CN103563996B - 枯草芽孢杆菌g1在促进植物生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌G1在促进植物生长中的应用；所述枯草芽孢杆菌G1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2013年9月9日，保藏编号为CGMCC No.8138。所述枯草芽孢杆菌G1能够产生亚精胺，促进植物、优选水稻和/或烟草的生长；还能够产生脂肽类化合物表面活性素，从而抑制病原菌的生长；因此，施用枯草芽孢杆菌G1能够同时达到促生和生防双重效果，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌G1在促进植物生长中的应用。
背景技术
人们长期依赖化学肥料来促进植物生长、提高产量的同时也带来了一些问题。如：（1）引起水中氮、磷含量的增加，使河川、湖泊、内海富营养化，导致藻类过度繁殖，水质恶化，鱼类及其他水生生物大量死亡；（2）长期过量而单纯施用化学肥料，会使土壤酸化。土壤溶液中和土壤微团上有机、无机复合体的铵离子量增加，土壤结构破坏，土壤板结，并直接影响农业生产成本和作物的产量；（3）使食品、饲料和饮用水中有毒成分增加，使用化肥地区的井水及河水中氮化合物含量增加，甚至超过饮用水标准；（4）土壤微生物区系遭到破坏。过量施用化肥，尤其是氮肥对微生物具有杀伤作用和抑制作用，长期施用，大量的微生物死亡，土壤微生物区系发生变化，许多有益微生物从优势种群变为次要种群，作物易发生各类病害。
植物根围促生细菌（PGPR）在植物根部具有很强的定殖能力，对根部识别的病原物具有抑制作用，可被用于防治真菌、细菌和病毒病害，同时PGPR能够促进植物的生长，表现在可以显著提高种子萌发率、促进根系生长和增加植物重量和产量。自从1978年Burr等人首先在马铃薯上报导PGPR以来，已从大麦、水稻、油菜、大豆、拟南芥等植物的根圈分离得到了大量的PGPR菌株，并且已被广泛的应用于促进植物的生长中。其中芽孢杆菌因其具有很强的环境适应性和环境友好性，而且具有生长速度快、营养要求简单、在植物表面易于存活、定殖与繁殖、生产芽孢杆菌制剂的工艺简单、制剂简单、施用方便、储存期长等优点，因此是一种理想的生物肥料。
目前，芽孢杆菌的促生机制主要包括：1、提高植物根际养分的可利用性，如促进难溶性磷、铁和微量元素的释放；2、产生植物激素吲哚-3-乙酸（IAA）、细胞分裂素（cytokinin）和赤霉素（Gibberellins，GAs），以及产生ACC脱氨酶（1-氨基环丙烷-1-羧酸酯脱氨酶）降低植物体内的乙烯水平；3、产生挥发性化合物（volatiles）。此外，还可以通过间接促生作用，即在病原物存在时，通过提高植物的抗病性，减轻发病情况来间接地促进植物生长。
发明内容
本发明的目的在于提出一种枯草芽孢杆菌G1在促进植物生长中的应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种枯草芽孢杆菌G1在促进植物生长中的应用；所述枯草芽孢杆菌G1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2013年9月9日，保藏编号为CGMCC No.8138。
所述枯草芽孢杆菌G1为革兰氏阳性菌，杆状，无荚膜，好氧，周生鞭毛，能运动。菌落表面粗糙不透明，微黄色。生理生化特性：接触酶、氧化酶阳性,V-P反应呈阳性，水解淀粉、酪素，不产生吲哚。以16s rDNA序列在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行比对，与Bacillus subtilis168相似度为100%。
优选地，所述植物为烟草和/或水稻。
发明人经研究发现，所述枯草芽孢杆菌G1对烟草和水稻根部有很好的促生作用，促生率分别为55.9%和21.4%。施用于田间水稻时，枯草芽孢杆菌G1能明显促进水稻地上部和地下部干重，与对照比分别提高了37.8%和38.3%。
