CN103571749A - 一种用于处理烟草废弃物的at发酵基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于处理烟草废弃物的AT发酵基及其制备方法，其菌种配方及其质量百分比如下：纳豆芽孢杆菌5-50%，草酸青霉菌HB09-45-50%，巨大芽孢杆菌5-50%，热普通链霉菌HD12-410-70%。本发明的AT发酵基能克服烟草废弃物中烟碱的影响，实现快速升温腐熟，在腐熟过程中产生60度以上高温，并持续一周以上，可以有效杀灭病原菌、虫卵、杂草种子等，通过高温高压分离器处理及高温腐熟使烟草废弃物中的大分子物质迅速转化为可被吸收利用的小分子物质，如小分子糖、氨基酸等。可起到降低土壤容重、促进形成土壤团粒结构、培肥地力、提高土壤微生物活性，有效防止土传病害发生、提高烟草蔬果品质等功效。

Description

一种用于处理烟草废弃物的AT发酵基及其制备方法

技术领域

本发明属于烟草废弃物处理技术领域，具体涉及一种用于处理烟草废弃物的AT发酵基及其制备工艺。

背景技术

化学农业面临着环境污染、生态破坏、资源耗竭等问题。因此，通过发展循环经济，探索一种优质、高效、可循环的新型农业生产方式，形成“资源→农产品→再生资源→农产品”的生产模式，成为现代农业发展的重要任务。

烟草是我国农村经济的主导产业之一，全国烟草种植面积达1500多万亩。烟草生长需要大量的钾、磷元素，每年都需要向土壤中补充钾、磷资源。而底脚叶、烟梗、烟花、烟杈和部分顶叶等烟草废弃物中，含有大量易于吸收的钾、磷等营养元素。所以，烟草废弃物处理是实现烟草可持续发展的重要途径。

由于烟叶中含有烟碱等不利于微生物生长的成分，所以传统的HM腐熟剂并不能很好的对烟叶进行腐熟，现有技术中一般的处理方法是田间地头就地掩埋，容易造成病毒重复感染。有些地方是建处理池，浪费资源。由于烟草废弃物中携带有大量的病毒、病菌和虫卵。如果无害化处理不彻底，就会将这些病原菌带回土壤，造成污染。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种用于处理烟草废弃物的AT(obsolete tabacum )发酵基及其制备工艺。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的用于处理烟草废弃物的AT发酵基，其特征在于其菌种配方及其质量百分比如下：纳豆芽孢杆菌5-50%，草酸青霉菌（Penicillium oxalicun）HB09-4（分类命名：草酸青霉菌，拉丁文学名：Penicillium oxalicun，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012年7月17日，保藏编号：6321）5-50%，巨大芽孢杆菌5-50%，热普通链霉菌（Streptomyces thermovulgaris）HD12-4 （分类命名：热普通链霉菌，拉丁文学名：Streptomyces thermovulgaris，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012年7月17日，保藏编号：6322）10-70%。

本发明的用于处理烟草废弃物的AT发酵基，优选配方如下：纳豆芽孢杆菌10-30%，草酸青霉菌HB09-4 20-40%，巨大芽孢杆菌10-30%，热普通链霉菌HD12-4 20-40%。

本发明的用于处理烟草废弃物的AT发酵基的制备工艺，包括下述步骤：

（1）三角瓶液体培养：在500ml三角瓶中装200ml肉汤液体培养基，灭菌后分别接入2环斜面试管中的巨大芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌，32度摇床培养15小时，进行罐体扩繁；在500ml三角瓶中装200mlPDA液体培养基，灭菌后分别接入2环斜面试管中的纳豆芽孢杆菌和草酸青霉HB09-4，25-30度摇床培养17-18小时，进行罐体扩繁；在500ml三角瓶中装200ml高氏一号液体培养基，灭菌后分别接入2环斜面试管中的热普通链霉菌HD12-4，50-55度摇床培养17-18小时，进行罐体扩繁； 

