CN103588820B

CN103588820B - 一种叶酸-镍配位聚合物纳米管及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103588820B
Application number: CN201310413983.7A
Authority: CN
Inventors: 徐正; 王越
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2033-09-11
Also published as: CN103588820A

Abstract

本发明提供了一种叶酸-镍配位聚合物纳米管，其化学式为Ni₂(FA)(N₂H₄)₃(H₂O)₂(OH^-)₂。其中，所述叶酸-镍配位聚合物纳米管由镍离子、叶酸和水合肼形成配合物，叶酸分子间的氢键和水合肼分子的桥联作用形成纳米管，所述叶酸-镍配位聚合物纳米管的长度为50～300nm、内径为5～8nm、壁厚为4～7nm。该叶酸-镍配位聚合物纳米管（CPNTs）自身具有良好的体外抗肿瘤活性，且具有较大的空腔可物理装载多种类型的抗肿瘤药物，能够特异性识别表面具有高水平叶酸受体表达的细胞，在肿瘤靶向治疗中具有潜在的应用前景。

Description

一种叶酸-镍配位聚合物纳米管及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于配位化学领域，特别涉及一种叶酸-镍配位聚合物纳米管，还涉及该叶酸-镍配位聚合物纳米管的制备方法，还涉及该叶酸-镍配位聚合物纳米管在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

碳纳米管（CNTs）作为纳米药物载体是近年来国内外研究的热点。但是CNTs的生物安全性问题也引起了人们足够的重视，由于碳纳米管具有高的强度和韧性、强的表面疏水性、在细胞中易聚集、不能生物降解等特点，因此会对细胞产生毒副作用。此外，它的给药缺乏专一性等问题严重限制了它在药物载体领域的应用。基于此，人们考虑对其进行功能化修饰以提高靶向性同时降低毒副作用。功能化的CNTs改善了给药的靶向性，但它的载药和释药行为仍难以调控。因此，开发理想的靶向给药系统仍是纳米医药领域的一大挑战。

随着在分子水平上的深入研究，人们发现在肿瘤细胞表面或肿瘤相关血管表面的一系列受体与肿瘤生长增殖密切相关，并在肿瘤组织过度表达。这种肿瘤特异性的受体为肿瘤治疗提供了靶点。研究证实叶酸受体(folatereceptor，FR)在正常组织中的表达高度保守，但在大部分恶性肿瘤中，如卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、乳腺癌、鼻咽癌等均高度或过度表达。叶酸受体收集胞外叶酸或叶酸衍生物，通过内化方式将其带入细胞，是介导叶酸进入细胞的主要途径。叶酸受体介导的靶向给药系统正是利用肿瘤细胞和正常细胞表面FR表达的差异性，通过给药系统的叶酸与肿瘤细胞表面高表达的FR的特异性结合，来实现叶酸结合物的靶向传递，从而减少药物治疗癌症时对正常细胞的损害。

叶酸(FA)的分子质量小、无免疫原性、价廉易得、稳定性好，易于与其它基团进一步进行化学键合。细胞可通过FR介导的内吞作用将FA与药物分子的结合物吸收入胞内。在FA-药物分子结合物中，FA通过谷氨酸残基中的羧酸与药物分子结合。FA中的蝶酸残基不受影响，因此FA-药物分子结合物与细胞表面FR的亲和力基本保持不变，即FR对FA与药物分子通过化学键形成的复合物仍具有高度亲和性。肿瘤细胞表面的FR与以FA复合物为主体的递药系统结合后，细胞膜即发生内陷，FR与FA结合物形成细胞内涵体小泡而被内吞入胞内，在内涵体的酸化作用下，FA-药物分子结合物从FR中释放出来，并进而逸出内涵体，将药物释放在细胞质内，而FR又重新回到细胞膜表面。这样，递药系统既可一定程度上克服某些小分子药物因极性导致的跨膜受阻，又能使得药物选择性攻击肿瘤细胞，实现了针对特定部位病变细胞的靶向递药，从而避免对正常细胞的损伤。

