CN103571751A - 一种水中两虫的富集、纯化方法及其含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的富集、纯化方法及其含量的检测方法。本发明方法包括：首先向水样中加入氯化钙和碳酸氢钠，调节水样pH，在碱性条件下“两虫”随着生成的碳酸钙沉降、富集；收集沉淀后加入氨基磺酸溶液进行酸解离，然后进行密度梯度离心处理得到“两虫”纯化液，最后将“两虫”通过过滤附着在醋酸纤维膜上，染色处理后进行荧光显微镜检测，计数。本发明方法对水样中“两虫”的浓缩和分离纯化方法进行改进，减小了镜检时背景杂质的干扰，检测方法的回收率高，检测结果准确，符合美国国家环保局制定的用于测定水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的质量控制标准。

Description

一种水中两虫的富集、纯化方法及其含量的测定方法

技术领域

本发明涉及的是一种水中检测技术领域的方法，具体是一种浊水中隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊的富集、纯化方法及其在浊水中含量的检测方法。 

背景技术

隐孢子虫和贾第鞭毛虫(即“两虫”)是两种寄生于人和动物体内的致病性原生动物，近年来国外出现了多次由于水中“两虫”所导致的介水疾病的暴发，其危害已经引起了广泛的重视。我国修订的《生活饮用水卫生标准》(GB5947-2006)中，在微生物指标部分增加了对隐孢子虫和贾第鞭毛虫的检测，明确规定其限值＜1个/10L。 

通过对现有技术的检索发现，对于水中“两虫”的检测都是通过水样过滤浓缩，分离纯化，染色及镜检这几个主要步骤来完成实现的，其中最为常用的检测方法是采用美国的EPA 1623方法(“EPA1623方法”是由美国国家环保局制定的用于测定水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的标准方法)。我国饮用水卫生标准检测方法中也参考采用了该方法。该方法采用滤筒/滤囊过滤，免疫磁珠分离(IMS)和免疫荧光染色显微观察，利用微分干涉来检测和计数隐孢子虫和贾第鞭毛虫，通过显微镜观察确认，该方法实验条件要求较高，同时检测成本昂贵，如需用专用的滤囊/滤芯以及免疫磁珠分离试剂盒等。日本对检测环境水样中的“两虫”方法进行了改进，用膜过滤-丙酮溶解这一操作步骤优替代1623中的滤筒/滤囊过滤，避免了洗脱过程中“两虫”的流失，提高了回收率。然而当水源水中浊度较高条件下，无论采用滤囊/滤芯或膜过滤的方式进行浓缩，往往需要多个滤囊/滤芯或滤膜进行，不仅操作上麻烦，而且实验耗费较大；同时由于得到过多的沉淀，不利于隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊的进一步分离纯化，导致回收率不高。因此有必要针对混浊水条件下开发一种操作方便，且成本不高的富集及分离纯化方法，浊水中隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊的富集、纯化方法及其在浊水中含量的检测方法。 

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的问题和不足，提供一种水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的富集、分离纯化及其含量的检测方法，本发明方法中“两虫”的回收率高，背景杂质干扰少，测定结果准确，同时本发明不需要昂贵的仪器设备、耗材，操作简便，达到了降低测试成本的目的。 

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的富集和分离纯化方法，包括如下顺序进行的步骤： 

(1)沉降、富集处理 

向水样中加入氯化钙和碳酸氢钠，然后调节水的pH值，在碱性条件下隐孢子虫和贾第鞭毛虫随着生成的碳酸钙沉淀一起沉降，得到隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀； 

(2)酸解离处理 

向隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入酸性物质，酸解离处理，碳酸钙沉淀溶解，得到酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀； 

(3)纯化处理 

向酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入磷酸盐-吐温缓冲溶液，混匀，制成隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液，接着向悬浮液中加入Percoll-蔗糖介质，然后进行密度梯度离心处理，离心混合液分为3层，取中间层，即得纯化的隐孢子虫和贾第鞭毛虫。 

其中，步骤(1)中所述水样的浊度≥20NTU，所述水的浊度优选为20-100NTU，进一步优选为20-60NTU；向水中加入等摩尔量的氯化钙和碳酸氢钠；调节水的pH值为9.50-10.50，优选为10.00±0.05。 

特别是，每10L水中添加0.1-0.2mol的所述氯化钙；沉降时间为12-24h。 

尤其是，所述氯化钙选用氯化钙溶液；所述碳酸氢钠选用碳酸氢钠溶液。 

其中，采用向水样中加入氢氧化钠进行所述水样的pH调节。 

特别是，采用浓度为1-10mol/L的氢氧化钠溶液条件水样的pH值，氢氧化钠溶液的浓度优选为10mol/L。 

特别是，所述氯化钙溶液的浓度为1-10mol/L，优选为1mol/L；所述碳酸氢钠溶液的浓度为1-10mol/L，优选为1mol/L。 

特别是，还包括沉降后去除上清液，得到浓缩富集的隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀。

其中，步骤(2)中所述酸性物质的物质的量为0.2-0.4mol，即酸性物质的摩尔数 为0.2-0.4mol。 

特别是，所述酸性物质选择氨基磺酸溶液、盐酸溶液或醋酸溶液，优选为氨基磺酸溶液。 

尤其是，所述氨基磺酸溶液的浓度为1-10mol/L，优选为1mol/L；每10L水中添加0.2-0.4mol所述氨基磺酸。 

特别是，在2000g，4℃下进行所述离心处理10min。 

特别是，还包括向酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入去离子水，进行离心处理，洗涤沉淀，直至离心后上清液呈中性，即上清液的pH值为6-8，优选为pH为7。 