（2）固体培养：将巨大芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的罐体液体接种已灭菌的固体载体麸皮100%中进行吸附，液体与固体的比例为1：2.4，然后进行烘干；将纳豆芽孢杆菌和草酸青霉罐体培养液分解接种到固体培养基豆粕：13%，玉米面：10%，麸皮：60%，白面：12%中，接种量为7.5%，充分搅匀后放在低部网状透气的托盘中，在30度的条件下培养3天；将热普通链霉菌罐体培养液分解接种到固体培养基豆粕：15%，玉米面：35%，麸皮：45%，锯末：5%中，接种量为7.5%，充分搅匀后放在已灭菌的铝制桶内，桶底有小孔为增加透气量，在50-55度的条件下培养2天；

（3）复配：将以上培养好的固体菌剂进行烘干或无菌通风处晾干，按照纳豆芽孢杆菌5-50，草酸青霉5-50，巨大芽孢杆菌5-50，热普通链霉菌10-70的比例混合而成，固体发酵基的菌含量为4-6亿/克。

本发明涉及的草酸青霉菌HB09-4已于2012年7月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，分类命名：草酸青霉菌，拉丁文学名：Penicillium oxalicun，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012年7月17日，保藏编号：6321。

所述的菌株采集于烟田地头废弃烟秆堆积土壤和原始森林枯树土壤中。

菌落形态及显微特征如下：

菌种在麦芽汁培养基上生长较快，25℃黑暗条件下4天，菌落直径19-21mm，质地绒状，灰绿，铺展，产孢结构大量形成；菌落背面浅褐色，无水溶性色素。

分生孢子梗高大，壁光滑，帚状枝2轮生，排列紧密，瓶梗柱状，颈部短，8.2-13.6*2.5-3.5 m；分生孢子椭圆形，浅绿色，壁光滑，3.5-6.9*2.0-3.3 m。未见有性态产袍结构。

本发明涉及的热普通链霉菌HD12-4已于2012年7月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，分类命名：热普通链霉菌，拉丁文学名：Streptomyces thermovulgaris，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012年7月17日，保藏编号：6322。

所述的菌株采集于烟田地头废弃烟秆堆积土壤和原始森林枯树土壤中。

形态及理化特征如下：

（1）培养特征

培养特征	气生菌丝	基内菌丝	可溶性色素
				察氏培养基	灰褐色	浅土褐色	无
葡萄糖天冬素培养基	白色	乳白	无
				甘油天冬素培养基	白色	乳白	无
无机盐淀粉培养基	灰褐色	土褐色	无
				ISP-2培养基	很少	浅土黄色	无
燕麦粉培养基	很少	乳白	无
				高氏一号培养基	白色	乳白	无
桑塔氏培养基	很少	土黄色	无

（2）显微特征：孢子丝直、柔曲、钩状、螺旋形、柔曲，直。孢子椭圆形。

（3）生理生化特征：

本发明涉及的纳豆芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌，购于中国科学院微生物研究所；本发明涉及的巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌，购于中国科学院微生物研究所。

本发明的AT发酵基能克服烟草废弃物中烟碱的影响，实现快速升温腐熟，在腐熟过程中产生60度以上高温，并持续一周以上，可以有效杀灭病原菌、虫卵、杂草种子等，通过高温高压装置处理及高温腐熟使烟草废弃物中的大分子物质迅速转化为可被吸收利用的小分子物质，如小分子糖、氨基酸等。可起到降低土壤容重、促进形成土壤团粒结构、培肥地力、提高土壤微生物活性，有效防止土传病害发生、提高烟草蔬果品质等功效。

具体实施方式

实施例1

（1）三角瓶液体培养

在500ml三角瓶中装200ml肉汤液体培养基，灭菌后分别接入2环斜面试管中的巨大芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌，32度摇床培养15小时，进行罐体扩繁。

在500ml三角瓶中装200mlPDA液体培养基，灭菌后分别接入2环斜面试管中的纳豆芽孢杆菌和草酸青霉，25-30度摇床培养17-18小时，进行罐体扩繁。

在500ml三角瓶中装200ml高氏一号液体培养基，灭菌后分别接入2环斜面试管中的热普通链霉菌，50-55度摇床培养17-18小时，进行罐体扩繁。 

（2）固体培养

将巨大芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的罐体液体接种已灭菌的固体载体麸皮100%中进行吸附，液体与固体的比例为1：2.4，然后进行烘干。