近年来，研究较多的一般为叶酸-脂质体、叶酸-树枝状聚合物、叶酸-聚合物胶束、叶酸-纳米球等叶酸介导的肿瘤靶向给药体系，主要仍停留在对于各类载体表面的叶酸修饰。这类传统的叶酸类药物载体存在着一些弊端：修饰方法繁琐，不易制备；载体表面的叶酸含量影响靶向输送效果，需进行载体表面叶酸含量的调控；通常抗肿瘤药物分子通过化学键连接到叶酸分子上，一定程度上影响了药物的释放。更严重的是一个FA-药物分子结合物只能递送一个药物分子，不能一次达到杀死癌细胞所需的药物剂量，导致肿瘤细胞产生抗药性。

发明内容

发明目的：为了解决现有技术存在的不足，本发明的第一目的是提供一种叶酸-镍金属配位聚合物纳米管。

本发明的第二目的是提供上述叶酸-镍金属配位聚合物纳米管的制备方法。

本发明的第三目的在于提供上述叶酸-镍金属配位聚合物纳米管在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术方案：本发明提供的一种叶酸-镍配位聚合物纳米管，其化学式为Ni₂(FA)(N₂H₄)₃(H₂O)₂(OH^-)₂。

其中，所述叶酸-镍配位聚合物纳米管由镍离子、叶酸和水合肼形成配合物，叶酸分子间的氢键和水合肼分子的桥联作用形成纳米管。

CPNTs具有抗肿瘤活性，同时纳米管的叶酸骨架赋予了纳米管靶向癌细胞的给药功能，纳米管的管状结构赋予了纳米管的载药功能。

本发明还提供了上述叶酸-镍配位聚合物纳米管(CPNTs)的制备方法，包括以下步骤：

（1）将叶酸与镍盐分散于乙醇水溶液中，超声混合，得混浊液；

（2）将水合肼逐滴加入混浊液中，超声混合，得浆状液；

（3）将浆状液进行溶剂热反应，即得。

其中，步骤（1）中，所述镍盐优选为氯化镍，可选地，只要是可溶性镍盐均可以实现本发明目的；所述叶酸与镍盐的摩尔比为1:（1-3）；乙醇水溶液中，乙醇和水的体积比为3:（12-21）；叶酸的摩尔数与乙醇的体积之比为0.5mmol:（3-5）ml；超声时间为10-30min。

其中，步骤（2）中，所述水合肼的浓度为80-90%，水合肼与浑浊液的体积比为1：（7-10），超声时间为5-10min。

其中，步骤（3）中，反应温度为120-140℃，反应时间为2-12h。

本发明还提供了上述叶酸-镍配位聚合物纳米管(CPNTs)在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述应用，所述叶酸-镍配位聚合物纳米管(CPNTs)作为抗肿瘤药物及抗肿瘤活性化合物载体。

所述应用，具体包括以下步骤：将叶酸-镍配位聚合物纳米管加入至抗肿瘤活性化合物的水溶液中，黑暗条件下振荡后，超纯水透析、离心，收集得到的固体，洗涤，干燥，即制得的抗肿瘤药物。

其中，所述活性化合物为顺铂。

其中，所述活性化合物的水溶液的质量百分比浓度为65-75%；所述叶酸-镍配位聚合物纳米管与活性化合物的质量比为（40-50）:（20-50）。

其中，震荡时间为12-48h，透析时间为24-72h。

有益效果：本发明提供的叶酸-镍配位聚合物纳米管（CPNTs）自身具有良好的体外抗肿瘤活性，且具有较大的空腔可物理装载多种类型的抗肿瘤药物，能够特异性识别表面具有高水平叶酸受体表达的细胞，在肿瘤靶向治疗中具有广泛的应用前景。

