CN102294035A - 一种双重靶向抗恶性肿瘤纳米载药系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种双重靶向抗恶性肿瘤纳米载药系统及其制备方法。该方法针对靶向治疗肿瘤的需求，采用共沉淀法制备磁性纳米粒子，并通过化学方法在磁性纳米粒子核包覆一层多官能基团修饰的SiO2层。采用单臂、双臂、多臂等新型多功能偶联剂，利用该纳米磁颗粒表面的一种功能基团将磁颗粒与抗肿瘤药物实现高效连接，使其载药量显著提高。在提高载药量的同时，进一步利用纳米磁颗粒表面的另一种功能基团将纳米磁颗粒与相关配体结合，建立安全有效的高载药量受体-磁双重靶向抗恶性肿瘤纳米载药系统。
Description
技术领域
本发明涉及材料和生物医药领域。更具体地说，本发明涉及一种双重靶向抗恶性肿瘤纳米载药系统及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的重大疾病之一，世界卫生组织(WHO)统计数据显示21世纪恶性肿瘤是人类的“头号杀手”，有效地医治恶性肿瘤已是科学研究中的当务之急。目前，全身化学药物疗法(化疗)是恶性肿瘤的重要诊疗手段。但是由于化学药物在治疗过程中分布于全身，化疗在临床使用中存在的许多副作用，致使众多癌症患者最终并非死于恶性肿瘤本身，而是死于化疗引起的副作用。纳米磁靶向给药体系是通过物理或化学方法将抗肿瘤药物固载于磁性纳米载体中，在外加磁场作用下，将载有药物的载体定位于靶区，使其所含药物稳定释放，集中在病变部位发挥作用，从而有效降低毒副作用，提高药物疗效，同时还可能穿越传统药物难以通过的血脑屏障，提高脑内药物浓度，发挥脑靶向作用，在恶性肿瘤局部靶向定位治疗中展现出巨大的应用前景，成为当今医药研究领域的热点。
目前应用于肿瘤化疗领域的纳米磁靶向药物载体的主要形式包括纳米磁靶向给药体系和配体-受体介导的双或多重靶向纳米磁给药体系。纳米磁靶向给药体系通常是采用物理或化学方法将抗肿瘤药物以及Fe3O4、γ-Fe2O3或纯铁等磁性纳米粒子包裹于脂质体、高分子材料或活性碳等骨架材料中制成，或者是将抗肿瘤药物与磁性纳米颗粒通过偶联剂结合制备而成。纳米磁靶向给药体系因受载体比表面积等因素的影响而使其药物负载量受到限制，采用一般化学偶联剂其载药量受到纳米磁颗粒表面活性基团含量的限制而难以进一步提高。同时，单一纳米磁靶向给药体系因其宏观靶向给药特点及其基质选择性的限制而并非那么尽如人意。近年来配体-受体介导的双或多重靶向纳米磁给药体系备受关注。正常情况下，人体内存在于细胞膜或胞内蛋白上的受体可特异性地识别配体分子，由于配体无毒、无免疫原性、可生物降解，可利用这一途径将药物特异性地导入体内某一部位发挥药效，同时减少对其它部位的损伤并将其导入到体内特定的位置。
配体-受体介导的双或多重靶向纳米磁给药体系的制备主要包括Fe3O4纳米磁颗粒的制备、壳-核结构的Fe3O4SiO2纳米磁颗粒的制备、壳-核结构的Fe3O4SiO2纳米磁颗粒表面修饰、配体组装、药物组装几个步骤。胡艳，等人，“甲氨蝶呤叶酸受体-磁双重靶向纳米粒的制备及评价，中国新药杂志，2009，18(24)，2370～2373”，以APTES(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)对单层壳-核结构的Fe3O4SiO2表面进行氨基修饰，在EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化作用下，将配体叶酸偶联在其表面，将甲氨蝶呤通过静电力吸附固定在纳米粒子表面，实现磁性纳米粒子靶向分子偶联和药物负载，其载药量为26.71％，包封率为64.76％。该方法所制得的抗肿瘤纳米药物虽然实现了受体-磁双重靶向性，但是载药量很低。