将纳豆芽孢杆菌和草酸青霉罐体培养液分解接种到固体培养基豆粕：13%，玉米面：10%，麸皮：60%，白面：12%中，接种量为7.5%，充分搅匀后放在低部网状透气的托盘中，在30度的条件下培养3天。

将热普通链霉菌罐体培养液分解接种到固体培养基豆粕：15%，玉米面：35%，麸皮：45%，锯末：5%中，接种量为7.5%，充分搅匀后放在已灭菌的铝制桶内，桶底有小孔为增加透气量，在50-55度的条件下培养2天；

（3）复配：将以上培养好的固体菌剂进行烘干或无菌通风处晾干，质量比按照纳豆芽孢杆菌20%，草酸青霉30%，巨大芽孢杆菌20%，热普通链霉菌30%的比例混合而成，固体发酵基的菌含量为4-6亿/克。

实施例2

重复实施例1的方法，不同的是: 质量比按照纳豆芽孢杆菌20%，草酸青霉20%，巨大芽孢杆菌20%，热普通链霉菌40%的比例混合而成，固体发酵基的菌含量为4-6亿/克。

实施例3

重复实施例1的方法，不同的是: 质量比按照纳豆芽孢杆菌20%，草酸青霉20%，巨大芽孢杆菌10%，热普通链霉菌50%的比例混合而成，固体发酵基的菌含量为4-6亿/克。

实施例4

重复实施例1的方法，不同的是: 质量比按照纳豆芽孢杆菌10%，草酸青霉10%，巨大芽孢杆菌10%，热普通链霉菌70%的比例混合而成，固体发酵基的菌含量为4-6亿/克。

实施例5

重复实施例1的方法，不同的是: 质量比按照纳豆芽孢杆菌10%，草酸青霉20%，巨大芽孢杆菌50%，热普通链霉菌20%的比例混合而成，固体发酵基的菌含量为4-6亿/克。

实施例6

重复实施例1的方法，不同的是: 质量比按照纳豆芽孢杆菌50%，草酸青霉15%，巨大芽孢杆菌15%，热普通链霉菌20%的比例混合而成，固体发酵基的菌含量为4-6亿/克。

实施例7

重复实施例1的方法，不同的是: 质量比按照纳豆芽孢杆菌5%，草酸青霉50%，巨大芽孢杆菌35%，热普通链霉菌10%的比例混合而成，固体发酵基的菌含量为4-6亿/克。

AT发酵基对烟草废弃物高温腐熟的效果：

1.实验目的

通过不同处理对烟草废弃物(烟秆、不适用烟叶)堆腐试验中腐熟温度、总N、P、K，C/N、木质素降解率、AT发酵基（草酸青霉、热普通链霉菌）对烟碱的适应性、种子发芽指数（GI）的动态变化及其对烟草废弃物堆肥产品品质的影响的对比，说明AT发酵基对烟草废弃物处理有相对的优势，为规模化处理提供依据。

2.实验材料

2.1烟草废弃物：烟叶直接粉碎、烟秆粉碎与高温高压分离处理

烟草废弃物的理化指标：有机物：78.24% 、 木质素含量约45-50% 、N:1.11%  P:0.58%  K: 1.64%  烟碱（Nicotine）俗名尼古丁，烟叶含量:约为1-3%，烟秆含量约为0.3-1.1％, 因烟草品种不同而有区别。

2.2营养添加物：质量比为1:1的麸皮和玉米粉的混合物

2.3 本发明实施例1的AT发酵基

2.4一般腐熟菌剂：采用中国专利CN101838613A公开的腐熟菌剂。

3.实验方法

3.1实验处理

处理	组合
		处理一	烟草废弃物（70%）+营养添加物（30%）
处理二	烟草废弃物（70%）+营养添加物（30%）+一般腐熟菌剂(1‰)
		处理三	烟草废弃物（70%）+营养添加物（30%）+AT发酵基(1‰)