本发明中的CPNTs经透射电镜检测，长度在50-300nm之间、内径为5-8nm,表面光滑、管口清晰，选区电子衍射(SAED)显示纳米管呈非晶态。经红外光谱表征，原叶酸配体的ν(C=O)消失，叶酸分子通过羧基与金属形成双齿配位。经光电子能谱(XPS)表征，Ni以二价离子形态存在，叶酸羧酸基团的两个氧原子均参与了与金属的配位。经紫外吸收光谱表征，Ni(II)位于八面体配位场中。利用同步辐射光源采集纳米管样品中Ni的近边X射线吸收精细结构谱(EXAFS)，表明六个配位原子分别是四个氧原子和两个氮原子，纳米管中Ni(II)的八面体空间构型得以确证。结合元素分析和质谱数据，最终确定纳米管的化学组成为[Ni₂(FA)(N₂H₄)₃(H₂O)₂(OH^-)₂]。

MTT实验表明CPNTs自身具有良好的体外抗肿瘤活性。作为药物载体装载抗肿瘤药物顺铂（CDDP）后，递药系统CDDP-CPNTs表现出更强的肿瘤细胞抑制活性。细胞透射电镜显示，纳米管可通过内吞机制进入HeLa细胞并定位于细胞质内。激光共聚焦扫描结果显示CPNTs载药体系能与HeLa细胞表面的叶酸受体FR发生特异性结合，并在胞质内释放药物进入细胞核。

具体而言，本发明中的叶酸-镍金属配位聚合物纳米管作为药物载体与现有各类药物载体相比，具有以下突出的优势：

1)稳定可控。该CPNTs结构新颖，制备方法简单可控、化学稳定性好。

2)载药量大。该叶酸-镍金属配位聚合物纳米管具有类似碳纳米管的空腔结构，形貌均一，药物装载方便，其管状结构赋予它可以填充各类药物分子作为药物载体，可通过物理包封装载不同类型的抗肿瘤药物，且载药量大。

3)靶向性好。该叶酸-镍金属配位聚合物构筑的纳米管，以生物分子叶酸作为基本骨架，对叶酸受体具有良好的亲和性，可最大限度地结合叶酸受体，从而特异性地结合肿瘤组织细胞，具有良好的叶酸受体靶向性。

4)安全有效。作为药物载体的CPNTs自身具有明显的体外抗肿瘤活性，可与装载的抗肿瘤药物协同发挥抗肿瘤作用。同时，CPNTs自身的体外抗肿瘤活性与顺铂相似，但毒付作用比顺铂小。载体进入癌细胞后释放药物，有利于在癌细胞内积聚高浓度的药物分子，增强抑制肿瘤细胞的效率，同时减小对正常细胞的伤害，增加用药安全性及有效性。

附图说明

图1为CPNTs的电镜照片：a:扫描电镜图(SEM),插图是局部放大图片；b:透射电镜图(TEM),显示有明显的管口；c:透射电镜图(TEM),显示出单根精美的管子；d:插图为选区电子衍射图（SAED），表明CPNTs为非晶态。

图2为CPNTs的紫外-可见漫反射光谱图。图中，横坐标为波长（nm），纵坐标为吸光度。图3为CPNTs的X射线光电子图谱。横坐标为电子结合能（eV），纵坐标为光电子的强度。图中，从左到右分别为C1s,N1s，O1s，Ni2p3/2和Ni2p1/2。

图4为碳元素的窄谱图。分峰拟合后，三个谱峰分别位于285.7,286.8和288.8eV。图5为氮元素的窄谱图。分峰拟合后，四个谱峰分别位于399.6,400.4,401.1和401.6eV。

图6为水合肼-镍配合物的氮元素的窄谱图。谱峰位于400.2eV。

图7为氧元素的窄谱图。分峰拟合后，四个谱峰分别位于531.6，532.1，532.5和533.2eV。

图8为用荧光物质罗丹明（RB）标记的不同浓度的CDDP-CPNTs与HeLa细胞共培养的荧光共聚焦扫描图。a：与0.9μg/mL罗丹明（RB）共培养4h；b:与2.5μg/mLRB-CDDP-CPNTs，共培养4h；c:与15μg/mLRB-CDDP-CPNTs，共培养4h；d:与20μg/mLRB-CDDP-CPNTs，共培养4h。

图9为CDDP-CPNTs与Hela细胞共培养24h后CPNTs在细胞内的定位分布图。在图9中，a:Hela细胞的TEM,未加药，作对照用；b:细胞边缘聚集的纳米管簇；c:细胞膜上附着的纳米管；d:细胞质内分散的纳米管载体。

