质，脱水，即可；

所述的方法B包括以下步骤：

（1）将泥炭的水溶液、极端嗜热菌、嗜压菌、嗜盐菌和嗜碱菌混合均匀，保持第一处理条件1-2天，再保持第二处理条件1-3天，得泥炭-菌的混合液；

（2）将步骤（1）中所述的泥炭-菌的混合液与嗜酸菌混合均匀，保持第三处理条件1-2天，去除杂质，脱水，即可；

所述的方法C包括以下步骤：

（1）将泥炭的水溶液、极端嗜热菌和嗜压菌混合均匀，保持第一处理条件1-3天，再与嗜盐菌和嗜碱菌混合均匀，保持第二处理条件1-3天，得泥炭-菌的混合液；

（2）将步骤（1）中所述的泥炭-菌的混合液与嗜酸菌混合均匀，保持第三处理条件1-2天，去除杂质，脱水，即可；

其中，所述的第一处理条件为：温度10-130℃和压力0.05-0.18MPa；所述的第二处理条件为：温度5-75℃和压力0.05-0.12MPa；所述的第三处理条件为：温度5-65℃和压力0.05-0.12MPa；

所述的极端嗜热菌的添加量为3-13CFU/g泥炭；所述的嗜压菌的添加量为5-11CFU/g泥炭；所述的嗜盐菌的添加量为6-12CFU/g泥炭；所述的嗜碱菌的添加量为7-13CFU/g泥炭；所述的嗜酸菌的添加量为3-10CFU/g泥炭；所述的极端嗜热菌、嗜压菌、嗜盐菌、嗜碱菌和嗜酸菌均为处于对数期的菌株。

2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述的混合均匀的方法为将菌株以0.5-2L/h的流速流入泥炭的水溶液中，较佳地为将菌株以0.5-1L/h的流速流入泥炭的水溶液中。

3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述的第一处理条件中的温度为30-110℃；所述的第一处理条件中的压力为0.07-0.15MPa；所述的将泥炭的溶液、极端嗜热菌和嗜压菌混合均匀后，保持第一处理条件2-3天；

所述的第二处理条件中的温度为10-70℃；所述的第二处理条件中的压力为0.09-0.11MPa；在所述的第二处理条件下，混合体系中的pH较佳地为pH6.0-12.0，更佳地为pH7.0-12.0；

所述的第三处理条件的温度为15-60℃；所述的第三处理条件的压力为0.10MP；在所述的第三处理条件下，混合体系中的pH较佳地为pH4.0-7.5。

4.如权利要求1-3中任一项所述的提取方法，其特征在于：所述的对数期的各菌株的培养方法为：将各菌株置于培养基中培养至对数生长期，即可；其中，所述的培养基包括：黄腐殖酸2-10g、琼脂粉1-10g、蛋白胨1-5g和去离子水200-1000mL；所述的培养的温度较佳地为10-38℃，更佳地为38℃；所述的培养的压力较佳地为0.09-0.102MPa，更佳地为0.1MPa；所述的培养较佳地为震荡驯化培养，所述的振荡培养的震荡速度较佳地为60-300rpm，更佳地为300rpm；所述的各菌株培养至对数期后，较佳地按10倍体积扩增；所述的扩增时的培养基较佳地包括：黄腐殖酸2-10g、琼脂粉1-10g、蛋白胨1-5g和去离子水200-1000mL；所述的扩增较佳地在种子罐中进行；所述的扩增较佳地为按I、II、III三级扩增。

5.如权利要求1-3中任一项所述的提取方法，其特征在于：所述的泥炭包括：20%-60%的有机物、0%-10%的矿物质、0%-10%的无机物、0%-5%的重金属和15%-80%的水，所述百分比为占泥炭的质量百分比；其中，所述的有机物主要包括2%-15%的纤维素、1%-10%的半纤维素、1%-15%的木质素、15%-55%的腐殖酸和1%-5%的沥青，所述百分比为占所述的有机物的质量百分比；所述的无机物包括：5%-20%的粘土、25%-40%的石英和10%-20%的矿物杂质，所述百分比为占所述无机物的质量百分比；