3.2堆肥方法

发酵物水分50-60%，堆长不限，堆宽1.5m ，堆高0.8m

3.3研究对象

温度、总N、P、K ，C/N、木质素降解率、种子发芽率、AT发酵基（草酸青霉、热普通链霉菌）对烟碱的适应性。

实验结果与分析

结果表明,添加AT发酵基缩短了烟草废弃物堆肥达到高温的时间,延长了高温分解持续时间,增加全氮含量,加快物料N、P、K和C/N比的降解速率,提高种子发芽指数（GI）, AT发酵基（草酸青霉、热普通链霉菌）对烟秆与不适应烟叶中的烟碱具有亲和性、适应性，能分解烟草废弃物。加快了烟草废弃物堆肥腐熟化进程。

4.1 AT发酵基对烟草废弃物发酵温度在影响

处理一24h时温度为35℃,最高温度为48℃；处理二24h时温度为45℃,3d时进入高温分解阶段，最高温度为56℃，高温持续时间3d；处理三24h时温度为55℃,当天即进入高温分解阶段，最高温度达到68℃,高温持续时间7-10d。处理三较处理二提前2d进入高温分解阶段,高温持续时间分别延长4-6d，且处理三最高温度明显高于处理二和处理一，分别高出12℃、20℃。

研究发现，木质纤维素主要在高温阶段被分解， AT发酵基中的高温菌菌株加速堆体升温，加快堆肥底物中木质纤维类物质的分解，从而缩短堆肥腐熟的周期。

4.2 AT发酵基对烟草废弃物品质在影响

三种处理充分腐熟后分别测其营养成分含量如下：

处理	N（%）	P（%）	K（%）
				处理一	0.99	1.58	2.64
处理二	1.09	2.08	3.15
				处理三	1.11	2.83	4.33

添加AT发酵基菌剂的处理可以显著增加烟草废弃物堆肥产品的总N、P、K养分含量。处理二比处理一总N增加10.1%，总P增加31.6%，总K增加19.3%;处理三比处理二总N增加1.8%，总P增加36.1%，总K增加37.5%。

烟草废弃物中P、K等营养元素含量较高，但多与有机质组成复合物，不能被有效利用，AT发酵基中有专门分解有机磷、有机钾的菌种，从而促进烟草废弃物中P、K成分分解释放。

4.3 C/N

堆肥需要适宜的C/N，一搬堆肥中要求适宜的C/N为（25-30）：1，当C/N过低，不能为微生物提供足够的能源物质，当C/N过高，堆肥过程中需氧要求提高而产生大量的臭气。烟草废弃物的C/N较高约36，用营养添加物（麸皮、玉米粉）作调理剂，调节堆肥的C/N到25左右。

C/N是堆肥腐熟在一项重要指标，当 C/N达到（15-20）：1时，认为堆肥腐熟。

堆肥腐熟至3d,处理一、二、三的C/N比分别为28.7、27.1、26.8 ，7d时处理一、二、三的C/N比分别为25.8、23.3、22.1，11d时处理三的C/N降至18.6，达到腐熟标准。由此可见，添加AT发酵基的烟草堆发酵效果明显较好。

4.4 AT发酵基对木质素降解效率的影响

烟秆中木质化程度较高，木质素含量约45-50%，经木质纤维分离处理后木质素含量仍在30%左右。而一般玉米秸秆木质素含量约15-20%,因此木质纤维素的降解是限制烟秆堆肥腐熟的主要因素。

堆肥至15d时，此时处理一、二、三木质素含量分别28.2%、24.4%、12.7%。处理一木质素基本无降解，处理二含量略有降低，处理三降解效果显著。

AT发酵基中有高效降解木质纤维素的菌株，可产生胞外木质纤维素分解酶,活性远远高于细菌的孢内酶类，加快堆肥底物中木质纤维类物质的分解速率及效率。

4.5 AT发酵基对种子发芽指数（GI）在影响

用生物学的方法测定堆肥的植物毒性是检验堆肥腐熟度的有效方法，种子发芽指数无害化、稳定程度的重要指标。

至堆肥7d,各处理种子的发芽指数分别为：28.8%，58.2%，82.1%，其中以处理三的发芽指数上升速度最快，至堆肥至15d，各处理种子的发芽指数分别为：66.8%,72%,86%，处理三已完全满足了腐熟要求。添加AT发酵基可有效提高种子发芽指数。