Yufang Zhu，等“Folate-Conjugated Fe3O4SiO2 HollowMesoporous Spheres for Targeted Anticancer Drug Delive，J.Phys.Chem.C，2010，114(39)，16382～16388”，以APTES对中空介孔单层壳-核结构的Fe3O4SiO2表面进行氨基修饰，然后将经过DCC(二环己基碳二亚胺)和NHS活化的配体叶酸通过氨基偶联在Fe3O4SiO2表面，并将带正电荷的DOX(多柔比星)通过静电力吸附固定在带负电荷的Fe3O4SiO2表面，制得一种双重靶向性抗肿瘤药物纳米磁载药体系，其载药量为83.1％。该体系通过中空介孔来增大载体表面积，以提高载药量，制备过程较为复杂，成本较高。
专利CN101923932A公开了一种多功能双层壳-核结构的磁性纳米粒子及其制备方法，该方法将纳米磁性粒子经过表面活性剂处理后，通过催化剂催化二氧化硅前驱体水解在磁性纳米粒子表面包覆一层SiO2，再在SiO2表面包覆一层含有一种或多种功能基团的水解化硅烷偶联剂层，该硅烷偶联剂层可以通过催化剂催化硅烷偶联剂或配体修饰的硅烷偶联剂水解而得，或者先通过催化剂催化硅烷偶联剂水解在SiO2表面包覆一层水解化硅烷偶联剂，再与配体偶联制得，并可通过化学或物理方法将药物、配体等生物活性分子连接于纳米粒子壳层中或表面，可以戊二醛为偶联剂通过Schiff反应将抗恶性肿瘤药物多柔比星与纳米磁性粒子偶联。
目前，如何以简单的方法，较低的成本，将磁介导的宏观靶向与配体-受体介导的微观靶向作用相结合，制备载药量高、靶向性好的纳米磁性给药体系不仅成为目前医用纳米材料领域研究的最新热点，也待解决的急需问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种双重靶向抗恶性肿瘤纳米载药系统及其制备方法。该方法针对靶向治疗肿瘤的需求，采用共沉淀法制备磁性纳米粒子，并通过化学方法在磁性纳米粒子核包覆一层多官能基团修饰的SiO2层。采用单臂、双臂、多臂等新型多功能偶联剂，利用该纳米磁颗粒表面的一种功能基团将磁颗粒与抗肿瘤药物实现高效连接，使其载药量显著提高。在提高载药量的同时，进一步利用纳米磁颗粒表面的另一种功能基团将纳米磁颗粒与相关配体结合，建立安全有效的高载药量受体-磁双重靶向抗恶性肿瘤纳米载药系统。
根据本发明的第一方面，提供了一种双重靶向抗恶性肿瘤纳米载药系统，包括：磁性纳米粒子核；包覆于磁性纳米粒子核外的多官能基团修饰的SiO2层；位于多官能基团修饰的SiO2层上的抗恶性肿瘤药物和配体；其中，配体偶联在多官能基团修饰的SiO2层上，抗恶性肿瘤药物通过双臂偶联剂或者三臂偶联剂或者双臂偶联剂和多臂偶联剂的结合连接在多官能基团修饰的SiO2层上。
在一个实施例中，所述多官能基团修饰的SiO2层为受保护的氨基、羧基或氨基、醛基或氨基、羧基等两个不同官能基团同时修饰于SiO2层表面，其厚度为2～50nm。
在一个实施例中，所述配体为分子内含有氨基的配体化合物，包括唾液酸糖蛋白或转铁蛋白或氨基半乳糖或叶酸或单克隆抗体。
在一个实施例中，所述抗肿瘤药物为含氨基的药物，包括多柔比星、柔红霉素、依达比星、吡柔比星、丝裂霉素、平阳霉素、培洛霉素、伊力替康等。
在一个实施例中，所述磁性纳米粒子包括纳米铁、Fe3O4、γ-Fe3O4以及其他金属铁氧体、锰锌铁氧体、镍铜锌铁氧体中的一种或几种，其粒径为5～10nm。
根据本发明的第二方面，提供了一种双重靶向抗恶性肿瘤纳米载药系统的制备方法，包括：
步骤A，制备磁性纳米粒子；
步骤B，在磁性纳米粒子表面包覆一层SiO2层，制得壳-核结构的磁性纳米粒子SiO2磁性纳米颗粒；
步骤C，对磁性纳米粒子SiO2磁性纳米颗粒表面进行多官能基团修饰，制得磁性纳米粒子多官能基团修饰的SiO2磁性纳米颗粒；
步骤D，在磁性纳米粒子多官能基团修饰的SiO2磁性纳米颗粒表面进行配体组装；
步骤E，在磁性纳米粒子多官能基团修饰的SiO2磁性纳米颗粒表面进行抗肿瘤药物组装；
其特征在于：步骤E包括利用磁性纳米颗粒表面的氨基、羧基或者醛基，采用双臂偶联剂、三臂偶联剂、多臂偶联剂或者双臂偶联剂和多臂偶联剂的结合将抗肿瘤药物连接在磁性纳米颗粒的多官能基团修饰的SiO2表面。
在一个实施例中，其特征在于：步骤E中采用双臂偶联剂或三臂偶联剂将抗肿瘤药物连接在表面含有氨基和配体的磁性纳米颗粒的表面，其中双臂偶联剂或者三臂偶联剂直接与磁性纳米颗粒表面的氨基偶联，抗肿瘤药物与双臂偶联剂或三臂偶联剂偶联。
