CN103566363B - 避孕微针的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫学领域，特别涉及避孕疫苗的研制技术，具体为避孕微针的制备方法，具体包括以下步骤：将筛选的人Eppin蛋白优势抗原表位序列和/或具有自组装形成纳米纤维结构的多肽序列串联，得表位肽；将步骤A所得的表位肽充分溶解于超纯水中，并与PBS混合，得自组装系统工作液；将微针浸泡至自组装系统工作液中不少于5分钟，取出后，晾干，得避孕微针。避孕疫苗经皮微针给药与皮下注射相比能提高疫苗保护效率和生物利用度，E-Q11自组装纳米疫苗具有良好的安全性和有效性。

Description

避孕微针的制备方法

技术领域

本发明属于免疫学领域，特别涉及避孕疫苗的研制技术。

背景技术

世界人口的持续增长和非意愿性妊娠的高发生率是困扰人类生存健康和社会经济，发展的严峻问题。免疫性避孕被广大研究者认为能够满足上述新一代避孕措施的需求，因而成为生殖与避孕领域研究的焦点和极具研究前景的避孕途径。避孕疫苗(contraceptivevaccine,CV)起源于免疫性不孕患者体内存在生育抑制相关的特异性抗体，免疫性避孕的作用原理是选择与生殖过程密切相关关键抗原成分制成疫苗，诱导受者产生特异性免疫应答，通过高效、特异地抑制精或卵子发生、影响精子活力、顶体反应或获能、干扰精卵相互作用、结合或融合，及阻断胚胎种植或发育的一个或多个环节，从而达到控制生育的目的。目前，避疫苗的研究主要集中在靶抗原的筛选，而在疫苗设计和免疫策略的研究方面落后于他治疗性和预防性疫苗。截至目前，已有数量众多的免疫避孕靶抗原被筛选出来，是仅有人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin，HCG)嵌合肽疫苗进入临试验，因而，有必要在现有免疫避孕靶抗原的基础上，结合在其他治疗性和预性疫苗中成功应用的疫苗设计和免疫策略，深入挖掘现有免疫避孕靶抗原的潜力，使得更多的避孕疫苗有望进入临床。

近年来，基于Eppin的避孕疫苗研究取得了一定的进展，但仍存在以下问题：(1)采用Eppin优势表位疫苗进行免疫能减少不良反应，但免疫原性差；(2)表位交联载体蛋白的方法可以增强免疫原性，但所产生的抗体特异性差；(3)基于Eppin的避孕疫苗实验研究中通常联合使用免疫佐剂如弗氏佐剂，其在人体中的应用存在安全性问题；因此，解决这一问题的关键在于构建更加安全、有效的避孕疫苗运载体系。

微针透皮给药是一种集合注射给药和经皮贴剂为一体的新型透皮给药平台技术。在很小的面积上，以数百根微针刺穿皮肤角质层，使药物进入表皮层而被表皮中朗格汉斯细胞(LC)直接摄取。既允许药物通过角质层这个重要的屏障，又避开真皮层的神经不会引起痛觉。可以减少注射器使用带来的副作用，避免口服免疫引起的肝脏首过效应和消化道酶、胃酸对抗原的破坏，避免滴鼻免疫造成的大部分抗原流入食道的缺点。微针作为疫苗免疫途径，可诱导系统免疫和黏膜免疫的双重功效，具有精确、无痛、安全、高效、便利等优点。微针给药对药物的极性、渗透系数、熔点等都没有限制，大大拓宽候选药物的范围。而与其他致孔促渗给药比较，微针显示对皮肤较小的损伤性。目前，微针结合免疫性避孕的研究还比较少。

本发明是针对上述不足之处提出改进的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供避孕微针的制备方法，其操作简单，适用于规模生产。其制备的避孕微针避孕效果明显。

避孕微针的制备方法，具体包括以下步骤：

A附睾蛋白酶抑制蛋白的表位肽的合成

将筛选的人Eppin蛋白的优势抗原表位的序列(详见表1)和具有自组装形成纳米纤维结构的多肽的序列串联，得表位肽；

表1Eppin氨基酸优势抗原表位序列筛选

人Eppin蛋白的优势抗原表位的序列与具有自组装形成纳米纤维结构的多肽的序列串联，其原理的结构示意图详见图1，其目的在于增强Eppin蛋白的优势表位避孕疫苗免疫原性。自组装形成纳米纤维结构的多肽序列是指利用多肽分子之间的氢键、疏水性作用、π-π堆积作用等非共价键力自发或触发地自组装形成形态与结构特异的组装体，参见：1)RamanS.Structure-baseddesignofpeptidesthatself-assembleintoregularpolyhedralnanoparticles.Nanomedicine:Nanotechnology,BiologyandMedicine2006.2)KabaSA,ANonadjuvantedPolypeptideNanoparticleVaccineConfersLong-LastingProtectionagainstRodentMalaria.TheJournalofImmunology2009；3)RudraJS,Aself-assemblingpeptideactingasanimmuneadjuvant.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences2010；4)RudraJS,Self-assembledpeptidenanofibersraisingdurableantibodyresponsesagainstamalariaepitope.Biomaterials2012。

B自组装系统的构建

将步骤A所得的表位肽充分溶解于超纯水中，并与PBS混合，得自组装系统工作液；这种自组装纳米纤维体系具有免疫佐剂和疫苗载体的作用，机制在于自组装纳米纤维体系能利用自身形成的β折叠结构，将多肽抗原重复表达于纳米纤维表面，从而增强免疫细胞对多肽抗原的识别，提高多肽抗原的免疫活性。另一方面，还可以利用DNA本身带负电荷，设计阳离子肽进行混合，利用两者之间的静电作用制备自组装纳米疫苗。如ShenZ-g,InductionofspecificimmuneresponseandsuppressionoffertilitybyB-cell-epitope-basedmimovirusvaccine.Reproduction2011一文设计制备了基于Eppin的B细胞优势表位的阳离子肽(Eppin-TAT)，以及基于Eppin的B细胞优势表位基因片段的重组质粒(3Eppin103–115-PADRE-3C3d)，通过调整混合条件获得了粒径为30～50nm的颗粒疫苗。将该颗粒疫苗直接免疫小鼠后获得了较高滴度的抗Eppin抗体反应和良好的抗生育效应。