4.6  AT发酵基（草酸青霉、热普通链霉菌）对烟碱的适应性

将AT发酵基和普通腐熟剂制成同等比例的菌液，分别接种到以烟草废弃物（烟秆占70％，不适用烟叶占30％）基质上，观察它们的生长情况。结果发现，接种24h后AT发酵基的烟草废弃物基质上开始出现白色菌丝，至48h时已长出大量的白色菌丝，而此时接种普通腐熟剂的烟草废弃物基质上只有少量菌丝，随后，接种AT发酵基的烟草废弃物基质布满叶脉表面的菌丝大约可持续几天，同时产生部分孢子．接种普通腐熟剂的烟草废弃物基质的菌丝没有明显的变化。由此可见添加AT发酵基（青霉、链霉）对烟秆与不适应烟叶中的烟碱具有较强的亲和性、适应性。

实验结论：

 1．不添加菌剂的烟草废弃物堆腐发酵的过程中，升温速度慢，不能进入高温分解阶段，种子发芽指数较低，腐熟化进程较慢，腐熟程度较低。

 2、添加一搬腐熟菌剂的烟草废弃物堆腐发酵过程中，升温速度较慢，进入高温分解阶段的时间较长，高温持续时间较短，而且对多数菌剂有抑制作用。

 3．添加AT发酵菌剂的烟草废弃物堆腐过程中升温速度较快，，堆体迅速进入高温分解阶段，高温持续时间延长，缩短堆肥发酵时间，可促进C/N降低，显著提高种子发芽指数，并且可显著提高堆肥产品的总氮、总磷、总钾的含量，提高堆肥产品的质量。

Claims (3)

1.一种用于处理烟草废弃物的AT发酵基，其特征在于其菌种配方及其质量百分比如下：纳豆芽孢杆菌5-50%，草酸青霉菌HB09-4 5-50%，巨大芽孢杆菌5-50%，热普通链霉菌HD12-4 10-70%。

2.根据权利要求1所述的用于处理烟草废弃物的AT发酵基，其特征在于其菌种配方及其质量百分比如下：纳豆芽孢杆菌10-30%，草酸青霉菌HB09-4 20-40%，巨大芽孢杆菌10-30%，热普通链霉菌HD12-4 20-40%。

3.权利要求1所述的用于处理烟草废弃物的AT发酵基的制备工艺，其特征在于包括下述步骤：

（1）三角瓶液体培养：在500ml三角瓶中装200ml肉汤液体培养基，灭菌后分别接入2环斜面试管中的巨大芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌，32度摇床培养15小时，进行罐体扩繁；在500ml三角瓶中装200mlPDA液体培养基，灭菌后分别接入2环斜面试管中的纳豆芽孢杆菌和草酸青霉HB09-4，25-30度摇床培养17-18小时，进行罐体扩繁；在500ml三角瓶中装200ml高氏一号液体培养基，灭菌后分别接入2环斜面试管中的热普通链霉菌HD12-4，50-55度摇床培养17-18小时，进行罐体扩繁； 

（2）固体培养：将巨大芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的罐体液体接种已灭菌的固体载体麸皮100%中进行吸附，液体与固体的比例为1：2.4，然后进行烘干；将纳豆芽孢杆菌和草酸青霉罐体培养液分解接种到固体培养基豆粕：13%，玉米面：10%，麸皮：60%，白面：12%中，接种量为7.5%，充分搅匀后放在低部网状透气的托盘中，在30度的条件下培养3天；将热普通链霉菌罐体培养液分解接种到固体培养基豆粕：15%，玉米面：35%，麸皮：45%，锯末：5%中，接种量为7.5%，充分搅匀后放在已灭菌的铝制桶内，桶底有小孔为增加透气量，在50-55度的条件下培养2天；

（3）复配：将以上培养好的固体菌剂进行烘干或无菌通风处晾干，按照纳豆芽孢杆菌5-50，草酸青霉5-50，巨大芽孢杆菌5-50，热普通链霉菌10-70的比例混合而成，固体发酵基的菌含量为4-6亿/克。