其中，步骤(3)中所述磷酸盐-吐温缓冲溶液(PBS缓冲溶液)按照如下步骤制备而成： 

3A)按照如下用量备料(以1L水量计) 

NaCl              8.0g 

Na₂HPO₄·12H₂O    2.9g 

KCl               0.2g 

KH₂PO₄            0.2g 

3B)将上述原料加入到1000mL纯水中，搅拌溶解均匀后，调节pH到7.2-7.4，制得磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲溶液)； 

3C)向磷酸盐缓冲溶液中加入吐温80，搅拌混匀，即得，其中每100mL磷酸盐缓冲溶液中加入0.1-0.2mL的吐温80。 

特别是，所述的PBST缓冲溶液的体积与所述酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀的体积之比为10-30∶1，优选为15-27∶1，进一步优选为20∶1。 

尤其是，还包括将所述酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀和所述磷酸盐吐温缓冲溶液的混合物进行搅拌均匀或置于涡旋震荡混合器中，振荡混合2-5min，制成混合均匀的隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液。 

其中，步骤(3)中所述Percoll-蔗糖介质的密度为1.10-1.15g/cm³，优选为1.12g/cm³。 

特别是，每100ml所述Percoll-蔗糖介质含有45mL Percoll液，8.55g蔗糖和余量的水。 

尤其是，所述Percoll-蔗糖介质按照如下步骤制备而成：将45mL Percoll液，8.55g蔗糖，溶解定容到100mL纯水中，混匀。 

特别是，所述Percoll-蔗糖介质与所述隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液的体积之比为1∶2。 

尤其是，所述Percoll-蔗糖介质从所述隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液的底部加入后，在进行所述的离心处理。 

其中，步骤(3)中所述离心处理条件是1050g，20℃，离心10min。 

特别是，将所述的隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液均匀分至至少2个15mL的离心管中，然后向所述15mL离心管中加入所述的Percoll-蔗糖介质，进行所述的离心处理。 

特别是，还包括至少重复1次如下操作步骤：向离心中间层中添加Percoll-蔗糖介质，混合均匀后进行离心处理，离心后取中间层。 

本发明另一方面提供过一种水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫含量的测定方法，包括如下顺序进行的步骤： 

(1)沉降、富集处理 

向水样中加入氯化钙和碳酸钠，然后调节水的pH值，在碱性条件下隐孢子虫和贾第鞭毛虫随着生成的碳酸钙沉淀一起沉降，得到隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀； 

(2)酸解离处理 

向隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入酸性物质，酸解离处理，碳酸钙沉淀溶解，得到酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀； 

(3)纯化处理 

向酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入磷酸盐-吐温缓冲溶液，混匀，制成隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液，接着向悬浮液中加入Percoll-蔗糖介质，然后进行密度梯度离心处理，离心混合液分为3层，取中间层，得隐孢子虫和贾第鞭毛虫纯化液； 

(4)染色、镜检 

首先，对隐孢子虫和贾第鞭毛虫纯化液进行过滤处理，接着进行染色处理，然后置于显微镜下观察，镜检计数。 

其中，步骤(1)中所述水样的浊度≥20NTU，所述水的浊度优选为20-100NTU，进一步优选为20-60NTU；向水中加入等摩尔量的氯化钙和碳酸氢钠；调节水的pH值为9.50-10.50，优选为10.00±0.05。 

特别是，每10L水中添加0.1-0.2mol的所述氯化钙；沉降时间为12-24h。 

尤其是，所述氯化钙选用氯化钙溶液；所述碳酸氢钠选用碳酸氢钠溶液。 

其中，采用向水样中加入氢氧化钠进行所述水样的pH调节。 

特别是，采用浓度为1-10mol/L的氢氧化钠溶液条件水样的pH值，氢氧化钠溶液的浓度优选为10mol/L。 

特别是，所述氯化钙溶液的浓度为1-10mol/L，优选为1mol/L；所述碳酸氢钠溶液的浓度为1-10mol/L，优选为1mol/L。 

特别是，还包括沉降后去除上清液，得到浓缩富集的隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀。

其中，步骤(2)中所述酸性物质的物质的量为0.2-0.4mol，即酸性物质的摩尔数为0.2-0.4mol。 

特别是，所述酸性物质选择氨基磺酸溶液、盐酸溶液或醋酸溶液，优选为氨基磺酸溶液。 

尤其是，所述氨基磺酸溶液的浓度为1-10mol/L，优选为1mol/L；每10L水中添加0.2-0.4mol所述氨基磺酸。 

特别是，在2000g，4℃下进行所述离心处理10min。 

特别是，还包括向酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入去离子水，进行离心处理，洗涤沉淀，直至离心后上清液呈中性，即上清液的pH值为6-8，优选为pH为7。 

其中，步骤(3)中所述磷酸盐-吐温缓冲溶液(PBST缓冲溶液)按照如下步骤制备而成： 

3A)按照如下用量备料(以1L水量计) 