C微针的包被

将微针浸泡至自组装系统工作液中不少于5分钟，目的在于使抗原包被微针，取出后，晾干，得避孕微针。微针是一种直接在皮肤表面应用抗原的透皮免疫将更有利于疫苗发挥其生物学功能的给药装置，其集合注射给药和经皮贴剂为一体的新型透皮给药平台技术，在很小的面积上，以数百根微针刺穿皮肤角质层，使药物进入表皮层而被表皮中朗格汉斯细胞(LC)直接摄取。

进一步，所述的避孕微针的制备方法，所述人Eppin蛋白的优势抗原表位的序列如SEQIDNO:1所示，通过人工合成肽技术固相合成。

进一步，所述的避孕微针的制备方法，所述自组装形成纳米纤维结构的多肽序列如SEQIDNO:2所示，通过人工合成肽技术固相合成。

进一步，所述的避孕微针的制备方法，所述人Eppin蛋白优势抗原表位序列和所述自组装形成纳米纤维结构的多肽序列组成的表位肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。

进一步，所述的避孕微针的制备方法，步骤B中，所述表位肽与所述PBS的体积比为1：3～6，所述多肽的浓度为8mM。

进一步，所述的避孕微针的制备方法，步骤C中，所述微针为SkinStamp图章型微针。

进一步，所述的避孕微针的制备方法，步骤C中，将自组装系统工作液置于与所述微针匹配的微针池中，每个微针池内加入8μL自组装系统工作液，液面高度约为微针池深度的3/4，再将所述SkinStamp图章型微针垂直置入匹配的微孔，保持5min后，垂直取出，室温下静置10min使包被液晾干。

进一步，所述的避孕微针的制备方法，步骤C中，所述微针池的制备采用激光蚀刻钻孔工艺，在厚度为1mm聚四氟乙烯板表面制备与微针阵列相匹配的微针池，微针池的直径200μm，深度为400μm，每个微针池作为每个微针浸渍包被时的单独容器。

本发明的有益效果在于：1)500μm长度的微针适合用于小鼠经皮免疫，荧光标记后的抗原包被的微针刺入小鼠皮肤能在60s内释放78％的抗原量，微针能有效包被上述三种抗原。2)各组抗体滴度在初免后2周开始逐渐上升，于免疫结束后2～4周达到高峰，持续8～9个月。3)低剂量的所述融合表位肽和rhEppin经皮微针免疫比低剂量皮下注射免疫抗体反应强，与高剂量皮下注射的抗体反应水平相似(实施例补充对应数据)。4)采用微针免疫时，各组均产生了高浓度的(IL-4)Th2细胞和低浓度的(IFNγ)Th1细胞，采用经皮微针免疫途径能增强Th2型免疫反应。5)所述融合表位肽组小鼠的生育力均受到抑制，其中EQ10-MN组受孕率最低为20％，各组小鼠的生育力于36周后均得到恢复。6)与PBS对照组相比，各实验组精子计数无明显变化，而精子活力和HOS％显著下降。提示避孕疫苗经皮微针给药能提高疫苗保护效率和生物利用度，所述融合表位肽及避孕微针具有良好的安全性和有效性。

附图说明

图1为基于人Eppin蛋白的优势抗原表位的自组装纳米多肽设计的示意图。

图2为图2-A为E-Q11肽(所述融合表位肽)的HPLC分析图，图2-B为E-Q11肽MS分析图。

图3为自组装形成纳米纤维结构图，其中，图3-A为所述Q11肽(如SEQIDNO:2所示)典型的纳米纤维结构(PBS稀释1h)，图3-B为Q11肽呈现纳米纤维结构(PBS稀释6h)，图3-C为Q11肽呈现纳米纤维结构(PBS稀释12h)，图3-D为E-Q11肽(即所述融合表位肽)呈现纳米纤维结构(PBS稀释1h)，图3-E为E-Q11肽呈现纳米纤维结构(PBS稀释6h)，图3-F为E-Q11肽呈现纳米纤维结构(PBS稀释12h)，图3-G为E-Q11肽呈现纳米纤维结构(PBS稀释24h)，图3-H为E肽(如SEQIDNO:1所示)未见纳米纤维结构，可见无规则的聚集体结构。

图4为圆二色谱分析图，其中，图4-A为Q11肽圆二色谱分析，图4-B为E-Q11肽圆二色谱分析，图4-C为E肽圆二色谱分析。

图5为小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDCs)的培养图，其中，图5-A为培养第三天的细胞在40倍下的照片，图5-B为培养第三天的细胞在400倍下的照片，图5-C为培养第五天的细胞在40倍下的照片，图5-D为培养第五天的细胞在400倍下的照片。

图6为激光扫描共焦显微镜观察小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDCs)对不同抗原的吞噬情况，其中，图6-A和图6-B为浓度为5μg/mL的FITC-E肽(被FITC标记的E肽)，图6-C和图6-D为浓度50μg/mL的FITC-E肽，图6-E和图6-F为浓度5μg/mL的FITC-E-Q11肽,图6-G和图6-H为浓度为50μg/mL的FITC-E-Q11肽。

图7为流式细胞分析负载抗原的mBMDCs的中位荧光强度(MFI)。

图8为FACS分析CD11C+CD80的表达。

图9为FACS分析CD40的表达。

图10为FACS分析CD40和CD80的平均荧光强度,其中，图10-A为CD40的平均荧光强度，图10-B为CD80的平均荧光强度。

图11为共培养上清Th1/Th2类细胞因子水平。

图12为图章型微针照片。

图13为“dip-coating”浸渍法微针包被原理示意图。

图14为微针包被抗原前后对比照片，A为包被前，B为包被后。

图15为微针刺入小鼠皮肤大体观察照片。

图16为小鼠皮肤经微针或25G注射器针头刺入后亚甲蓝染色。

图17为切片观察包被荧光抗原的微针经皮释放照片。

图18为皮下注射免疫产生的抗体滴度分析图，图18-A为Eppin肽免疫组与PBS对照组小鼠血清IgG抗体，图18-B为Eppin-Q11自组装肽组免疫小鼠血清IgG抗体，图18-C为rhEppin蛋白组免疫小鼠血清IgG抗体，图18-D为Eppin-Q11自组装肽组与Eppin肽组免疫小鼠血清IgG抗体对比。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

部分氨基酸相应的缩写如下：

谷酰胺glnQ；甘氨酸glyG；丝氨酸serS；丙氨酸alaA；苏氨酸thrT；缬氨酸valV；异亮氨酸ileI；亮氨酸leuL；酪氨酸tyrY；苯丙氨酸pheF；组氨酸hisH；脯氨酸proP；天冬氨酸aspD；甲硫氨酸metM；谷氨酸gluE；色氨酸trpW；赖氨酸lysK；半胱氨酸cysC；精氨酸argR。