所述的泥炭的粒径较佳地为60-200目，更佳地为60-80目；所述的泥炭的水溶液中的水溶液较佳地为去离子水；所述的泥炭的水溶液中的泥炭与水的质量比较佳地为（1:2）-（1:10），更佳地为（1:5）-（1:10）。

6.如权利要求1-3中任一项所述的提取方法，其特征在于：

所述的极端嗜热菌包括栖热袍菌（Thermotoga）、热棒菌（Pyrobaculum）和丁醇栖高温菌（Hyperthermus）中的一种或多种；所述的极端嗜热菌的添加量较佳地为每克泥炭添加6-10CFU；

所述的嗜压菌包括固氮螺菌（A.brasilense）、屈桡杆菌（Flexibacter）、生孢食纤维菌（Sporocytophaga）和圆杆菌（Cyclobacterium）中的一种或多种；

所述的嗜盐菌包括极端嗜盐菌、中度嗜盐菌和轻度嗜盐菌中的一种或多种；其中，所述的极端嗜盐菌为盐厌氧杆菌（Haloanaerobiaceae）、极端嗜盐古生菌（Halobacterium salinarum）和外硫红螺菌（Ectothiorhodospira）中的一种或多种；所述的中度嗜盐菌为副球菌（Paracoccus halodenitrificaus）；所述的轻度嗜盐菌为放线菌（Actinomyces）、青霉菌（Penicillium）和曲霉菌（Aspergillus）中的一种或多种。

7.如权利要求1-3中任一项所述的提取方法，其特征在于：

所述的嗜碱菌包括中度嗜碱菌和/或轻度嗜碱菌；其中，所述的中度嗜碱菌为肠球菌（Strepoccus faecalis）和/或芽孢杆菌（Bacillus spp）；所述的轻度嗜碱菌较佳地为芽孢杆菌（Bacillus firmus RAB）、蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）和环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）中的一种或多种；所述的嗜碱菌的添加量较佳地为每克泥炭添加7-13CFU；

所述的嗜酸菌包括极端嗜酸菌、中度嗜酸菌和轻度嗜酸菌中的一种或多种；其中，所述的极端嗜酸菌为古生硫酸还原菌（sulfate reducing bacteria）和/或疣微菌（Verrucomicrobia)；所述的中度嗜酸菌为喜温硫杆菌（Thiobacillus caldus）、嗜酸杆菌（Acidiphillum ferrooxida）和脂环酸芽孢杆菌（Alcyclobacillus）中的一种或多种；所述的轻度嗜酸菌为嗜乳酸杆菌（T.acidophilus）和/或嗜酸化能异养菌（A.organovorum）。

8.如权利要求1-3中任一项所述的提取方法，其特征在于：所述的杂质为菌丝体和/或游离盐；所述的去除杂质的方法为微孔过滤；较佳地，在所述的微孔过滤后，还进行超滤和/或纳滤；所述的微孔过滤的压力较佳地为0.7-6.5Kpa，所述的微孔过滤的滤膜的孔径较佳地为0.2-10um；所述的超滤的截取分子量较佳地为1500-6500Dr；所述的超滤的滤膜的孔径较佳地为50-50000um；所述的纳滤的截取分子量较佳地为200-1000Dr；所述的纳滤的压力较佳地为0.10-0.28MPa；所述的脱水的时间较佳地为5-36h。

9.如权利要求1-8中任一项所述的提取方法提取制得的黄腐殖酸；较佳地，所述的黄腐殖酸中包括糖苷、氨基酸和核苷酸；较佳地，所述的糖苷的含量为1-5%，所述的氨基酸的含量为2-7%，所述的核苷酸的含量为3-8%；所述百分比为占总量的质量百分比。

10.如权利要求9所述的黄腐殖酸在制备治疗胃溃疡、关节炎、肿瘤、白血病或免疫力低下的药物中的应用；较佳地，所述的黄腐殖酸经分子柔性衍接修饰后，再在制备所述的药物中应用。