NaCl              8.0g 

Na₂HPO₄·12H₂O    2.9g 

KCl               0.2g 

KH₂PO₄            0.2g 

3B)将上述原料加入到1000mL纯水中，搅拌溶解均匀后，调节pH到7.2-7.4，制得磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲溶液)； 

3C)向磷酸盐缓冲溶液中加入吐温80，搅拌混匀，即得，其中每100mL磷酸盐缓冲溶液中加入0.01-0.2mL的吐温80。 

特别是，所述的PBST缓冲溶液的体积与所述酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀的体积之比为10-30∶1，优选为15-27∶1，进一步优选为20∶1。 

尤其是，还包括将所述酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀和所述磷酸盐吐温缓冲溶 液的混合物进行搅拌均匀或置于涡旋震荡混合器中，振荡混合2-5min，制成混合均匀的隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液。 

其中，步骤(3)中所述Percoll-蔗糖介质的密度为1.10-1.15g/cm³，优选为1.12g/cm³。 

特别是，每100ml所述Percoll-蔗糖介质含有45mL Percoll液，8.55g蔗糖和余量的水。 

尤其是，所述Percoll-蔗糖介质按照如下步骤制备而成：将45mL Percoll液，8.55g蔗糖，溶解定容到100mL纯水中，混匀。 

特别是，所述Percoll-蔗糖介质与所述隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液的体积之比为1∶2。 

尤其是，所述Percoll-蔗糖介质从所述隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液的底部加入后，在进行所述的离心处理。 

其中，步骤(3)中所述离心处理条件是1050g，20℃，离心10min。 

特别是，将所述的隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液均匀分至至少2个15mL的离心管中，然后向所述15mL离心管中加入所述的Percoll-蔗糖介质，进行所述的密度梯度离心处理。 

特别是，还包括至少重复1次如下操作步骤：向离心中间层中添加Percoll-蔗糖介质，混合均匀后进行离心处理，离心后取中间层。 

其中，步骤(4)中所述磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲溶液)按照如下步骤制备而成： 

4A)按照如下用量备料(以1L水量计) 

NaCl              8.0g 

Na₂HPO₄·12H₂O    2.9g 

KCl               0.2g 

KH₂PO₄            0.2g 

4B)将上述原料加入到1000mL纯水中，搅拌溶解均匀后，调节pH到7.2-7.4，即得。 

特别是，所述过滤处理为抽滤；抽滤过程中绝对压力为0-5mmHg；采用孔径为1-3μm的醋酸纤维膜进行所述的过滤处理。 

其中，步骤(4)中所述的染色处理包括如下步骤： 

4a)向经过过滤处理、分散在过滤膜上的隐孢子虫和贾第鞭毛虫上加入牛血清白蛋 白溶液进行固定处理； 

4b)依次滴加单克隆抗体免疫荧光染色试剂和4，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染色液，静置放置，染色； 

4c)用磷酸盐缓冲溶液淋洗去除染色剂后再依次滴加体积百分比浓度为30％、70％、90％的甘油-乙醇溶液，进行滤膜脱水处理；

4d)向脱水处理后的附着隐孢子虫和贾第鞭毛虫的滤膜上滴加抗荧光衰退封片剂，封片，进行显微镜观察，镜检计数。 

特别是，步骤4a)中所述的牛血清白蛋白(BSA)溶液的浓度为1％；所述固定处理时间为2min；步骤4b)中所述DAPI染色液的浓度为4μg/mL；步骤4c)中采用体积百分比浓度为30％、70％、90％的甘油-乙醇溶液进行所述脱水处理时的用量均为1.0-1.5mL，优选为1.2mL。 

特别是，还包括用PBS缓冲溶液淋洗附着有“两虫”的滤膜，并抽滤去除PBS缓冲溶液后在进行所述的固定处理。 

尤其是，染色处理过程中，滴加单克隆抗体免疫荧光染色试剂后将附着有“两虫”的滤膜在暗盒中静置20min后在滴加DAPI染色液。 

特别是，滴加DAPI溶液后静置时间为10min。 

其中，所述抗荧光衰退封片剂按照如下方法制备而成：称取12.6g甘油，接着将甘油加热至60-70℃，然后加入0.2g DABCO(1，4-二偶氮双环[2，2，2]辛烷)搅拌至溶解，即得。 

本发明方法具有如下优点： 

1、本发明方法利用在水样中产生沉淀的方式将水中的“两虫”沉淀，将水中的“两虫”有效浓缩和富集，提高了检测结果的准确性。 

2、本发明方法将沉淀进行酸解离，溶解沉淀后通过密度梯度离心的方式将“两虫”进行纯化，减少了显微镜观察时的背景杂质干扰，提高了检测方法的准确性，检测结果精确。 

3、本发明方法中将“两虫”的酸解离沉淀用去离子水离心洗涤至中性有效地防止了“两虫”形态被破坏，显微镜镜检过程中“两虫”保持正常，镜检结果准确。 

4、本发明检测浑浊水样中“两虫”含量的方法的回收率高，符合美国国家环保局 制定的用于测定水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的标准方法，即EPA1623方法的要求，达到规定的标准。 

5、本发明方法使用的设备和原料价格低廉，有效地降低了水中“两虫”检测的成本，利于广泛推广使用。 

具体实施方式：

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案进一步详细描述。 

实施例1 配制缓冲溶液 

1、磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)的配制： 

1)按照如下用量备料(以1L水量计) 