所述双臂偶联剂指含有两个醛基、羧基、琥珀酰亚胺酯基、琥珀酰亚胺磺酸钠酯基的化合物。优选所述双臂偶联剂为戊二醛、乙二醛、丙二醛、辛二酸二琥珀酰亚胺酯、N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯或3-琥珀酰亚胺-氨基三醋酸酯。
所述三臂偶联剂指含有三个琥珀酰亚胺酯基、醛基、琥珀酰亚胺磺酸钠酯基的化合物。所述三臂偶联剂优选为3-琥珀亚酰胺乙酸酯。
在一个实施例中，步骤E中采用双臂偶联剂和多臂偶联剂的结合将抗肿瘤药物连接在表面含有氨基和配体的磁性纳米颗粒的表面，包括水合肼脱氨基保护将双臂偶联剂和多臂偶联剂与磁性纳米颗粒的表面的氨基发生偶联反应，然后在存在活化剂的条件下将表面含有多臂偶联剂的磁性纳米颗粒与抗肿瘤药物进行偶联反应，其中，双臂偶联剂直接与磁性纳米颗粒表面的氨基偶联，多臂偶联剂与双臂偶联剂偶联，抗肿瘤药物与多臂偶联剂偶联。
在一个例子中，所述活化剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
所述多臂偶联剂指含有一个氨基和多个羧基的化合物。所述多臂偶联剂优选为聚谷氨酸。
在一个实施例中，步骤E中采用多臂偶联剂将抗肿瘤药物连接在表面含有羧基和配体的磁性纳米颗粒的表面，包括表面含有羧基和配体的磁性纳米颗粒用活化剂活化后与多臂偶联剂偶联，然后在活化剂存在的条件下，将含有多臂偶联剂和配体的磁性纳米粒子与抗肿瘤药物进行偶联反应，其中，多臂偶联剂直接与磁性纳米颗粒表面的羧基偶联，抗肿瘤药物与多臂偶联剂偶联。
在一个例子中，所述活化剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
所述多臂偶联剂指含有一个氨基和多个羧基的化合物。所述多臂偶联剂优选为聚谷氨酸。
在一个实施例中，步骤E中采用多臂偶联剂将抗肿瘤药物连接在表面含有醛基和配体的磁性纳米颗粒的表面，包括表面含有醛基和配体的磁性纳米颗粒与多臂偶联剂偶联，然后在活化剂存在的条件下，将含有多臂偶联剂和配体的磁性纳米粒子与抗肿瘤药物进行偶联反应，其中，多臂偶联剂直接与磁性纳米颗粒表面的醛基偶联，抗肿瘤药物与多臂偶联剂偶联。
在一个例子中，所述活化剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
所述多臂偶联剂指含有一个氨基和多个羧基的化合物。所述多臂偶联剂优选为聚谷氨酸。
根据本发明方法，步骤E包括将表面含有羧基和配体或者醛基和配体的磁性纳米颗粒与抗肿瘤药物反应，制得表面含有抗肿瘤药物和配体的磁性纳米颗粒。
可以采用三条途径对磁性纳米粒子SiO2磁性纳米颗粒表面进行多官能基团修饰。根据本发明方法的一个实施例，步骤C包括利用磁性纳米粒子SiO2磁性纳米颗粒表面SiO2层的羟基与氨基硅烷偶联剂反应进行单氨基修饰，所制得的表面含有氨基的磁性纳米颗粒与带有受保护氨基的羧基修饰剂反应，制得表面同时具有羧基和受保护氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2。其中，所述带有受保护氨基的羧基修饰剂为氨基被邻苯二酸酐保护的谷氨酸酐。
在一个具体的实施例中，将磁性纳米粒子分散在水-乙醇混合溶液中，加入正硅酸乙酯(TEOS)，氨水和在20～40℃下反应12～48h，离心分离，洗涤，真空干燥。制得SiO2包覆磁性纳米粒子。利用SiO2层的羟基与氨基硅烷偶联剂反应进行单氨基修饰，再与氨基被邻苯二酸酐保护的谷氨酸酐反应，制得表面同时具有羧基和受保护氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2。
根据本发明方法的一个实施例，步骤C包括利用磁性纳米粒子SiO2磁性纳米颗粒表面SiO2层的羟基与氨基硅烷偶联剂、环氧乙烷基硅烷偶联剂共同反应，所制得的表面含有羟基和氨基的磁性纳米颗粒在氧化催化剂存在下进行催化氧化反应，制备表面同时具有醛基和氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2。其中，所述氧化催化剂包括NaIO4或NaClO。