所述枯草芽孢杆菌G1除了能够促进植物、优选烟草和/或水稻生长外，还能够产生脂肽类化合物——表面活性素（surfactin），抑制病原菌的生长；因此，施用枯草芽孢杆菌G1能够同时达到促生和生防双重效果，具有高效、安全、施用方便、储存期长等优点。
为探讨所述枯草芽孢杆菌G1的促生机制，发明人通过转座子随机诱变技术，构建了枯草芽孢杆菌突变体文库，并从中筛选促生缺陷型突变体，克隆和研究促生相关基因，并通过高效液相色谱鉴定促生物质；结果发现，枯草芽孢杆菌G1可以产生促生物质——亚精胺，亚精胺在低浓度（1μM）时就能促进植物生长。
保藏信息
保藏日期：2013年9月9日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101；
保藏编号：CGMCC No.8138。
附图说明
图1显示枯草芽孢杆菌G1及其突变体对烟草根部的促生作用；1代表枯草芽孢杆菌G1，2代表枯草芽孢杆菌G1的突变体△yecA::TnYLB-1，3代表枯草芽孢杆菌G1的突变体△speB::cat，4代表对照。
图2显示枯草芽孢杆菌G1及其突变体对水稻根部的促生作用；1代表枯草芽孢杆菌G1，2代表枯草芽孢杆菌G1的突变体△yecA::TnYLB-1，3代表枯草芽孢杆菌G1的突变体△speB::cat，4代表对照。
图3为枯草芽孢杆菌体内多胺合成途径。
图4为枯草芽孢杆菌G1及其突变体发酵上清液的高效液相色谱检测。
图5枯草芽孢杆菌G1和亚精胺对烟草（A）和水稻（B）根部的促生作用。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，由技术常识可知，本发明也可通过其它的不脱离本发明技术特征的方案来描述，因此所有在本发明范围内或等同本发明范围内的改变均被本发明所包含。
实施例1枯草芽孢杆菌G1对三生烟根部的促生作用
用牙签挑取枯草芽孢杆菌G1单菌落，接种到LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12h；转接至Landy培养基中，30℃、200rpm振荡培养发酵38h；4℃、10000rpm离心10min收集上清；取200μl发酵上清液对烟草种做浸种处理12h，再用5%次氯酸钠消毒5min后用灭菌水清洗干净，并将种子置于MS培养基上，之后置于光照强度2500lx、温度25℃、光暗比16h：8h的光照培养箱中静置培养。20天后测定烟草根长，并采用SPSS统计软件进行方差分析统计。
结果如图1所示，图1结果表明：枯草芽孢杆菌G1能够明显促进烟草根的生长，促生效果达到55.9%。
实施例2枯草芽孢杆菌G1对水稻的促生作用
用牙签挑取枯草芽孢杆菌G1单菌落，接种到LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12h；取20ml菌液对水稻种做浸种处理2h；浸种处理后，用3%NaClO处理水稻种子20min，灭菌水冲洗种子表面3～5次；将种子平铺于干净的滤纸上面，轻轻吸去种子表面多余的水分，但是不要吸的过干，然后重新用干净的滤纸卷裹水稻种子，每张滤纸卷裹10粒种子，且每粒种子间保持一定的距离，卷裹后用灭菌的丝带轻轻系好，最后插入清水中生长，之后置于光照强度2500lx、温度28℃、光暗比16h：8h的光照培养箱中静置培养。10天后测定水稻根长，并采用SPSS统计软件进行方差分析统计。
结果如图2所示，图2结果表明：枯草芽孢杆菌G1能够明显促进水稻根部的生长，促生率为21.4%。
实施例3枯草芽孢杆菌G1促生相关基因鉴定
用化学方法制备枯草芽孢杆菌G1的感受态细胞，用1μg的pMarA质粒转化100μl的感受态细胞，获得转化子G1-pMarA。将枯草芽孢杆菌G1-pMarA接种到含有10μg/μl红霉素的LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜；将过夜培养的菌液稀释105-106倍，取200μl涂布于含有5μg/μl卡那霉素的LB平板上，在50℃条件下过夜培养12h后，随机挑选突变体单菌落，构建枯草芽孢杆菌G1的突变体文库。