NaCl(分析纯)              8.0g 

Na₂HPO₄·12H₂O(分析纯)    2.9g 

KCl(分析纯)               0.2g 

KH₂PO₄(分析纯)            0.2g 

2)将上述成分原料加入到1000mL纯水中，搅拌溶解均匀后，调节pH到7.2-7.4，即得。 

2、磷酸盐吐温缓冲溶液(PBST溶液)的配制 

向上述制备的PBS溶液中加入吐温80，搅拌混匀，即得，其中每100mL的PBS溶液中加入0.01-0.2mL吐温80。 

本发明实施例中选用每100mL的PBS溶液中加入0.1mL吐温80。 

3、Percoll-蔗糖溶液分离介质 

将45mL Percoll液，8.55g蔗糖，溶解定容到100mL纯水中混匀，即得。 

密度为1.10-1.15g/cm³的Percoll-蔗糖溶液均适用于本发明。 

4、抗荧光衰退封片剂配制 

用一次性滴管称取甘油12.6g，接着将称好的甘油放到加热搅拌器加热至60-70℃，然后加0.2g DABCO(1，4-二偶氮双环[2，2，2]辛烷，美国Waterborne公司)到甘油中搅拌至溶解，即得。 

实施例2 

1)配制含“两虫”的浊水 

首先，用高岭土模拟浊度配制浊水，向10L去离子水中加入0.3485g高岭土，用磁力搅拌器搅拌使其彻底溶解，制得浊度为40NTU的浊水； 

然后，向浊水中投加隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊“两虫”标样各500个，使得每1L浊水中含隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊50个(各50个/L)，制得含“两虫”的浊水。 

2)沉淀、富集“两虫” 

向10L含“两虫”的浊水水样中加入氯化钙溶液和碳酸氢钠溶液，用磁力搅拌器搅拌均匀，其中每1L浊水中加入浓度为1mol/L的氯化钙溶液10mL，加入浓度为1mol/L的碳酸氢钠溶液10mL； 

接着加入浓度为10mol/L的氢氧化钠溶液，调节浊水水样的pH为10.00±0.05后，在碱性条件下生成碳酸钙沉淀，“两虫”随着生成的碳酸钙沉淀一起沉至底部，静置12h，去除上清液，得到富含“两虫”的沉淀。 

3)酸解离处理 

向富含“两虫”的沉淀中加入氨基磺酸溶液溶解碳酸钙沉淀，制得酸解离混合物，其中氨基磺酸溶液的浓度为1mol/L，用量为200mL； 

将酸解离混合物转移到500mL的离心杯中，用PBST溶液洗涤容器，洗涤液一并转移到离心杯中，进行离心处理(2000g，4℃，离心10min)，离心沉淀物用去离子水离心，洗涤至离心上清液为中性，即上清液的pH为7，获得酸解离“两虫”沉淀(0.3mL)，将溶液pH调至中性左右，可减小对“两虫”的破坏作用，并去掉部分杂质，便于后续的进一步纯化。 

4)分离纯化 

向酸解离“两虫”沉淀中加入6mLPBST溶液(PBST溶液与酸解离“两虫”沉淀的体积之比为20∶1)，置于涡旋震荡混合器(英国STUART公司)振荡2min，使沉淀均匀悬浮在PBST溶液中，制得沉淀悬浮液。 

将所得沉淀悬浮液平均分装到2个15mL的离心管中，然后加入PBST溶液定容到4mL，按照体积比为1∶2的比例，从离心管底部缓慢注入2mL密度为1.12g/cm³的Percoll-蔗糖溶液(即使2mL的Percoll-蔗糖溶液位于沉淀悬浮液的下部)，然后在1050g，20℃下离心10min，由于密度的差异，溶液分成三层，其中隐孢子虫卵囊和贾 第鞭毛虫孢囊会富集在中间层溶液，小心取出，即可获得纯化的隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊液，即第一“两虫“纯化液，装入新的50mL离心管内。 

向第一“两虫”纯化液中再次加入比重为1.12的Percoll-蔗糖溶液，第一“两虫”纯化液与Percoll-蔗糖溶液的体积之比为1∶2，然后在1050g，20℃下离心10min，溶液分成三层，取中间离心层，得到纯化的“两虫”液。 

对离心后的残渣添加4mLPBST溶液，从离心管底部缓慢注入2mL密度为1.12g/cm³的Percoll-蔗糖溶液(即使2mL的Percoll-蔗糖溶液位于沉淀悬浮液的下部)，然后在1050g，20℃下离心10min，由于密度的差异，溶液分成三层，其中隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊会富集在中间层溶液，小心取出，得到“两虫”纯化液入上述50mL离心管中。 

5)染色和镜检 

首先，对“两虫”纯化液进行抽滤，其中，抽滤的滤膜为孔径为3μm的醋酸纤维膜(CA膜)，抽滤过程中绝对压力为0-5mmHg(本发明抽滤时的绝对压力为2mmHg)，“两虫”附着在孔径为3μm的醋酸纤维膜上； 