实施例1人Eppin蛋白的优势表位自组装纳米避孕疫苗的构建及表征

一设备和材料

1设备

TECNAI电镜(荷兰Philip公司)；圆二色光谱仪(日本JASCO公司)；Model550Microplatereader酶标仪(美国BIO-RAD公司)；S.HH.W2型数字显示式恒温水温箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)；精密电子天平(德国Sartorius公司)；Vortex-Genie2涡旋振荡器(美国ScientificIndustries公司)；

2主要实验试剂材料

重组人Eppin蛋白；T10022铜网碳支持膜(北京新兴百瑞技术有限公司)；醋酸双氧铀(美国SPISupplies公司)；完全弗氏佐剂(美国Sigma-aldrich公司)；不完全弗氏佐剂(美国Sigma-aldrich公司)；链霉亲和素预包被的酶联板(芬兰Labsystem公司)；牛血清白蛋白(BSA)(瑞士Roche公司)；HRP标记的山羊抗鼠IgG(北京天根生化科技有限公司)；TMB显色液(北京碧云天公司)；小鼠固定装置(自制)。

实验动物：SPF级纯系雄性C57BL/6小鼠5只，8-10周龄，体重18-20g，购于军事医学科学实验动物中心。

二人Eppin蛋白的优势抗原表位序列的筛选

1人Eppin蛋白氨基酸序列选择

选取来自人睾丸组织的Eppin基因，蛋白质序列来源于(NCBIProtein:AAH53369)，有133个氨基酸残基，如SEQIDNO:4所示，序列如下：

“MGSSGLLSLLVLFVLLANVQGPGLTDWLFPRRCPKIREECEFQERDVCTKDRQCQDNKKCCVFSCGKKCLDLKQDVCEMPKETGPCLAYFLHWWYDKKDNTCSMFVYGGCQGNNNNFQSKANCLNTCKNKRFP”

2人Eppin氨基酸优势抗原表位序列的筛选

筛选的人Eppin蛋白优势抗原表位序列，详见表1。

3基于人Eppin蛋白的优势抗原表位的自组装纳米多肽设计及合成

将筛选的人Eppin蛋白的优势表位序列CSMFVYGGCQGNNNNFQSKANC(Eppin102-123)的C端与具有自组装形成纳米纤维结构的Q11多肽序列(QQKFQFQFEQQ)的N端进行串联连接，两者间以“-SGSG-”进行连接。通过构建自组装体系，由于Q11多肽自组装形成重复排列的β折叠二级结构，连接在其N端的Eppin表位序列将重复表达于自组装纳米纤维表面。设计思路如图1所示。

将设计的Eppin优势抗原表位的自组装纳米多肽送深圳瀚宇药业股份有限公司，采用人工合成肽固相合成技术进行全化学合成，部分与异硫氰酸荧光素(FluoresceinIsothiocyanate,FITC)相连。多肽纯度要求达95％以上。多肽合成序列如表2所示。

表2多肽合成序列

表2中E-Q11指所述融合表位肽，E肽指人Eppin蛋白的优势表位，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。高纯度多肽产品的获得是后续体内、外实验研究的基础。本实验采用人工合成肽固相合成技术合成自组装纳米多肽，多肽分子量通过质谱MS进行测定，通过高效液相色谱RP-HPLC进行纯化。测得多肽分子量分别为：E＝2386.129，Q＝1526.714，E-Q11＝4142.908，质谱测定的分子量与理论预测值完全一致。纯化后的多肽段其纯度分别为：E肽＝95.064％，Q肽＝96.645，EQ肽＝94.59％，如图2所示，可确定采用人工合成肽固相合成技术成功合成了自组装纳米多肽，获得了高纯度的免疫抗原，为进一步研究其免疫应答奠定了基础。

4基于人Eppin蛋白的优势抗原的表位的自组装纳米多肽的构建

分别精密称取3.314mgE-Q11肽，1.909mgQ11肽和1.221mgE肽冻干粉末；将E-Q11肽和Q11肽溶于超纯水中，E肽溶于5％乙酸溶液中；室温下涡旋振荡，使多肽完全溶解；将溶解的多肽置于4℃过夜。

将8mM多肽储存液与PBS混合，混合比例设定为1:3～1:6，涡旋振荡，充分混匀，置于4℃过夜，制备1mM～2mM的自组装多肽工作液。

5基于人Eppin蛋白的优势抗原表位的自组装纳米多肽的鉴定

5.1透射电镜观察

将2mM工作液加入适量PBS稀释至0.25mM，制备0.25mM的TEM样品液。用移液枪吸取6μL的TEM样品液，小心滴入200目铜网碳支持膜表面，静置5min，铜网用滤纸吸干，用1％醋酸双氧铀染色2min，超纯水冲洗3次，室温下干燥5min，透射电镜上样观察照相。

通过透射电镜观察发现E-Q11肽与Q11肽一样能够自组装形成纳米纤维结构，直径范围为2～10nm，长度为200～500nm。而单一Eppin优势抗原表位E肽在透射电镜下未见纳米纤维结构，仅可见无规则的聚集体结构。此外，纳米纤维结构的自组装可以在工作液加入PBS稀释后30min即可观察到，且刚开始纤维直径较小，而随稀释时间延长，纤维直径增加，出现纳米纤维聚集体和交织结构。结果如图3所示。

5.2圆二色光谱分析

将1mM工作液加入1cm石英试池中，用圆二色光谱缓冲液调整工作液浓度至300μM，置于圆二色光谱仪中进行分析。上样参数设定为(波长范围：190～260nm，扫描速度：0.5nm/s，带宽：0.5nm)，每个波谱取3次扫描的平均值。

圆二色光谱分析是研究蛋白质二级结构的主要方法，我们通过圆二色光谱分析E-Q11肽、Q11肽和E肽的二级结构，表明E-Q11肽具有与Q11肽类似的波谱，即在216nm处存在负峰提示存在β折叠结构，而E肽没有在216nm处发现负峰。检测结果如图4所示。