具体实施方式

实施例1叶酸－镍金属配位聚合物纳米管的制备

1)将叶酸0.5mmol与NiCl₂.6H₂O1mmol分散于包括3ml乙醇和12ml水的混合溶液中，室温下充分混合并超声30min，得混浊液；

2)将2ml90%的水合肼逐滴加入混浊液中，充分超声10min，得浆状液，溶液pH值为10.8；

3)将浆状液转移至反应釜中，120℃下高温进行溶剂热反应12h，收集黄棕色固体，用乙醇和水分别洗涤三遍，即得产物叶酸－镍金属配位聚合物纳米管。产率为90%。

实施例2叶酸－镍金属配位聚合物纳米管的制备

1)将叶酸0.5mmol与NiCl₂.6H₂O0.5mmol分散于包括4ml乙醇和24ml水中，室温下充分混合并超声20min，得混浊液；

2)将4ml85%的水合肼逐滴加入混浊液中，充分超声5min，得浆状液，溶液pH值为10.8；

3)将以上浆状液转移至反应釜中，140℃下高温进行溶剂热反应2h，收集黄棕色固体，用乙醇和水分别洗涤三遍，即得产物叶酸－镍金属配位聚合物纳米管。产率为88%。

实施例3叶酸－镍金属配位聚合物纳米管的制备

1)将叶酸0.5mmol与NiCl₂.6H₂O1.5mmol分散于包括5ml乙醇和35ml水中，室温下充分混合并超声10min，得混浊液；

2)将4ml80%的水合肼逐滴加入混浊液中，充分超声8min，得浆状液，溶液pH值为10.6；

3)将以上浆状液转移至反应釜中，130℃下高温进行溶剂热反应7h，收集黄棕色固体，用乙醇和水分别洗涤三遍，即得产物叶酸－镍金属配位聚合物纳米管。产率为91%。

实施例4叶酸－镍金属配位聚合物纳米管的表征

用透射电子显微镜跟踪CPNTs的形成过程，发现：步骤（3）反应在120℃溶剂热条件下进行20min后形成较大的纳米片，且边缘有卷曲趋势；反应2h后可观察到形貌均一的纳米管，长度在50～300nm之间、内径为5～8nm、壁厚约为4～7nm；延长反应时间纳米管逐渐聚集成纳米管簇（见图1）。

CPNTs的红外数据（见表1）显示：自由叶酸的1694cm^-1ν(C=O)的振动吸收带消失，而同时1570和1453cm^-1的ν_as(COO-)和ν_s(COO-)谱带分别移至1537和1401cm^-1，证明叶酸中COO-是以双齿配位模式与Ni²⁺配位。

CPNTs的紫外-可见漫反射光谱图中（见图2）的220nm和288nm谱带分别归属于芳香环和羰基的π-π*跃迁,而377nm、604nm和980nm谱带归属于八面体配位场中Ni(II)的d-d跃迁。

表1.CPNTs的红外光谱特征峰数据

CPNTs的X射线光电子能谱(见图3)从左到右分别是C1s,N1s，O1s，Ni2p3/2和Ni2p1/2，其中855.2eV和873.1eV分别为Ni2p1/2以及Ni2p3/2的结合能。单质Ni(0)的谱峰（852.7eV）没有出现，证明CPNTs中Ni的氧化态为+II。图4为碳元素的窄谱，经分峰拟合后，可由三个峰叠加而成。其中285.7eV属于C-C(或C-H),286.8eV属于C=O(或C-N)和288.8eV属于O-C=O。图5为氮元素的窄峰，N1s谱可拆分为399.6、400.4、401.1和401.6eV，分别属于NH₂-,N₂H₄-Ni和蝶酸N。为确定水合肼是否参与配位，我们按照文献方法制备了水合肼-镍配合物Ni(N₂H₄)_nCl₂(n=2或3)，并对其进行了X射线光电子能谱分析（见图6），出现一个单峰(位于400.2eV)属于N₂H₄-Ni。基于此，CPNTs谱图中400.4eV峰应属于N₂H₄-Ni中水合肼N，从而证实肼参与了配位。