在一个具体的实施例中，将磁性纳米粒子分散在水-乙醇混合溶液中，加入TEOS，氨水和在20～40℃下反应12～48h，离心分离，洗涤，真空干燥。制得SiO2包覆磁性纳米粒子。利用SiO2层的羟基与氨基硅烷偶联剂、环氧乙烷基硅烷偶联剂共同反应，再通过与NaIO4或NaClO催化氧化反应，制备表面同时具有醛基和氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2。
根据本发明方法的一个实施例，步骤C包括利用磁性纳米粒子SiO2磁性纳米颗粒表面SiO2层的羟基与氨基硅烷偶联剂反应进行单氨基修饰，所制得的表面含有氨基的磁性纳米颗粒与带有受保护氨基的羧基修饰剂反应，制得表面同时具有羧基和受保护氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2，将表面同时具有羧基和受保护氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2用水合肼氨基脱保护，制得表面同时具有羧基和氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2。
本发明方法中的配体组装是利用磁性纳米粒子多官基能团SiO2表面的一个官能基团如羧基、氨基、醛基等进行。根据利用的不同官能基团采用不同反应途径，主要包括四条途径，在一个实施例中，步骤D包括将所述表面同时具有羧基和受保护氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2通过活化剂进行活化处理，再与含氨基的配体反应，所制得表面含有受保护氨基及配体的磁性纳米颗粒，再采用水合肼将表面含有受保护氨基及配体的磁性纳米颗粒进行氨基脱保护处理，制得表面含有氨基及配体的磁性纳米颗粒。其中，所述活化剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
在一个实施例中，步骤D包括将所述表面同时具有醛基和氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2与配体通过Schiff反应偶联，制得表面含有氨基及配体的磁性纳米颗粒。
在一个实施例中，步骤D包括将表面同时具有醛基和氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2与用活化剂处理的含羧基的配体反应，制得表面含有醛基及配体组装的磁性纳米粒子。其中，所述活化剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
在一个实施例中，步骤D包括将表面同时具有羧基和氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2与活化剂处理后的含羧基的配体反应，制得表面含有羧基及配体组装的磁性纳米粒子。其中，所述活化剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
在根据本发明方法的一个实施例中，所述方法还包括在步骤E后选择性地进行配体的二次组装，以加强配体偶联量。
不同于之前报道的磁性纳米载药体系，本发明所报道的高载药量受体-磁双重靶向抗恶性肿瘤纳米给药体系的载药量高，载药率最高可达83.8％，这个值比通常采用脂质体或表面活性剂胶束作为药物载体(12.4％)高出约6倍，并且载药量可通过改变不同偶联方法和实验条件在200μg～5000μg范围内可控调节。根据本发明方法制备的磁性纳米载药体系同时偶联了相关配体，具有受体-靶向功能。此外，根据本发明方法制备的磁性纳米载药体系还具有超顺磁性，具有磁-靶向功能。通过受体-磁双重靶向，可完成对靶器官、靶细胞到甚至细胞内靶结构的选择性导入，实现针对肿瘤的严格靶向治疗。通过本研究，可为解决目前纳米磁性药物载体普遍存在的载药量低、靶向性不强等问题提供一条新途径，为靶向定位治疗肿瘤的进一步临床应用提供新的技术基础。
附图说明
下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
图1为对磁性纳米粒子SiO2磁性纳米颗粒表面进行多官能基团修饰途径示意图。