5.3与抗重组人Eppin蛋白抗血清的结合试验进行初步验证

采用链霉亲和素预包被板，分别将E-Q11肽、E肽和Q11肽自组装溶液包被到酶联板上，再用抗血清与不同肽之间的反应，据此初步验证自组装纳米多肽的免疫活性。

将100μL浓度为2mM的自组装多肽工作液按系列浓度梯度分别加入不同的包被96孔板中，4℃过夜；甩干包被板，拍出残留液，100μLPBST洗涤板孔3次，每次5min；加入100μL自制抗血清(1：2000)，37℃孵育60min；甩干、拍出残留板孔中的抗血清，100μLPBST洗涤板孔3次，每次5min；加入100μLHRP标记的山羊抗鼠IgG(1：5000)，37℃孵育30min；甩干、拍出残留板孔中的二抗，100μL的PBS洗涤5次，每次5min；加入100μL的TMB显色液，避光显色10～15min，每孔加50μl2M硫酸终止反应，酶标检测仪OD(405nm)读数记录。

选择上述方法制备的E-Q11肽、Q11肽和E肽自组装体系，根据其与抗人Eppin蛋白免疫血清的结合情况进行初步验证。Q11肽无免疫活性，因此以候选肽的OD值(405nm)3倍于Q11肽作为阳性。所合成的E-Q11肽和E肽均能与免疫血清发生较强的结合反应。

实施例二细胞活性

一小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDCs)的培养

颈椎脱位法处死雌性C57BL/6小鼠1只，75％酒精浸泡10min，无菌状态下用眼科剪和眼科镊取出双侧股骨和胫骨，浸泡在75％酒精中，小心去除骨上组织，将股骨和胫骨浸泡在PBS中，用1mL注射器吸取1640培养液备用，剪去长骨骨骺端，将针头从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复冲洗5遍，直至骨变白，小心吹打，制成骨髓细胞悬液，收集培养皿中的细胞悬液，用1640培养液冲洗培养皿3次，收集冲洗液，低温离心，1500rpm×10min,弃去上清，加入5mL无菌红细胞裂解液，溶解红细胞，涡旋混匀，在室温静置3min，离心1500rpm×10min，弃去上清，加入5mL的1640培养基洗涤，涡旋混匀，离心1500rpm×10min，弃去上清，加入6mL完全培养基，涡旋混匀制成细胞悬液，计数细胞，以1×10⁶/mL的细胞密度分至6孔培养板中，将细胞培养板放入37℃，含5％CO2的孵箱中培养，培养第3天进行半量换液：轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞，补充新鲜的完全培养基，继续培养至第5天，进行全换液或使用磁珠进行分选，用于后续实验。

倒置相差显微镜观察，如图5所示。流式细胞仪检测：收集经细胞因子诱导培养的树突状细胞，经过荧38光抗体染色后，流式细胞仪分析细胞表达CD1lc分子。结果表明：经GM-CSF和IL-4诱导体外培养3d后，DC表达CD1lc为38.4％，而第5天可诱导骨髓细胞分化为DC的比例可达79.2％。

二小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDCs)对抗原的吞噬

收集培养至第5天的经磁珠分选的mBMDCs，根据加入不同抗原刺激分为两个实验组(E-Q11肽组和E肽组)，再根据加入不同抗原浓度分为两个亚组(5μg/mL组和50μg/mL组)，同时设置PBS对照组。

收集培养至第5天的mBMDCs细胞悬液，充分吹打，收集细胞悬液，离心细胞悬液，200g×10min，弃去上清，用400μL的分选缓冲液重悬1×108细胞，加入100μL的小鼠CD11cMicroBeads磁珠(1×108细胞)，涡旋混匀，置于4℃冰箱孵育15min，加入1～2mL/1×107细胞的分选缓冲液，离心200g×10min，弃去上清，加入500μL的分选缓冲液重悬1×10⁸细胞，选择MS分选柱，置入合适的分选架，用500μL的分选缓冲液预湿分选柱，将细胞悬液加入至分选柱内，收集的流出液内含有未结合磁珠的细胞，用适量分选缓冲液冲洗分选柱，冲洗3次，每次500μL，收集未结合磁珠的细胞和废液，将分选柱从分选架上移开，置于适合的收集管上，加入1mL分选缓冲液至分选柱内，收集流出液，分选出结合磁珠的细胞。以1×10⁶/mL，1mL/孔接种于12孔板，分别加入(5μg/mL或50μg/mL)的荧光E-Q11肽或荧光E肽，置于37℃细胞培养箱中共孵育1h，收集各组细胞，PBS彻底清洗3次，用500μLPBS重悬细胞，取200ul细胞悬液滴于玻璃底培养皿中，静置30min后，采用激光共聚焦显微镜进行观察和拍照，取200ul细胞悬液加入流式管中，采用Calibur流式细胞仪进行流式细胞分析。

使用LCSM观察小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDCs)对不同抗原的吞噬。培养至第5天的未成熟mBMDCs，分别加入(5μg/mL或50μg/mL)的FITC-E-Q11肽或FITC-E肽，置于37℃细胞培养箱中共孵育1h，LCSM照片显示：未成熟mBMDCs与不同浓度、不同类型的抗原进行共孵育后，能有效吞噬5μg/mL和50μg/mL的FITC-E-Q11肽，以及50μg/mL的FITC-E肽(明显可见细胞内绿色荧光)，而5μg/mL的FITC-E肽则未见明显的吞噬现象(未见或可见极少量细胞内绿色荧光)。如图6所示。LCSM结果说明通过自组装多肽形式可以促进Eppin表位肽(即所述表位肽)被树突状细胞的吞噬，从而为下一步树突状细胞对Eppin抗原表位的递呈提供条件。

为了评估小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDCs)对不同抗原的吞噬。培养至第5天的未成熟mBMDCs，分别加入(5μg/mL或50μg/mL)的FITC-E-Q11肽或FITC-E肽，置于37℃细胞培养箱中共孵育1h，收集经不同浓度、不同类型的抗原进行共孵育后的未成熟mBMDCs，用流式细胞分析技术FACS对mBMDCs的FITC平均荧光强度和FITC表达阳性细胞数进行分析。FACS结果表明，经5μg/mLEppin-Q11自组装肽和10倍浓度的Eppin肽(50μg/mL)的刺激的mBMDCs，其细胞相关荧光强度相比无显著性差异(p>0.05)，分别为503.5±24.6和641.9±37.7，而5μg/mLEppin肽细胞相关荧光强度仅为61.7±6.6，而相同浓度5μg/mL的Eppin-Q11自组装肽和Eppin肽之间相比存在显著性差异(p<0.05)，50μg/mL的Eppin-Q11自组装肽(MFI为1058.3±60.8)和Eppin肽之间相比也存在显著性差异(p<0.05)。FACS分析FITC表达阳性细胞比例分析结果表明，经5μg/mL和50μg/mLEppin-Q11自组装肽，以及10倍浓度的E肽(50μg/mL)的刺激的mBMDCs，FITC表达阳性细胞比例均超过90％，而5μg/mL的E肽刺激的mBMDCs的FITC表达阳性细胞比例低于10％。图7所示，因此，FACS结果进一步说明通过自组装多肽形式可以促进Eppin表位肽被树突状细胞的吞噬。