图7为氧元素的窄谱，分峰后发现样品中羧酸基团的C=O（结合能为532.1eV）和C-O（结合能为532.5eV）两者的结合能之差为0.4eV，比自由羧酸中二者差值1.5eV减小了很多，说明在CPNTs中羧基中的电子离域效应增大，证实了叶酸中羧酸基团的两个O均参与了与金属Ni配位，图谱中另一种氧元素来自于配位水（结合能为533.2eV）。

CPNTs是非晶样品，不能用通常的X射线单晶衍射分析来确定其结构，我们采用同步辐射光源近边X射线吸收精细结构分析方法研究了金属镍周围的配位结构（见表2），结果证实Ni处在六配位的八面体中心，六个配位原子分别是四个氧原子和两个氮原子。即由叶酸、氯化镍和水合肼形成配合物，并通过叶酸分子间的氢键和水合肼分子的桥联形成纳米管。

结合质谱和元素分析结果，该CPNTs的化学式为：[Ni₂(FA)(N₂H₄)₃(H₂O)₂(OH^-)₂]。

表2金属镍周围的配位与局部结构的拟合参数

^a四个氧在赤道位置^b两个氧在轴向位置

实施例5顺铂-叶酸-镍配位聚合物纳米管（CDDP-CPNTs）的制备

将20ml浓度为2mg/mL的CPNTs加入至20mL浓度为2.5mg/mL的顺铂CDDP水溶液中，黑暗条件下于摇床中振荡12h后，超纯水透析24h、10000转/分高速离心，取出上清液（即透析液），收集固体，用超纯水洗5遍以上至洗出液无色以去除没有装载上的游离药物，固体干燥得CDDP-CPNTs。

CDDP-CPNTs包封率和载药量的测定：

合并洗出液及透析液,定容至100ml容量瓶中，取适量溶液做电感偶合等离子体发射光谱(ICP)，检测合并滤出液中的Pt含量。根据式（I）计算包封率：

包封率（%）=100%×（加入的药物量-滤出液中药物含量）/加入的药物量(I)

根据式（II）计算载药量：

载药量（%）=100%×（纳米管内药物质量/纳米管总质量）(II)

计算结果为包封率为45.5%，载药量为36.3%。

实施例6RB-CDDP-CPNTs的制备

将20mg罗丹明RB加入20ml浓度为2mg/mL的CPNTs和20mL浓度为2.5mg/mL的CDDP水溶液中，超声2h，黑暗条件下室温搅拌48h后，超纯水透析72h、高速离心，收集固体，用超纯水洗5遍以去除没有装载上的游离药物和RB,干燥，得RB-CDDP-CPNTs。

实施例7体外实验

（1）人宫颈癌HeLa细胞（FR表达阳性）、人肺腺癌A549细胞（FR表达阳性）和人正常胚肺成纤维HELF细胞的培养

取冻存于液氮中的A549细胞株置于37℃恒温水浴中快速解冻复苏后，在含10%胎牛血清和1%青、链霉素双抗的RPMI-1640培养基中培养，培养条件为温度37℃，CO₂浓度为5%以及饱和湿度。

取冻存于液氮中的HeLa细胞株置37℃恒温水浴中快速解冻复苏后，在含10%胎牛血清和1%青、链霉素双抗的DMEM培养基中培养，培养条件为温度37℃，CO₂浓度为5%以及饱和湿度。

取冻存于液氮中的HELF细胞株置37℃恒温水浴中快速解冻复苏后，在含10%小牛血清和1%青、链霉素双抗的DMEM培养基中培养，培养条件为温度37℃，CO₂浓度为5%以及饱和湿度。

观察细胞生长情况，当单层生长至80%～90%密度时用吸管除去培养基，用0.25%胰蛋白酶消化。倒置显微镜下观察并判断消化情况，用含血清的全培养基终止消化后轻柔吹打成均匀单细胞悬液，传代扩增后，取对数生长期细胞用于测试。