从枯草芽孢杆菌G1的突变体文库中成功筛选出1株促生活性丧失的突变体，该突变体对烟草和水稻根的生长没有促生效果（见图1、2）。提取枯草芽孢杆菌突变体的基因组，并用选择限制性内切酶Taq Ⅰ进行完全酶切、纯化，利用T4连接酶将酶切片段进行DNA分子自行环化，以此环化DNA作为反向PCR的模板进行PCR扩增，对扩增得到的片段测序，利用数据库SubtiList和NCBI进行BLAST，比对结果表明突变体中转座子插入的位点是yecA基因，该基因编码氨基酸/多胺透性酶。并且有研究表明多胺被认为是生长调节子，与植物的生长发育有密切关系。我们推测G1菌株的促生活性可能与多胺有关。
实施例4枯草芽孢杆菌G1促生物质鉴定
为了进一步证明G1菌株的促生活性确实与多胺有关，我们采用同源双交换的方法定点突变了枯草芽孢杆菌多胺合成途径中的上游基因speB。speB基因被破坏后，芽孢杆菌体内所有多胺类物质（如腐胺、亚精胺）均不能产生（枯草芽孢杆菌体内多胺合成途径见图3）。用该定点突变体发酵上清液处理烟草种，发现不能促进烟草和水稻根的生长（见图1、2）。
随后我们对野生型G1、随机突变体G1△yecA::TnYLB-1、定点突变体G1△speB::cat的发酵上清液进行衍生反应，再通过高效液相色谱比较它们的差异峰，并对其进行鉴定。具体步骤如下：取10ml发酵上清液，加入预冷的高氯酸至终浓度为5%(v/v)，4℃、10000rpm离心30min；取10ml上清液，加入20ml2M的NaOH和140μl苯甲酰氯涡旋20s后，37℃孵育30min；加入20ml饱和NaCl溶液和30ml乙醚混匀萃取，10000g离心5min；取乙醚相，通风厨中吹干；加入200μl甲醇，并过0.45μm滤器。色谱柱：Agilent C18柱。流动相：甲醇：水（60：40，v/v），检测波长为230nm，流速为0.7ml/min，柱温30℃。高效液相色谱结果表明野生型G1的发酵上清液中存在亚精胺，而随机突变体和定点突变体的发酵上清液中检测不到亚精胺的存在（见图4）。
实施例5体外添加亚精胺对烟草和水稻根部的促生作用
分别用1μM亚精胺（spd）、枯草芽孢杆菌G1（G1）、培养基（对照）浸种处理烟草种12h和水稻种2h；对烟草和水稻种进行表面消毒后，分别置于MS培养基和清水中生长（方法同实施例1和实施例2）。结果见图5。
图5结果显示，1μM亚精胺和枯草芽孢杆菌G1均能够明显促进烟草和水稻根部的生长。
实施例6枯草芽孢杆菌G1在田间水稻的促生的应用
将枯草芽孢杆菌G1用牙签挑取单菌落，接种到LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养12h；转接至Landy培养基中，30℃，200rpm振荡培养发酵38h；每亩拌种100ml菌液（109CFU/ml）；采用五点取样法，随机取五点，每点取三穴，每穴取一株；分别调查水稻株高、根长、地上部干重、地下部干重和分蘖数。
结果如表1所示。
表1、枯草芽孢杆菌G1对田间水稻的促生作用
表1中的数据，如果标注字母相同（如同为a或同为b），则表示二者之间没有显著性差异；如果标注字母不同（如一个是a，一个是b），则表示二者之间有显著性差异。
表1结果表明，枯草芽孢杆菌G1拌种能明显促进水稻地上部和地下部干重，与对照相比分别提高了37.8%和38.3%，差异显著。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明，但本发明并不局限于上述，即不意味着本发明必须依赖上述才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (1)
1.一种枯草芽孢杆菌G1在促进植物生长中的应用；所述枯草芽孢杆菌G1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2013年9月9日，保藏编号为CGMCC No.8138；所述植物为烟草和/或水稻；所述枯草芽孢杆菌G1对烟草和/或水稻根部具有促生作用。
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