三小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDCs)受抗原刺激后的活化

收集培养至第5天的经磁珠分选的mBMDCs，根据加入不同抗原刺激分为两个实验组(E-Q11肽组和E肽组)，再根据加入不同抗原浓度分50μg/mL组)，同时设置LPS阳性对照组和PBS阴性对照组。mBMDCs培养方法同上，收集培养至第5天的mBM收集细胞悬液，离心1500rpm×10min，采用小鼠CD11cMicroBeads磁珠进行细胞分选。将分选获得的细胞中加入完全培养基，重悬后以12孔板中。实验分组：分别加入(5μg/mL或50μg/mL)的E-Q11肽作为阳性对照，设置空白对照组，将细胞培养板放入37℃，含5％CO2的孵箱中培养。

流式细胞分析(FACS)对细胞表面标志进行鉴定。收集1×10⁵mBMDCs，置于流式管中，加入1mL预匀后，低温离心1500rpm×5min，小心倒去上清，留底100μL，流式管中分别加入PE-CD40荧光抗体各1μL，设置同型对照管，混匀，置于4℃避光孵育30min，低温离心1500rpm×5min，小心倒去上清，留底100μL，加入1mL预冷的洗涤温离心1500rpm×5min(洗涤第1次)，小心倒去上清，留底100μL，加入1mL预冷的洗涤，低温离心1500rpm×5min(洗涤第2次)，流式管中加入1％多聚甲醛200μL固定，采用Calibur流式细胞仪进行流式细胞分析。

当未成熟期树突状细胞接受LPS等抗原刺激后成为成熟期树突状细胞，通过流式细胞技术能检测到成熟期树突状细胞表面表达多种共刺激分子，如D40、CD80、CD83和CD86等，在这些共刺激分子中，CD40与初始型辅助性T细胞表面的CD40配体(CD40L)结合后，能促进初始型辅助性T细胞活化成为Th2细胞。CD40-CD40L共刺激途径参与T淋巴细胞依赖的B淋巴细胞应答过程、生发中心的形成、长期记忆性B细胞的产生、抗体的产生及抗体类别转换。

为了研究mBMDCs吞噬E-Q11自组装纳米多肽后是否能导致DC的活化，我们收集培养至第5天的经磁珠分选的mBMDCs，根据加入不同抗原刺激分为两个实验组(E-Q11自组装肽组和E肽组)，再根据加入不同抗原浓度分为两个亚组(5μg/mL组和50μg/mL组)，同时设置LPS阳性对照组和PBS阴性对照组，置于37℃细胞培养箱中共孵育48h，通过流式细胞技术检测mBMDCs表面表达的共刺激分子。FACS结果表明，在LPS阳性对照组，经LPS刺激的mBMDCs细胞表面高表达共刺激分子CD40和CD80，经荧光抗体标记后的阳性细胞比例分别达到83.11％和86.43％；在PBS阴性对照组，mBMDCs细胞表面不表达共刺激分子CD40和CD80，经荧光抗体标记后的阳性细胞比例分别为24.84％和14.52％；在E肽组中，5μg/mL组和50μg/mL组均未检测到高表达的CD40和CD80；而在E-Q11自组装肽组中，5μg/mL的抗原刺激即可使mBMDCs细胞成熟，高表达共刺激分子CD40和CD80，经荧光抗体标记后的阳性细胞比例分别达到76.54％和68.31％，且随E-Q11自组装肽的抗原刺激浓度增加，CD40和CD80表达也增高，如图8，图9和图10所示。FACS结果提示，E-Q11自组装肽能有效刺激未成熟DC活化成熟，而高浓度的E肽虽然能够被DC吞噬，但是不能刺激未成熟DC活化。

四共培养上清中细胞因子的检测

采用CBA法检测DC混合淋巴细胞培养上清液中的细胞因子IL-2,IL-4,IL-5,TNF和IFN-γ的分泌。如图11所示：IL-4的分泌：E-Q11肽组高于rhEppin组和LPS刺激组，差异有显著性(p<0.05)；IL-5的分泌：rhEppin组较E-Q11肽组和LPS刺激组稍有降低，但差异无显著性(P>0.05)；IFN-γ的分泌：E-Q11肽组低于rhEppin组和LPS刺激组，差异有显著性(p<0.05)。

实施例三微针的制备

一微针包被抗原

图章型微针为一种可手持的I级医疗器械，主要用于液态药物的经皮给药，能够通过其表面的微米级针尖阵列在皮肤表面产生临时的微孔通道，从而暂时破坏皮肤角质层的屏障作用，使药物进入皮肤深层。本实施例采用的微针为500μm和1000μm两种规格，表面以6×6阵列，针尖间距500μm，均匀排列36个微针针尖，详见图12。

采用微针包被抗原的方法进行经皮免疫。首先，根据图章型微针的阵列分布及微针尺寸制备了精密微针浸渍包被装置。采用激光蚀刻钻孔工艺，在厚度为1mm聚四氟乙烯板表面制备与微针阵列相匹配的微孔，微孔尺寸为直径200μm，深度为400μm，每个微孔作为每个微针浸渍包被时的单独容器。进行微针浸渍包被时，将包被板水平置于无菌操作台，每个微孔内加入8μL包被液(液面高度约为微孔深度的3/4)，再将微针垂直置入匹配的微孔，保持5min后，垂直取出，室温下静置10min使包被液晾干。通过调整包被液中抗原的浓度以及包被次数，可控制每个微针包被抗原的剂量。微针包被原理如图13所示,包被前后的对比图如图14所示。

将实施例1各组工作液浓度的疫苗抗原(Eppin肽、Eppin-Q11自组装肽和rhEppin蛋白)，以不同体积比溶于微针包被液中，调整抗原包被液浓度。涡旋1min充分混匀，制备抗原包被液，于4℃保存。微针包被方法同3.1，为了检测每个微针包被抗原的剂量，将包被抗原的微针置于PBS中，液面超过微针基底部，4℃过夜。采用BCA微量蛋白定量分析的方法对微针包被抗原的剂量进行检测，并绘制标准曲线。