接着，用2-3mLPBS淋洗，抽滤，然后加入500μL 1％BSA(牛血清白蛋白)溶液，静置2min，进行固定处理，随后抽吸掉多余的BSA溶液，将醋酸纤维膜平移到载玻片上，再滴加一滴单克隆抗体免疫荧光染色试剂(美国Waterborne公司)，在密闭的暗盒中静置20min，再加入4μg/mL的DAPI溶液100μL，再静置10min，进行染色处理； 

然后，抽滤去除多余的单克隆抗体荧光染色液，接着用2-3mL PBS溶液淋洗，再依次滴加体积百分比浓度为30％、70％、90％的甘油-乙醇溶液，对滤膜进行脱水处理，其中体积百分比浓度为30％、70％、90％的甘油-乙醇溶液的用量均为1.0-1.5mL，(本发明的用量为1.2mL)； 

最后，将脱水处理后的醋酸纤维膜平移至事先滴有抗荧光衰退封片剂的载玻片上，接着在醋酸纤维膜的上方滴加一滴抗荧光衰退封片剂，封片，置于奥林巴斯电动显微镜(型号BX51，日本奥林巴斯)下，进行镜检计数，其中： 

先用低倍镜(放大倍数：200倍)寻找贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊；400倍条件下，用蓝色滤光片(激发波长490nm，发射波长510nm)检测异硫氰酸荧光素单抗标记的卵囊或孢囊，用紫外光滤光片(激发波长400nm，发射波长420nm)检测DAPI染色条件下“两虫”的蓝色细胞核；1000倍条件下，利用DIC模式观察“两虫”内部形 态结构，其中呈椭圆形，大小为(8～15)μm×(5～8)μm，囊壁与虫体间有明显空隙，或者孢囊中含有2-4个核，多偏于一端，确认为贾第鞭毛虫孢囊；圆形或椭圆形，直径2～6μm，或者内部可见残留体及子孢子，确认为隐孢子虫卵囊。 

镜检的检测结果如表1所示，测定结果回收率如表2所示。 

表1 浊水中“两虫”检测结果 

表2 测定结果回收率 

由表1、表2的检测结果可见，本发明对采用高岭土制备的浊度为40NTU的浊水中“两虫”含量的检测方法达到EPA1623方法中的质量控制要求，贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊的平均回收率分别为42.89％和20.93％，标准偏差分别为8.08％和10.46％。表明本发明方法用于纯化分离以及检测水中“两虫”(即贾第鞭毛虫和隐孢子虫)的含量是准确、可行的。 

实施例3 

以黄浦江源水为样品，其原始浊度为56NTU。 

1)沉淀、富集“两虫” 

向10L黄浦江源水水样中加入氯化钙溶液和碳酸氢钠溶液，用磁力搅拌器搅拌均匀，其中每1L浊水中加入浓度为1mol/L的氯化钙溶液20mL，加入浓度为1mol/L的碳酸氢钠溶液20mL； 

接着加入浓度为10mol/L的氢氧化钠溶液，调节浊水水样的pH为10.00±0.05后，在碱性条件下生成碳酸钙沉淀，“两虫”随着生成的碳酸钙沉淀一起沉至底部，静置12h，去除上清液，得到富含“两虫”的沉淀。 

2)酸解离处理 

向富含“两虫”的沉淀中加入氨基磺酸溶液溶解碳酸钙沉淀，制得酸解离混合物，其中氨基磺酸溶液的浓度为2mol/L，用量为200mL； 

将酸解离混合物转移到500mL的离心杯中，用PBST溶液洗涤容器，洗涤液一并转移到离心杯中，进行离心处理(2000g，4℃，离心10min)，离心沉淀物用去离子水离心，洗涤至离心上清液为中性，即上清液的pH为7，获得酸解离“两虫”沉淀(约1.2mL)。 

3)分离纯化 

向酸解离“两虫”沉淀中加入30mLPBST溶液(PBST溶液与酸解离“两虫”沉淀的体积之比为25∶1)，置于涡旋震荡混合器振荡2min，使沉淀均匀悬浮在PBST溶液中，制得沉淀悬浮液。 

将所得沉淀悬浮液平均分装到8个15mL的离心管中，然后加入PBST溶液定容到4mL，按照体积比为1∶2的比例，从离心管底部缓慢注入2mL密度为1.10g/cm³的Percoll-蔗糖溶液(即使2mL的比重为1.10的Percoll-蔗糖溶液位于沉淀悬浮液的下部)，然后在1050g，20℃下离心10min，由于密度的差异，溶液分成三层，其中隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊会富集在中间层溶液，小心取出，即可获得隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊的纯化液，即第一“两虫“纯化液。 

向第一“两虫”纯化液中再次加入比重为1.12的Percoll-蔗糖溶液，第一“两虫”纯化液与Percoll-蔗糖溶液的体积之比为1∶2，然后在1050g，20℃下离心10min，溶液分成三层，取中间离心层，得到纯化的“两虫”液。 

4)染色和镜检 

首先，对“两虫”纯化液进行抽滤，其中，抽滤的滤膜为孔径为3μm的醋酸纤维膜(CA膜)，抽滤过程中绝对压力为2mmHg，“两虫”附着在孔径为3μm的醋酸纤维膜上； 

接着，用2-3mLPBS淋洗，抽滤，然后加入500μL 1％BSA(牛血清白蛋白)溶液，静置2min，进行固定处理，随后抽吸掉多余的BSA溶液，将醋酸纤维膜平移到载玻片上，再滴加一滴单克隆抗体免疫荧光染色试剂，在密闭的暗盒中静置20min，再加入4μg/mL的DAPI溶液100μL，再静置10min，进行染色处理； 