图2为配体组装过程示意图。
图3为以聚谷氨酸(PLGA)为多臂偶联剂，将抗肿瘤药物连接在磁性纳米颗粒的表面的反应途径示意图。
图4为叶酸修饰纳米磁性多柔比星药物红外图谱。
图5为不同浓度的样品对细胞Hela的抑制率。
其中，A：磁颗粒B：磁性多柔比星C：叶酸修饰磁性多柔比星。
图6为Hela细胞摄取磁性多柔比星(A)和叶酸修饰磁性多柔比星(B)后的荧光显微照片。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
实施例
实施例1：PLGA间接偶联法制备叶酸修饰纳米磁性多柔比星药物
(1)沉淀法制备纳米四氧化三铁纳米粒子，再加入到经通氮除氧的表面活性剂溶液中，超声分散30min后在60℃氮气氛围中搅拌12h。最后在体系冷却至室温后利用磁铁将产物磁分离，丙酮洗涤后分散到乙醇/水溶液中得到稳定的磁性纳米粒子分散液。
(2)取上述(1)制备的磁性纳米粒子分散液超声1～60min后加入氨水及正硅酸乙酯(体积比10∶3)，40℃下机械搅拌12h，离心分离产物，产物用乙醇洗涤后分散在乙醇/水中，制得SiO2包覆磁性纳米粒的分散液。
(3)取上述(2)制备的磁性纳米粒子分散液超声30min后加入氨水及氨基硅烷偶联剂KH550(体积比1∶1)，40℃下机械搅拌12h，磁分离或离心分离产物，产物分别用去离子水和乙醇洗涤三次，40℃真空干燥24h。
(4)称取约质量比1∶1邻苯二甲酸酐和谷氨酸放入硬质大试管，180℃油浴加热至熔融。用适量乙醇-水溶液溶解反应产物，冷却结晶后过滤洗涤抽干。取上步产物加入醋酐，回流，冷却结晶。用适量乙醇-水溶液重结晶，过滤，抽干，制得产物A氨基保护的谷氨酸酐。
(5)取步骤(3)所得氨基修饰磁性纳米颗粒60mg，加入步骤(4)所得氨基保护的谷氨酸酐约0.16～0.20g，超声分散在50mL蒸馏水中，常温下搅拌1h，取出，离心分离。制得制得产物B，表面同时具有羧基和受保护氨基修饰的Fe3O4多官能基团SiO2。
步骤(3)～(5)对磁性纳米粒子SiO2磁性纳米颗粒表面进行多官能基团修饰途径示意图见图1。
(6)取上述产物B200μg，加入2mgEDC和2mgNHS，超声10min，洗涤后干燥过夜。得活化磁性纳米颗粒。
(7)在上述活化的磁性纳米粒子中加入0.20mL、2mg/mL叶酸溶液，1.80mL磷酸盐缓冲溶液，间隔超声60min，上层清液待测，洗涤后离心分离。
步骤(6)和(7)配体组装过程示意图见图2。
(8)加入6.0μL水合肼稀释液以及1.60mL磷酸盐缓冲溶液，间隔超声反应30min，洗涤后离心分离。然后入2mgPLGA(聚谷氨酸钠)，1.20mL磷酸盐缓冲溶液，0.20mL、15％戊二醛，间隔超声反应1.5～2h，洗涤后离心分离，再加入2mgEDC和2mgNHS，加入0.40mL、4mg/mL多柔比星溶液，超声1.0h。磁分离产物。
步骤(8)以聚谷氨酸(PLGA)为多臂偶联剂，将抗肿瘤药物连接在磁性纳米颗粒的表面的反应途径示意图见图3。
(9)最后加入0.20mL活化的叶酸溶液超声1h结束反应，磁分离或离心分离，洗至几近无色后40℃真空干燥24h。得最终产物。
上述组装过程制得的叶酸修饰纳米磁性多柔比星药物的红外图谱见图4。
实施例2：TSAT法制备高载药量半乳糖修饰磁性纳米多柔比星药物
(1)将上述实施例1步骤(6)中所得活化磁性纳米颗粒中加入0.20mL、2mg/mL氨基半乳糖溶液，1.80mL磷酸盐缓冲溶液，间隔超声60min，上层清液待测，洗涤后离心或磁分离产物。
(2)加入6.0μL水合肼稀释液以及1.60mL磷酸盐缓冲溶液，间隔超声反应30min，洗涤后离心分离。然后加入2mg/mL的TSAT溶液200μL，0.40mL、4mg/mL多柔比星溶液，磷酸盐缓冲溶液溶液中间隔超声反应1.5～2h，洗涤后离心或磁分离产物。分别用去离子水及乙醇溶液洗至无色后40℃真空干燥24h。得最终产物。
实施例3：戊二醛及NaIO4氧化法制备叶酸修饰纳米磁性多柔比星药物
(1)将上述实施例1步骤(2)中制得SiO2包覆磁性纳米粒子分散液超声30min后加入氨水或硫酸溶液，再加入氨基硅烷偶联剂KH550和KH560(体积比1∶1)，40℃下机械搅拌12h，磁分离或离心分离产物，产物分别用去离子水和乙醇洗涤三次，40℃真空干燥24h。