通过微针刺入皮肤破坏角质层的屏障机制，在皮肤表面产生微米级孔道，可以使药物经皮肤进入体内。而经皮微针免疫的作用原理是借助微针促进药物渗透，使药物主动靶向皮肤的免疫细胞，产生免疫反应。微针是否能有效刺入皮肤是经皮微针免疫的基础。我们通过使用500-μm和1000-μm两种型号的图章型微针，与常规注射器刺入小鼠皮肤后，亚甲蓝染色后对皮肤表面微孔的直径、深度以及皮下组织损伤进行对比观察。结果表明，500-μm和1000-μm微针均能在皮肤表面造成微米级孔道，其直径分别为26±4μm和111±18μm，而25G注射器针头造成的皮肤孔道直径为364±36μm。500-μm微针的真皮层表面可见淡染的亚甲蓝染色，而1000-μm微针和25G注射器针头的真皮层表面亚甲蓝染色更深，如图15和图图16所示。

二微针包被抗原的体外释放

采用前述抗原包被方法，对微针进行荧光抗原包被，荧光抗原采用商品化的647卵原蛋白。采用前述微针刺入方法，将荧光微针刺入小鼠皮肤，分别保持10s、30s和60s，取出微针，避光保存，体视显微镜下观察并摄片。迅速采用脱颈椎法处死小鼠，取皮肤，修剪成0.5cm×0.5cm大小，用OCT包埋剂进行包埋，液氮冷冻后，在冰冻切片机上制成6μm冰冻切片，荧光显微镜下观察并摄片。采用ImageJ软件分析图像的平均荧光强度，使用微针残留荧光比例表示微针经皮释放比例。微针包被抗原是微针经皮免疫的常用方法。

将工作液浓度的Eppin肽、Eppin-Q11自组装肽和rhEppin蛋白，以不同体积比溶于微针包被液中，制备300μg/mL的抗原包被液。采用微量浸渍法进行微针包被，肉眼观包被液均匀附着于各个针尖表面，每次包被均有10％的针尖出现包被液扩散至微针基座表面的现象。采用BCA微量蛋白定量分析的方法对微针包被Eppin肽、Eppin-Q11自组装肽和rhEppin蛋白的剂量进行检测。结果显示，通过1次浸渍法包被，每个装配36个长度为500μm针尖的微针包被疫苗的剂量分别为Eppin肽(11.34±2.09μg)，Eppin-Q11自组装肽(10.71±1.65μg)和rhEppin蛋白(11.17±1.53μg)。

为了检测包被抗原的微针能否将抗原有效地释放至皮肤中，我们通过体视显微镜对包被荧光抗原的微针以及微针刺入皮肤进行观察，同时制作冰冻切片在荧光显微镜下观察荧光抗原的经皮微针皮肤释放。结果显示，包被荧光抗原的微针刺入小鼠皮肤后能有效释放抗原，针尖部分的抗原释放效率较针尖底部更高。将微针刺入小鼠皮肤并保持60s后，微针表面残留荧光比例为22.1％，如图3-6所示，说明微针能迅速将绝大多数抗原释放至皮肤。冰冻切片后荧光显微镜观察结果显示，微针刺入小鼠皮肤后，荧光抗原保留在微针造成的皮肤孔道中，孔道从表皮层延伸至真皮层上方，500-μm和1000-μm微针造成的孔道深度分别为441±32μm和763±94μm，如图17所示。

实施例四动物实验

一试验方法

动物分组：

选取C57BL/6雄性小鼠100只，体重18～20g/只，8～10周龄，适应性喂养1周后，随机编号(耳钉)后分为10组，每组10只。小鼠免疫的分组按照以下三个要素：抗原(Eppin肽、Eppin-Q11自组装肽和rhEppin蛋白)，免疫剂量(10μg和80μg)，免疫途径(经皮微针(Microneedleimmunized,MN)和皮下注射(Subcutaneousimmunized,SC))，以及阴性对照组PBS共10组，具体分组如下表3。

表3小鼠免疫分组

经皮微针免疫方法：取24小时前脱毛小鼠(脱毛方法同前)，采尾静脉血保存，60mg/kg的戊巴比妥钠经腹腔麻醉，小鼠取俯卧位放置于水平操作台上，酒精消毒皮肤脱毛处，待皮肤干燥后，助手用两根棉签将皮肤固定于躯体一侧，操作者手持已包被抗原的微针(包被方法同前)垂直于皮肤迅速、用力刺入，保持刺入状态5min后，取出微针，将小鼠放回鼠笼饲养。经皮微针加强免疫方法同初次免疫，免疫抗原均未加弗氏佐剂。皮下注射免疫方法为：取免疫原100μl(含10μg或80μg的Eppin肽或Eppin-Q11自组装肽或rhEppin蛋白)与等体积的弗氏完全佐剂(初次免疫)或弗氏不完全佐剂(加强免疫)混合，充分乳化，足垫皮下注射免疫小鼠，每周一次，共四次。

从初次免疫(包括免疫前血清)开始，在0周、2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、16周、20周、24周、28周、32周和36周，分别取小鼠尾静脉血约20μl，室温静置2h，待血清析出后加入180μl抗体稀释液(含0.1％BSA的PBST稀释液)，1500rpm离心5min，吸出上清液采用ELISA法检测IgG抗体滴度。

ELISA步骤如下：(1)包被：将rhEppin蛋白或肽抗原用0.05M碳酸盐包被缓冲液稀释至浓度为5μg/m1，取96孔酶标板，每孔加入100μl抗原包被液，4℃孵育12h；(2)洗涤：取经过4℃孵育12h的酶标板，倒空抗原包被液，拍干，用PBST洗涤，缓冲液洗涤5min×3次；(3)封闭：每孔加100μl含5％BSA的封闭液，置37℃恒温水浴箱中封闭1h；(4)洗涤：倒空封闭液，拍干，PBST洗涤5min×4次；(5)加待检血清：用抗体稀释液(含0.1％BSA的PBST稀释液)倍比稀释血清，每孔加入100μl，37℃孵育lh；(6)洗涤：倒空抗体稀释液，PBST洗涤缓冲液洗涤5min×3次；(7)加二抗：每孔加入l:5000稀释的HRP标记山羊抗鼠IgG100μl，置37℃孵育45min；(8)洗涤：倒空二抗稀释液，PBST洗涤缓冲液洗涤5min×4次；(9)显色：每孔加入TMB底物液100μl，室温下避光显色15min；(10)终止：每孔加50μl2M硫酸终止反应。(11)检测：用酶标仪测光密度(405nm)，大于本底2.1倍则为阳性，以最大稀释倍数作为效价，同时设正常小鼠血清作为阴性对照。