然后，抽滤去除多余的单克隆抗体荧光染色液，接着用3mL PBS溶液淋洗，再依 次滴加体积百分比浓度为30％、70％、90％的甘油-乙醇溶液，进行滤膜脱水处理，其中体积百分比浓度为30％、70％、90％的甘油-乙醇溶液的用量均为1.2mL； 

最后，将脱水处理后的醋酸纤维膜平移至事先滴有抗荧光衰退封片剂的载玻片上，接着在醋酸纤维膜的上方滴加一滴抗荧光衰退封片剂，封片，置于奥林巴斯电动显微镜下，进行镜检计数，其中： 

先用低倍镜(放大倍数：200倍)寻找贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊；400倍条件下，用蓝色滤光片(激发波长490nm，发射波长510nm)检测异硫氰酸荧光素单抗标记的卵囊或孢囊，用紫外光滤光片(激发波长400nm，发射波长420nm)检测DAPI染色条件下“两虫”的蓝色细胞核；1000倍条件下，利用DIC模式观察“两虫”内部形态结构，其中呈椭圆形，大小为(8～15)μm×(5～8)μm，囊壁与虫体间有明显空隙，或者孢囊中含有2-4个核，多偏于一端，确认为贾第鞭毛虫孢囊；圆形或椭圆形，直径2～6μm，或者内部可见残留体及子孢子，确认为隐孢子虫卵囊。 

镜检的检测结果如表3所示。 

表3 浊水中“两虫”检测结果 

实施例4 

1)配制含“两虫”的黄浦江源浊水 

以黄浦江源水为样品，其原始浊度为56NTU。 

向3.57L原始浊度为56NTU的黄浦江源水中加入6.43L纯水，用磁力搅拌器搅拌混匀，制得浊度为20NTU的黄浦江浊水10L； 

向10L浊度为20NTU的黄浦江源水中投加隐孢子虫卵囊和贾地鞭毛虫孢囊标样各500个，使得每1L黄浦江源水中含分别隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊50个，制得含“两虫”的黄浦江源浊水。 

2)沉淀、富集“两虫” 

向10L含“两虫”的浊水水样中加入氯化钙溶液和碳酸氢钠溶液，用磁力搅拌器搅拌，其中，每1L浊水中加入2mol/L的氯化钙溶液10mL，加入2mol/L的碳酸氢钠 溶液10mL。 

接着加入浓度为10mol/L的氢氧化钠溶液，调节浊水水样的pH为9.50后，在碱性条件下生成碳酸钙沉淀，“两虫”随着生成的碳酸钙沉淀一起沉至底部，静置24h，去除上清液，得到富含“两虫”的沉淀。 

3)酸解离处理 

向富含“两虫”的沉淀中加入氨基磺酸溶液溶解碳酸钙沉淀，制得酸解离混合物，其中氨基磺酸溶液的浓度为4mol/L，用量为100mL； 

将酸解离混合物转移到500mL的离心杯中，用PBST溶液洗涤容器，洗涤液一并转移到离心杯中，进行离心处理(2000g，4℃，离心10min)，离心沉淀物用去离子水离心，洗涤至离心上清液为中性，即上清液的pH为6.5，获得酸解离“两虫”沉淀(0.5mL)。 

4)分离纯化 

向酸解离“两虫”沉淀中加入11.5mLPBST溶液(PBST溶液与酸解离“两虫”沉淀的体积之比为23∶1)，置于涡旋震荡混合器振荡2min，使沉淀均匀悬浮在PBST溶液中，制得沉淀悬浮液。 

将所得沉淀悬浮液平均分装到3个15mL的离心管中，每个离心管为4mL，按照体积比为1∶2的比例，从离心管底部缓慢注入2mL密度为1.15g/cm³的Percoll-蔗糖溶液(即使2mL的Percoll-蔗糖溶液位于沉淀悬浮液的下部)，然后在1050g，20℃下离心10min，由于密度的差异，溶液分成三层，其中隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊会富集在中间层溶液，小心取出，即可获得纯化的隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊液，即第一“两虫“纯化液。 

向第一“两虫”纯化液中再次加入比重为1.15的Percoll-蔗糖溶液，第一“两虫”纯化液与Percoll-蔗糖溶液的体积之比为1∶2，然后在1050g，20℃下离心10min，溶液分成三层，取中间离心层，得到纯化的“两虫”液。 

5)染色和镜检 

首先，对“两虫”纯化液进行抽滤，其中，抽滤的滤膜为孔径为3μm的醋酸纤维膜(CA膜)，抽滤过程中绝对压力为2mmHg，“两虫”附着在孔径为3μm的醋酸纤维膜上； 

接着，用2-3mLPBS淋洗，抽滤，然后加入500μL 1％BSA(牛血清白蛋白)溶液， 静置2min，进行固定处理，随后抽吸掉多余的BSA溶液，将醋酸纤维膜平移到载玻片上，再滴加一滴单克隆抗体免疫荧光染色试剂，在密闭的暗盒中静置20min，再加入4μg/mL的DAPI溶液100μL，再静置10min，进行染色处理； 