（2）CDDP-CPNTs样品对HeLa细胞（FR表达阳性）、A549细胞（FR表达阳性）和人正常胚肺成纤维HELF的细胞毒实验

将细胞消化、计数、配制成浓度为2×10⁴个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液（每孔2×10³个细胞）。

96孔细胞培养板置于37℃，5%CO₂培养箱中培养24小时；用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组，阳性对照组。

96孔细胞培养板置于37℃，5%CO₂培养箱中培养96h；将96孔板进行MTT染色，λ=490nm，测定OD值；每孔加入20μLMTT（5mg/mL），在培养箱继续培养4h；弃去培养基，每孔加入150μLDMSO溶解，摇床10分钟轻轻地混匀；λ=490nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率和各组的半数抑制浓度IC₅₀值（参见表3）。

IC₅₀值表明，CPNTs自身即表现出较优良的体外抗肿瘤活性（HeLa:0.586μg/mL,A549:0.855μg/mL），与对照组顺铂CDDP相当(HeLa:0.464μg/mL,A549:0.847μg/mL)。装载抗肿瘤药物顺铂后，按载药体系实际载药量36.3％推算，以顺铂含量为标准，CDDP-CPNTs呈现出更好的细胞活性（Hela:0.305μg/mL,A549:0.796μg/mL）。

我们继而考察各药物体系对人正常胚肺成纤维HELF细胞的毒性，数据表明载体CPNTs对人正常细胞的毒性最低（HELF:10.139μg/mL）。由此说明，CDDP-CPNTs具备了载体CPNTs和装载药物CDDP的双重抗肿瘤活性，并通过载体CPNTs有效递药至细胞内，增加了抗肿瘤药物在癌细胞内的浓度，提高了杀死癌细胞的效率，同时避免了对正常细胞的毒副作用。

同时，对照FR表达水平不同的HeLa细胞、A549细胞和HELF细胞，CDDP-CPNTs的抗肿瘤活性具有一定的差异性，表明纳米管载药体系发挥了叶酸受体介导的靶向功能，提高了对肿瘤细胞的识别，实现了药物靶向输送。

表3不同样品与Hela、A549和人正常细胞HELF共培养96h后的IC₅₀值

实施例9叶酸靶向荧光共聚焦实验

将HeLa细胞与用RB-CDDP-CPNTs共培养后通过共聚焦荧光显微镜观察纳米管簇的摄取和在细胞内的分布。具体步骤如下：

1)取生长状态良好的Hela细胞，消化离心后用DMEM全培养基制成单细胞悬液，调整细胞浓度至2×10³个，接种于单孔共聚焦专用皿内，每孔体积2ml；

2)贴壁生长24h后，吸弃孔内的培养基，加入以DMEM稀释的用RB-CDDP-CPNTs共培养4h,药物浓度为2.5～20μg/ml；

3)培养结束后吸弃全部培养溶液，加入2.5%戊二醛溶液,用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色，PBS液充分洗涤。

4)激光共聚焦荧光显微镜下扫描CDDP-CPNTs在细胞内的摄取和分布情况。

结果见图8，第一列为荧光下显色，第二列为DAPI染色，第三列为双重荧光显色；a：与0.9μg/mL罗丹明（RB）共培养4h；b:与2.5μg/mLRB-CDDP-CPNTs，共培养4h；c:与15μg/mLRB-CDDP-CPNTs，共培养4h；d:与20μg/mLRB-CDDP-CPNTs，共培养4h。将2.5μg/mLRB-CDDP-CPNTs与HeLa细胞共培养4h后，在细胞质内，可见鲜明的红色荧光分布于蓝色的HeLa细胞核（经DAPI染色）外（图8b）。相同剂量的RB（按RB-CDDP-CPNTs中RB的含量）在与HeLa细胞共培养4h后，看不到明显的荧光（图8a）。说明CPNTs中叶酸能特异性地与叶酸受体结合而进入细胞内，在相同的浓度下，RB-CDDP-CPNTs比RB更易进入HeLa细胞内。将进样剂量放大至15μg/mL时，从图8c中可见HeLa细胞膜以及细胞质内出现更多的红色荧光物。当进样浓度达20μg/mL时（图8d），整个细胞几乎全部被红色荧光物质所占据，表明RB-CDDP-CPNTs释放出的RB进入了细胞核。