ELISA法检测抗体亚型的方法：取Eppin-Q11肽和rhEppin蛋白组小鼠末次免疫后2周的血清，大致按照上述ELISA法检测抗体滴度的方法进行，不同之处：第4步抗血清稀释倍数为1:10000；第6步二抗分别为HRP标记山羊抗鼠IgG1和IgG2a。

ELISPOT检测脾脏淋巴细胞：各组小鼠末次免疫后2周，每组分别处死小鼠3只，取脾细胞(参照第二部分的小鼠脾脏淋巴细胞的分离方法)，以2×106/mL的细胞密度，将100μL细胞悬液加入至预包被纯化的小鼠IL-4和INF-γ捕获抗体的96孔ELISPOT板中。采用各组免疫抗原进行重复刺激，刺激抗原浓度均为15μg/mL，同时设置未刺激对照孔，混匀后置于37℃,5％CO₂细胞培养箱中共孵育24h；用洗涤缓冲液洗孔7次，每孔加入100μL生物素化小鼠IL-4或INF-γ单抗，37℃孵育1.5h；用洗涤缓冲液洗孔3次，每孔加入100μL链霉亲和素HRP，37℃孵育1h；用洗涤缓冲液洗孔3次，每孔加入100μLAEC底物液，室温下反应10-15min；完全显色后，用去离子水洗孔3次，室温下晾干；4℃过夜后采用BiosysBioreader4000PRO酶联免疫斑点图像自动分析仪计数斑点。检测免疫后小鼠淋巴细胞中分泌IL-4和INF-γ的数量，进而分析免疫后小鼠T细胞极化方向。

小鼠合笼实验：

生育力抑制情况观察：C57BL/6雄鼠分别于免疫第6周和第8周进行两次合笼，与8-10周龄C57BL/6雌鼠以1∶3比例合笼喂养。每日定时观察雌鼠有无阴道栓形成，待发现雌鼠有阴道栓后立即分笼喂养。继续观察分笼喂养雌鼠3-4周，统计各组雌鼠受孕数量和受孕次数每窝产仔数量，雄鼠的生育率以雌鼠妊娠百分率来表示。

生育力回复情况观察：C57BL/6雄鼠于免疫后各时间点监测血清中IgG抗体滴度，在抗体滴度开始下降逐渐趋于稳定时，与C57BL/6雌鼠再次合笼，合笼实验方法同前。观察雌鼠受孕情况，了解雄鼠生育力在抗体滴度下降后是否能够恢复。

精子活力及畸形率的观察：用1％台盼蓝染色判断死精子及活精子。在倒置显微镜下计数不活动精子数目，再计数精子的总数。精子活力＝活精子数/总精子数×100％；精子畸形率＝畸形精子数/总精子数×100％。

精子膜功能完整性测定(低渗肿胀试验)：取1ml低渗膨胀液于一只加盖的试管中，37℃温热5min；加入0.1ml精子悬液，并用吸管轻轻搅匀；在37℃条件下保持30min(不超过120min)，用相差显微镜观察精子细胞；精尾部发生肿胀变化的定为精子膨胀，将所计数的总共200个精子中的膨胀精子数，重复计数2遍，并计算平均百分率；如果精液标本有60％以上的精子出现尾部肿胀，则认为HOS试验正常。如果尾部肿胀的精子数低于50％，该精液标本则认为是异常的。

二结果

各免疫组小鼠抗体滴度变化及抗体亚型分析(结果分析图详见图18)：

除采用Eppin肽免疫的实验组(E80-SC，E10-SC，E10-MN)和低剂量rhEppin蛋白免疫(r10-SC)外，其余各组抗体滴度在初免后2周开始逐渐上升，于免疫结束后2周-4周达到高峰。采用Eppin肽免疫的实验组(E80-SC，E10-SC，E10-MN)小鼠产生抗体滴度略高于PBS组，但差异无统计学意义(P>0.05)。采用Eppin-Q11自组装肽免疫的实验组(EQ80-SC，EQ10-SC，EQ10-MN)，小鼠血清抗体滴度于第8周达到高峰，其峰值分别达到1:105(EQ80-SC)、1:104(EQ10-SC)和1:105(EQ10-MN)，免疫第16周开始下降，至第36周抗体水平与PBS组相比无显著差异(P>0.05)。采用rhEppin蛋白免疫的实验组(r80-SC和r10-MN)，小鼠血清抗体滴度于第6周达到高峰，其峰值分别达到1:106(r80-SC)和1:105(r10-MN)，免疫第28周开始下降，至第36周抗体水平与PBS组相比无显著差异(P>0.05)。

抗原组之间比较：在均采用皮下注射免疫途径时，80μg和10μgE-Q11自组装肽以及80μgrhEppin蛋白组，抗体滴度明显高于E肽组(P<0.05)，10μgrhEppin蛋白组的抗体滴度与Eppin肽组之间无显著差异(P>0.05)，两种剂量的E-Q11自组装肽组的抗体滴度均低于80μgrhEppin蛋白组(P<0.05)，但是均高于10μgrhEppin蛋白组(P<0.05)。相同抗原剂量下，E-Q11自组装肽组小鼠抗体滴度均高于Eppin肽组(P<0.05)，且低剂量(10μg)E-Q11自组装肽组小鼠抗体滴度仍然高于高剂量(80μg)Eppin肽组(P<0.05)。结果表明，E-Q11自组装肽的疫苗形式能产生抗体滴度介于rhEppin重组蛋白免疫和Eppin肽免疫之间，低剂量的E-Q11自组装肽疫苗即可产生高滴度的抗体反应。