然后，抽滤去除多余的单克隆抗体荧光染色液，接着用3mL PBS溶液淋洗，再依次滴加体积百分比浓度为30％、70％、90％的甘油-乙醇溶液，进行滤膜脱水处理，其中体积百分比浓度为30％、70％、90％的甘油-乙醇溶液的用量均为1.2mL； 

最后，将脱水处理后的醋酸纤维膜平移至事先滴有抗荧光衰退封片剂的载玻片上，接着在醋酸纤维膜的上方滴加一滴抗荧光衰退封片剂，封片，置于奥林巴斯电动显微镜下，进行镜检计数，其中： 

先用低倍镜(放大倍数：200倍)寻找贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊；400倍条件下，用蓝色滤光片(激发波长490nm，发射波长510nm)检测异硫氰酸荧光素单抗标记的卵囊或孢囊，用紫外光滤光片(激发波长400nm，发射波长420nm)检测DAPI染色条件下“两虫”的蓝色细胞核；1000倍条件下，利用DIC模式观察“两虫”内部形态结构，其中呈椭圆形，大小为(8～15)μm×(5～8)μm，囊壁与虫体间有明显空隙，或者孢囊中含有2-4个核，多偏于一端，确认为贾第鞭毛虫孢囊；圆形或椭圆形，直径2～6μm，或者内部可见残留体及子孢子，确认为隐孢子虫卵囊。 

镜检的检测结果如表4所示，测定结果回收率如表5所示。 

表4 浊水中“两虫”检测结果 

表5 测定结果回收率 

由表4、表5的检测结果可见，本发明黄浦江源水中“两虫”含量的检测方法达到EPA1623方法中的质量控制要求，贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊的平均回收率分别为 83.82％和45.79％，标准偏差分别为12.82％和8.23％。 

实施例5 

1)配制含“两虫”的黄浦江源浊水 

以黄浦江源水为样品，其原始浊度为56NTU。 

向7.15L原始浊度为56NTU的黄浦江源水中加入2.85L纯水，用磁力搅拌器搅拌混匀，制得浊度为40NTU的黄浦江浊水10L； 

向10L浊度为40NTU的黄浦江浊水中投加隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊标样各500个，使得每1L黄浦江源水中含分别隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫包囊50个，制得含“两虫”的黄浦江浊水。 

2)沉淀“两虫” 

向含“两虫”的浊水水样中加入氯化钙溶液和碳酸氢钠溶液，用磁力搅拌器搅拌，其中，每1L浊水中加入1mol/L的氯化钙溶液10mL，加入1mol/L的碳酸氢钠溶液10mL。 

接着加入氢氧化钠溶液，调节浊水水样的pH为10.50后，在碱性条件下生成碳酸钙沉淀，“两虫”随着生成的碳酸钙沉淀一起沉至底部，静置12h，去除上清液，得到富含“两虫”的沉淀。 

3)酸解离处理 

向富含“两虫”的沉淀中加入氨基磺酸溶液溶解碳酸钙沉淀，制得酸解离混合物，其中氨基磺酸溶液的浓度为2mol/L，用量为100mL； 

将酸解离混合物转移到500mL的离心杯中，用PBST溶液洗涤容器，洗涤液一并转移到离心杯中，进行离心处理(2000g，4℃，离心10min)，离心沉淀物用去离子水离心，洗涤至离心上清液为中性，即上清液的pH为6.5，获得酸解离“两虫”沉淀(1mL)。 

4)分离纯化 

向酸解离“两虫”沉淀中加入19mL PBST溶液(PBST溶液与酸解离“两虫”沉淀的体积之比为19∶1)，置于涡旋震荡混合器(英国STUART)振荡2min，使沉淀均匀悬浮在PBST溶液中，制得沉淀悬浮液。 

将所得沉淀悬浮液平均分装到5个15mL的离心管中，每个离心管为4mL，按照体 积比为1∶2的比例，从离心管底部缓慢注入2mL密度为1.12g/cm³的Percoll-蔗糖溶液(即使2mL的Percoll-蔗糖溶液位于沉淀悬浮液的下部)，然后在1050g，20℃下离心10min，由于密度的差异，溶液分成三层，其中隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊会富集在中间层溶液，小心取出，即可获得纯化的隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊液，即第一“两虫“纯化液。 

向第一“两虫”纯化液中再次加入比重为1.12的Percoll-蔗糖溶液，第一“两虫”纯化液与Percoll-蔗糖溶液的体积之比为1∶2，然后在1050g，20℃下离心10min，溶液分成三层，取中间离心层，得到纯化的“两虫”液。 

5)染色和镜检 

首先，对“两虫”纯化液进行抽滤，其中，抽滤的滤膜为孔径为3μm的醋酸纤维膜(CA膜)，抽滤过程中绝对压力为2mmHg，“两虫”附着在孔径为3μm的醋酸纤维膜上； 

接着，用2-3mLPBS淋洗，抽滤，然后加入500μL 1％BSA(牛血清白蛋白)溶液，静置2min，进行固定处理，随后抽吸掉多余的BSA溶液，将醋酸纤维膜平移到载玻片上，再滴加一滴单克隆抗体免疫荧光染色试剂，在密闭的暗盒中静置20min，再加入4μg/mL的DAPI溶液100μL，再静置10min，进行染色处理； 