实施例10体外细胞透射电镜观察

将HeLa细胞与CDDP-CPNTs共培养后通过透射电镜观察细胞摄取纳米管簇的情况。具体步骤如下：

1)取生长状态良好的HeLa细胞，消化离心后用DMEM全培养基制成单细胞悬液，调整细胞浓度至2×10⁴个，接种于6孔板内，每孔体积2ml；

2)贴壁生长24h后，吸弃孔内的培养基，加入以DMEM稀释的CDDP-CPNTs溶液共培养4h,药物浓度为2.5μg/mL；

3)培养结束后吸弃全部培养溶液，用PBS液充分洗涤，各孔内用细胞刮刀刮取培养细胞，轻柔吹打成单细胞悬液，1500转/分离心5分钟后弃上层清液，小心收集沉淀的细胞团块加入2.5%戊二醛4℃固定；

4)低速离心弃去固定液后再用1%锇酸固定，梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋，常规超薄切片，醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，透射电镜下观察细胞对CPNTs的摄取吞噬作用。

透射电镜图显示（见图9），对照组为未加样的HeLa细胞（图9a），加样后，可以看到呈簇状的CPNTs分布在细胞外，并有部分已附着在细胞膜上（图9b）。由图9c可见已有许多纳米管和纳米管簇附着在细胞膜上。图9d显示有许多纳米管簇分散在HeLa细胞质内。没有发现CPNTs进入细胞核，因为CPNTs进入细胞内是通过细胞表面高表达的叶酸受体介导的内吞作用进入细胞的内涵体中，这些内涵体在溶酶体的作用下释放出CPNTs，因此在透射电镜下观察到的CPNTs都处于细胞质中，进一步证明了CPNTs对叶酸受体高表达的细胞的确具有靶向性。

Claims

1.一种叶酸-镍配位聚合物纳米管，其化学式为Ni₂(FA)(N₂H₄)₃(H₂O)₂(OH^-)₂，由镍离子、叶酸和水合肼形成配合物，叶酸分子间的氢键和水合肼分子的桥联作用形成纳米管，所述叶酸-镍配位聚合物纳米管的长度为50～300nm、内径为5～8nm、壁厚为4～7nm。

2.一种权利要求1所述的叶酸-镍配位聚合物纳米管的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将叶酸与镍盐分散于乙醇水溶液中，超声混合，得混浊液；

(2)将水合肼逐滴加入混浊液中，超声混合，得浆状液；

(3)将浆状液进行溶剂热反应，即得。

3.根据权利要求2所述的一种叶酸-镍配位聚合物纳米管的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述叶酸与镍盐的摩尔比为1:(1-3)；乙醇水溶液中，乙醇和水的体积比为3:(12-21)；叶酸的摩尔数与乙醇的体积之比为0.5mmol:(3-5)ml；超声时间为10-30min。

4.根据权利要求2所述的一种叶酸-镍配位聚合物纳米管的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述水合肼的浓度为80-90％，水合肼与混浊液的体积比为1：(7-10)，超声时间为5-10min。

5.根据权利要求2所述的一种叶酸-镍配位聚合物纳米管的制备方法，步骤(3)中，反应温度为120-140℃，反应时间为2-12h。

6.权利要求1所述的叶酸-镍配位聚合物纳米管在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述叶酸-镍配位聚合物纳米管作为抗肿瘤活性化合物载体。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：将叶酸-镍配位聚合物纳米管加入至抗肿瘤活性化合物的水溶液中，黑暗条件下振荡后，超纯水透析、离心，收集得到的固体洗涤，干燥，即制得的抗肿瘤药物。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤活性化合物为顺铂；所述活性化合物的水溶液的质量百分比浓度为65-75％；所述叶酸-镍配位聚合物纳米管与活性化合物的质量比为(40-50):(20-50)；震荡时间为12-48h，透析时间为24-72h。