(2)将上步产物超声分散于经灭菌处理的二次水中，制得1mg/mL磁流体。取磁流体200μL，加入0.80mL二次水和1.00mL10％高碘酸钠溶液，间隔超声反应60min。离心或磁分离产物，二次水和乙醇洗涤5次，离心后真空干燥。
(3)将(2)产物加入1.80mLPBS和0.20mL2mg/mL的叶酸水溶液，间隔超声反应1.5h，产物用二次水洗涤后离心或磁分离。
(4)取上步(3)产物，洗涤后加入0.20mL、2mg/mL多柔比星溶液，1.20mLPBS，0.20mL15％戊二醛水溶液，间隔超声反应1h，离心或磁分离产物，用水和乙醇洗涤至上层清液几近无色，40℃真空干燥24h，得最终产物。
实施例4：戊二醛及NaClO氧化法制备叶酸修饰纳米磁性多柔比星药物
(1)将上述实施例3步骤(1)中制得磁性纳米粒子产物超声分散于经灭菌处理的二次水中，制得1mg/mL磁流体。取磁流体200μL，加入400mL、2∶1的碳酸氢钠饱和溶液和5.2％NaClO溶液，0.20mL2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物醇溶液，0.20mL、5mg/mL的KBr溶液，0.20mL二次水，在15℃以下间隔超声反应0.5h。离心或磁分离产物，二次水和乙醇洗涤5次，40℃真空干燥24h
(2)将上述(1)产物加入1.80mL PBS和0.20mL、2mg/mL的叶酸水溶液，间隔超声反应1.5h，产物用二次水洗涤后离心或磁分离。
(3)取上步(2)产物，洗涤后加入0.20mL、2mg/mL多柔比星溶液，1.20mL PBS，0.20mL 15％戊二醛水溶液，间隔超声反应1h，离心或磁分离产物，用水和乙醇洗涤至上层清液几近无色，40℃真空干燥24h，得最终产物。
实施例5：直接偶联法制备叶酸修饰纳米磁性多柔比星药物
(1)取上述实施例1步骤(5)所制具有羧基和受保护氨基修饰的Fe3O4多官能基团SiO2产品，加入6.0μL水合肼稀释液以及1.60mL磷酸盐缓冲溶液，间隔超声反应30min，洗涤后离心分离，制得具有氨基和羧基修饰的Fe3O4多官能基团SiO2；
(2)在上述具有氨基和羧基修饰的Fe3O4多官能基团SiO2中加入0.20mL、2mg/mL经活化剂活化后的叶酸溶液，1.80mL磷酸盐缓冲溶液，间隔超声60min，上层清液待测，洗涤后离心或磁分离产物。
(3)将上述产物加入2mgEDC和2mgNHS，超声10min，洗涤后干燥过夜。得活化磁性纳米颗粒。
(4)加入0.40mL、2mg/mL多柔比星溶液，1.60mL磷酸盐缓冲溶液，间隔超声反应1.5～2h，洗涤后离心或磁分离产物。分别用去离子水及乙醇溶液洗至无色后40℃真空干燥24h。得最终产物。
实施例6：PLGA直接偶联法制备叶酸修饰纳米磁性多柔比星药物
(1)在实施例5中步骤(3)产物中加入2mgPLGA(聚谷氨酸钠)，1.40mL磷酸盐缓冲溶液，间隔超声反应1.5～2h，洗涤后离心分离。
(2)再加入2mgEDC和2mgNHS，加入0.40mL、2mg/mL多柔比星溶液，间隔超声反应1.5～2h，洗涤后离心或磁分离产物。分别用去离子水及乙醇溶液洗至无色后40℃真空干燥24h。得最终产物。
实施例7：直接偶联及NaIO4氧化法制备叶酸修饰纳米磁性多柔比星药物
(1)将上述实施例3中步骤(2)产物加入1.80mLPBS和0.20mL2mg/mL的经活化剂活化的叶酸水溶液，间隔超声反应1.5h，产物用二次水洗涤后离心或磁分离。
(2)加入0.40mL、2mg/mL多柔比星溶液，1.60mL磷酸盐缓冲溶液，间隔超声反应1.5～2h，洗涤后离心或磁分离产物。分别用去离子水及乙醇溶液洗至无色后40℃真空干燥24h。得最终产物。
实施例8：PLGA直接偶联及NaIO4氧化法制备叶酸修饰纳米磁性多柔比星药物
(1)将上述实施例7中步骤(1)产物加入2mgPLGA(聚谷氨酸钠)，1.40mL磷酸盐缓冲溶液，间隔超声反应1.5～2h，洗涤后离心分离。