然后，抽滤去除多余的单克隆抗体荧光染色液，接着用3mL PBS溶液淋洗，再依次滴加体积百分比浓度为30％、70％、90％的甘油-乙醇溶液，进行滤膜脱水处理，其中体积百分比浓度为30％、70％、90％的甘油-乙醇溶液的用量均为1.2mL； 

最后，将脱水处理后的醋酸纤维膜平移至事先滴有抗荧光衰退封片剂的载玻片上，接着在醋酸纤维膜的上方滴加一滴抗荧光衰退封片剂，封片，置于奥林巴斯电动显微镜下，进行镜检计数，其中： 

先用低倍镜(放大倍数：200倍)寻找贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊；400倍条件下，用蓝色滤光片(激发波长490nm，发射波长510nm)检测异硫氰酸荧光素单抗标记的卵囊或孢囊，用紫外光滤光片(激发波长400nm，发射波长420nm)检测DAPI染色条件下“两虫”的蓝色细胞核；1000倍条件下，利用DIC模式观察“两虫”内部形态结构，其中呈椭圆形，大小为(8～15)μm×(5～8)μm，囊壁与虫体间有明显空隙，或者孢囊中含有2-4个核，多偏于一端，确认为贾第鞭毛虫孢囊；圆形或椭圆形，直径2～6μm，或者内部可见残留体及子孢子，确认为隐孢子虫卵囊。 

镜检的检测结果如表6所示，测定结果回收率如表7所示。 

表6 浊水中“两虫”检测结果 

表7 测定结果回收率 

由表6、表7的检测结果可见，本发明黄浦江源水中“两虫”含量的检测方法达到EPA1623方法中的质量控制要求，贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊的平均回收率分别为84.06％和38.92％，标准偏差分别为17.02％和19.57％。 

由上述检测结果表明： 

1、本发明针对浊水条件下“两虫”(即隐孢子虫和贾第鞭毛虫)的富集及分离纯化方法是确实可行的，在混浊水条件下隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测方法回收率高，其中贾第鞭毛虫的回收率达(34.56-98.61)％，隐孢子虫的回收率可达(14.40-61.51)％； 

2、本发明方法去除浑浊水中杂质完全，显微镜观察“两虫”过程中背景杂质干扰少，“两虫”含量的检测结果准确，符合EPA1623方法中的质量控制要求(即贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊的回收率分别为15-118％和13-111％，标准偏差分别为＜30％和＜61％。 

3、本发明方法使用的仪器设备、耗材价廉，方法操作简便，达到了降低测试成本的目的。 

Claims (10)

1.一种水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的富集和纯化方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)沉降、富集处理

向水样中加入氯化钙和碳酸氢钠，然后调节水样的pH，在碱性条件下隐孢子虫和贾第鞭毛虫随着生成的碳酸钙沉淀一起沉降，得到隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀；

2)酸解离处理

向隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入酸性物质，酸解离处理，碳酸钙沉淀溶解，得到酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀；

(3)纯化处理

向酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入磷酸盐-吐温缓冲溶液，混匀，制成隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液，接着向悬浮液中加入Percoll-蔗糖介质，然后进行密度梯度离心处理，离心混合液分为3层，取中间层，得纯化的隐孢子虫和贾第鞭毛虫。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中所述水样的浊度≥20NTU。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中每10L水样中加入0.1-0.2mol的氯化钙。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中调节水的pH值为9.50-10.50。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(2)中每10L水样中加入0.2-0.4mol的酸性物质。

6.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(3)中所述磷酸盐-吐温缓冲溶液按照如下步骤制备而成：

A)按照如下用量备料(以1L水量计)

NaCl              8.0g

Na₂HPO₄·12H₂O    2.9g

KCl            0.2g

KH₂PO₄         0.2g

B)将上述原料加入到1000mL纯水中，搅拌溶解均匀后，调节pH到7.2-7.4，制得磷酸盐缓冲溶液；

C)向磷酸盐缓冲溶液中加入吐温80，搅拌混匀，即得，其中每100mL磷酸盐缓冲溶液中加入0.01-0.2mL的吐温80。

7.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(3)中加入的磷酸盐-吐温缓冲溶液的体积与所述酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀的体积之比为10-30∶1。

8.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(3)中所述Percoll-蔗糖介质的密度为1.10-1.15g/cm³。

9.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(3)中加入的Percoll-蔗糖介质与所述隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液的体积之比为1∶2。

10.一种水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的测定方法，包括如下顺序进行的步骤：

(1)沉降、富集处理

向水样中加入氯化钙和碳酸氢钠，然后加入氢氧化钠调节水的pH值至碱性，在碱性条件下隐孢子虫和贾第鞭毛虫随着生成的碳酸钙沉淀一起沉降，得到隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀；

(2)酸解离处理

向隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入酸性物质，酸解离处理，碳酸钙沉淀溶解，得到酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀；

(3)纯化处理

向酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入磷酸盐-吐温缓冲溶液，混匀，制成隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液，接着向悬浮液中加入Percoll-蔗糖介质，然后进行密度梯度离心处理，离心混合液分为3层，取中间层，得隐孢子虫和贾第鞭毛虫纯化液；

(4)染色、镜检

首先，对隐孢子虫和贾第鞭毛虫纯化液进行过滤处理，接着进行染色处理，然后置于显微镜下观察，镜检计数。