免疫方式之间比较：在rhEppin蛋白组中，高剂量80μgrhEppin蛋白皮下注射免疫后产生了高滴度抗体，低剂量(10μg)rhEppin蛋白皮下注射免疫产生的抗体反应与PBS组比较无显著差异(P>0.05)。而通过采用经皮微针免疫方式，低剂量(10μg)rhEppin蛋白免疫小鼠血清中的抗体水平明显高于低剂量皮下免疫组(P<0.05)，且与高剂量皮下免疫组相比无显著差异(P>0.05)。在Eppin-Q11自组装肽组中，EQ80-SC，EQ10-SC和EQ10-MN组均产生了高滴度抗体，低剂量(10μg)Eppin-Q11自组装肽经皮微针免疫产生的抗体反应与高剂量皮下注射免疫比较，无统计学差异(P>0.05)，但低剂量经皮微针免疫组高于低剂量皮下注射免疫组(P<0.05)。结果表明，rhEppin蛋白和Eppin-Q11自组装肽均能以较低的抗原剂量，通过采用经皮微针免疫方式产生高效抗体反应，达到节省抗原用量的目的。

小鼠血清抗体亚型分析：本实验取EQ80-SC组、EQ10-MN、r80-SC组和r10-MN组小鼠免疫第6周和第8周的血清，抗血清稀释倍数为1:10000，分别检测各组小鼠的IgG1和IgG2a水平，以及分析IgG1/IgG2a比例。r80-SC组小鼠产生了高水平的IgG1和IgG2a抗体亚型，r80-SC组小鼠IgG2a高于EQ80-SC组、EQ10-MN、和r10-MN组，差异有统计学意义(P<0.05)。EQ80-SC组、EQ10-MN、和r10-MN组小鼠的IgG抗体亚型主要是IgG1，EQ80-SC<r10-MN<EQ10-MN。在小鼠中，以IgG1为主的抗体亚型主要由Th2型细胞因子诱导，而以IgG2a为主的抗体亚型主要由Th1型细胞因子诱导，因此常用IgG1/IgG2a比例来分析Th1/Th2免疫反应。EQ80-SC组、EQ10-MN、r80-SC组和r10-MN组小鼠血清的IgG1/IgG2a比例分别为：4.335±0.983，14.634±2.010，2.2607±0.335，7.67±2.016。结果表明，经皮微针Eppin-Q11自组装肽的疫苗形式更偏向于产生Th2免疫反应。

T细胞极化分析：ELISPOT结果显示，EQ10-MN组小鼠IL-4分泌细胞最多，略高于r10-MN组、EQ80-SC组和r80-SC组，但差异无统计学意义(P>0.05)，r10-SC组明显低于其余各组(p<0.05)，与PBS组比较无统计学意义(P>0.05)。使用EQ免疫的各实验组均产生了较高水平的Th2(IL-4)淋巴细胞，相同剂量(10μg)之间比较，经皮微针免疫(EQ10-MN组)明显高于皮下注射免疫(EQ10-SC组)。r80-SC组小鼠IFNγ分泌细胞最多，且明显高于其余各组(p<0.05)。采用经皮微针免疫的EQ10-MN组和r10-MN组，均产生了高水平的Th2(IL-4)淋巴细胞和低水平的Th1(IFNγ)淋巴细胞。采用皮下注射免疫时，EQ自组装肽免疫小鼠的Th1(IFNγ)淋巴细胞明显低于Eppin重组蛋白免疫组。结果表明，采用EQ自组装肽免疫和经皮微针免疫途径能增强Th2型免疫反应，且能抑制Th1型免疫反应。

小鼠合笼实验之生育抑制观察：采用EQ自组装肽免疫的各组小鼠的受孕率较PBS对照组明显下降(p<0.05)，其中EQ经皮微针免疫组受孕率为20％，略高于(80μg)高剂量重组Eppin蛋白皮下注射免疫组，但差异无统计学意义(P>0.05)。采用Eppin肽免疫的各组小鼠受孕率均未下降，与PBS组比较无显著差异(P>0.05)。采用重组Eppin蛋白免疫的各组小鼠中，低剂量经皮微针免疫组与高剂量皮下注射免疫组比较无明显差异(P>0.05)，而低剂量皮下注射免疫组受孕率无明显下降。

生育力回复观察：雄鼠于免疫后监测血清抗体滴度，EQ自组装肽组和重组Eppin蛋白组小鼠分别在免疫20周和免疫32周抗体滴度开始逐渐下降，各组小鼠于免疫36周再次合笼，观察受孕情况。各组雌鼠生育能力基本恢复正常，与PBS对照组相比无显著差异。

小鼠附睾精子计数及活力分析，详见表4。

表4各组小鼠附睾精子数及活力分析

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.避孕微针的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A附睾蛋白酶抑制蛋白的表位肽的合成

将筛选的人Eppin蛋白的优势抗原表位的序列和具有自组装形成纳米纤维结构的多肽的序列串联，得融合表位肽；

B自组装系统的构建

将步骤A所得的融合表位肽充分溶解于超纯水中，并与PBS混合，得自组装系统工作液；

C微针的包被

将微针浸泡至自组装系统工作液中至抗原充分包被所述微针，得避孕微针。

2.根据权利要求1所述的避孕微针的制备方法，其特征在于：所述人Eppin蛋白的优势抗原表位序列如SEQIDNO:1所示，通过人工合成肽技术固相合成。

3.根据权利要求2所述的避孕微针的制备方法，其特征在于：所述自组装形成纳米纤维结构的多肽的序列如SEQIDNO:2所示，通过人工合成肽技术固相合成。

4.根据权利要求3所述的避孕微针的制备方法，其特征在于：所述人Eppin蛋白的优势抗原表位的序列和所述自组装形成纳米纤维结构的多肽的序列组成的所述表位肽的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。

5.根据权利要求4所述的避孕微针的制备方法，其特征在于：步骤B中，所述融合表位肽与所述PBS的体积比为1：3～6，所述多肽的浓度为8mM。

6.根据权利要求5所述的避孕微针的制备方法，其特征在于：步骤C中，所述微针为SkinStamp图章型微针。

7.根据权利要求6所述的避孕微针的制备方法，其特征在于：步骤C中，将自组装系统工作液置于与所述微针匹配的微针池中，每个微针池内加入8μL自组装系统工作液，液面高度为微针池深度的3/4，再将所述SkinStamp图章型微针垂直置入匹配的微孔，保持不少于5min后，垂直取出，室温下静置使包被液晾干。

8.根据权利要求6所述的避孕微针的制备方法，其特征在于：步骤C中，所述微针池的制备采用激光蚀刻钻孔工艺，在厚度为1mm聚四氟乙烯板表面制备与微针阵列相匹配的微针池，微针池的直径200μm，深度为400μm，每个微针池作为每个微针浸渍包被时的单独容器。

9.权利要求1-8任一项所述的制备方法所得的避孕微针。