(2)再加入2mgEDC和2mgNHS，加入0.40mL、2mg/mL多柔比星溶液，间隔超声反应1.5～2h，洗涤后离心或磁分离产物。分别用去离子水及乙醇溶液洗至无色后40℃真空干燥24h。得最终产物。
实施例9：叶酸修饰纳米磁性多柔比星药物的对宫颈肿瘤Hela细胞毒性及激光共聚焦显微分析
细胞毒性实验采用MTT法体外药物筛选，具体步骤如下：
(1)细胞消化、计数、制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔1×104个细胞)；
(2)96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
(3)用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组，溶媒对照组，阳性对照组，每组五个复孔；
(4)96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养72h；
(5)将96孔板进行MTT染色，λ＝490nm，测定OD值。
1)每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，在培养箱继续培养4h；
2)弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床10min轻轻混匀；
3)λ＝490nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率。
不同浓度的样品对细胞Hela的抑制率见图5，研究结果表明，与未修饰配体的磁性纳米药物相比，配体修饰后的多柔比星-磁性纳米药物(FDMP)显示出更强的细胞毒性，0.375μg/mL时对肿瘤细胞的抑制率可以达到97％，同时IC50值也比未修饰配体的磁性纳米药物降低了3.3倍。
实施例10：叶酸修饰纳米磁性多柔比星药物的对宫颈肿瘤Hela细胞荧光显微分析
1mL Hela细胞悬浊液(1×104个细胞)在24孔的细胞培养皿中培养12h，然后再与4μg样品培养30min，用0.1M的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次后在荧光显微镜下观察，Hela细胞摄取磁性多柔比星(A)和叶酸修饰磁性多柔比星(B)后的荧光显微照片见图6。
研究结果表明，与未修饰配体的磁性纳米药物相比，配体修饰后的多柔比星-磁性纳米药物(FDMP)更容易被恶性宫颈肿瘤细胞Hela摄取。
Claims (10)
1.一种双重靶向抗恶性肿瘤纳米载药系统，包括：磁性纳米粒子核；包覆于磁性纳米粒子核外的多官能基团修饰的SiO2层；位于多官能基团修饰的SiO2层上的抗恶性肿瘤药物和配体；
其中，配体偶联在多官能基团修饰的SiO2层上，抗恶性肿瘤药物通过双臂偶联剂或者三臂偶联剂或者双臂偶联剂和多臂偶联剂的结合连接在多官能基团修饰的SiO2层上。
2.一种双重靶向抗恶性肿瘤纳米载药系统的制备方法，包括：
步骤A，制备磁性纳米粒子；
步骤B，在磁性纳米粒子表面包覆一层SiO2层，制得壳-核结构的磁性纳米粒子SiO2磁性纳米颗粒；
步骤C，对磁性纳米粒子SiO2磁性纳米颗粒表面进行多官能基团修饰，制得磁性纳米粒子多官能基团修饰的SiO2磁性纳米颗粒；
步骤D，在磁性纳米粒子多官能基团修饰的SiO2磁性纳米颗粒表面进行配体组装；
步骤E，在磁性纳米粒子多官能基团修饰的SiO2磁性纳米颗粒表面进行抗肿瘤药物组装；
其特征在于：步骤E包括利用磁性纳米颗粒表面的氨基、羧基或者醛基，采用双臂偶联剂、三臂偶联剂、多臂偶联剂或者双臂偶联剂和多臂偶联剂的结合将抗肿瘤药物连接在磁性纳米颗粒的多官能基团修饰的SiO2表面。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤E中采用双臂偶联剂或三臂偶联剂将抗肿瘤药物连接在表面含有氨基和配体的磁性纳米颗粒的表面，其中双臂偶联剂或者三臂偶联剂直接与磁性纳米颗粒表面的氨基偶联，抗肿瘤药物与双臂偶联剂或三臂偶联剂偶联；或者，步骤E中采用双臂偶联剂和多臂偶联剂的结合将抗肿瘤药物连接在表面含有氨基和配体的磁性纳米颗粒的表面，包括水合肼脱氨基保护将双臂偶联剂和多臂偶联剂与磁性纳米颗粒的表面的氨基发生偶联反应，然后在存在活化剂的条件下将表面含有多臂偶联剂的磁性纳米颗粒与抗肿瘤药物进行偶联反应，其中，双臂偶联剂直接与磁性纳米颗粒表面的氨基偶联，多臂偶联剂与双臂偶联剂偶联，抗肿瘤药物与多臂偶联剂偶联。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤E中采用多臂偶联剂将抗肿瘤药物连接在表面含有羧基和配体的磁性纳米颗粒的表面，包括表面含有羧基和配体的磁性纳米颗粒用活化剂活化后与多臂偶联剂偶联，然后在活化剂存在的条件下，将含有多臂偶联剂和配体的磁性纳米粒子与抗肿瘤药物进行偶联反应，其中，多臂偶联剂直接与磁性纳米颗粒表面的羧基偶联，抗肿瘤药物与多臂偶联剂偶联；或者，将表面含有羧基和配体的磁性纳米颗粒与抗肿瘤药物反应，制得表面含有抗肿瘤药物和配体的磁性纳米颗粒。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤E中采用多臂偶联剂将抗肿瘤药物连接在表面含有醛基和配体的磁性纳米颗粒的表面，包括表面含有醛基和配体的磁性纳米颗粒与多臂偶联剂偶联，然后在活化剂存在的条件下，将含有有多臂偶联剂和配体的磁性纳米粒子与抗肿瘤药物进行偶联反应，其中，多臂偶联剂直接与磁性纳米颗粒表面的醛基偶联，抗肿瘤药物与多臂偶联剂偶联；或者，将表面含有醛基和配体的磁性纳米颗粒与抗肿瘤药物反应，制得表面含有抗肿瘤药物和配体的磁性纳米颗粒。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤C包括利用磁性纳米粒子SiO2磁性纳米颗粒表面SiO2层的羟基与氨基硅烷偶联剂反应进行单氨基修饰，所制得的表面含有氨基的磁性纳米颗粒与带有受保护氨基的羧基修饰剂反应，制得表面同时具有羧基和受保护氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2；或者，将表面同时具有羧基和受保护氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2用水合肼氨基脱保护，制得表面同时具有羧基和氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤C包括利用磁性纳米粒子SiO2磁性纳米颗粒表面SiO2层的羟基与氨基硅烷偶联剂、环氧乙烷基硅烷偶联剂共同反应，所制得的表面含有羟基和氨基的磁性纳米颗粒在氧化催化剂存在下进行催化氧化反应，制备表面同时具有醛基和氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤D包括将所述表面同时具有羧基和受保护氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2通过活化剂进行活化处理，再与含氨基的配体反应，所制得表面含有受保护氨基及配体的磁性纳米颗粒，再采用水合肼将表面含有受保护氨基及配体的磁性纳米颗粒进行氨基脱保护处理，制得表面含有氨基及配体的磁性纳米颗粒。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤D包括将表面同时具有羧基和氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2与活化剂处理后的含羧基的配体反应，制得表面含有羧基及配体组装的磁性纳米粒子。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤D包括将表面同时具有醛基和氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2与用活化剂处理的含羧基的配体反应，制得表面含有醛基及配体组装的磁性纳米粒子；或者，将所述表面同时具有醛基和氨基修饰的磁性纳米粒子多官能基团SiO2与配体通过Schiff反应偶联，制得表面含有氨基及配体的磁性纳米颗粒。
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