CN103554255A - 抗栉孔扇贝c-型凝集素重组蛋白单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体，其是由名称为：杂交瘤细胞CfL290-1A2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C201391，保藏日期为：2013年06月17日的杂交瘤细胞分泌的。其制备方法如下：首先，通过重组表达栉孔扇贝C-型凝集素成熟肽段蛋白，经纯化后作为抗原免疫Balb/c小鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞；再通过免疫学检测筛选方法，筛选出分泌所述抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞CfL290-1A2，收集杂交瘤细胞培养上清，经纯化后得到抗栉孔扇贝C-型凝集素蛋白单克隆抗体。本发明单抗能与栉孔扇贝C-型凝集素发生特异性结合，可用于凝集素体外检测。

Description

抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗栉孔扇贝（Chlamys farreri）C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体及其制备方法，属于扇贝分子免疫学技术领域。 

背景技术

C-型凝集素是广泛存在于细胞表面和体液中的一类糖结合蛋白，是典型的模式识别受体之一，其特点是具有大约130个氨基酸序列的钙依赖型的糖类识别区域，该区域能够与脂多糖、肽聚糖、甘露聚糖等病原或细胞膜表面的病原相关分子模式结合，从而启动免疫应答信号通路并调控多种免疫相关细胞因子的表达、介导抗原递呈作用并激活T细胞免疫、激活补体途径、介导细胞粘附及吞噬作用等多种免疫应答反应。贝类缺乏获得性免疫系统，仅具有固有免疫系统，C-型凝集素是贝类免疫防御过程中重要的因子，通常分布于贝类血淋巴、粘液、受精卵、肌肉和消化腺中。游离状态的C-型凝集素，能够与体液中病原体发生结合，可使病原体聚集，发生趋化作用或凝集作用，促使细胞发生吞噬或包囊作用。另外，C-型凝集素还能够激活酚氧化酶原，促进呼吸爆发等多种免疫防御反应。目前在贝类中已报道存在多种C-型凝集素，但主要是基因水平克隆凝集素的基因序列、研究病原感染后基因的表达情况，在蛋白和细胞水平对凝集素的检测还较少。检测C-型凝集素的分布、凝集活性及病原感染后的变化等，了解C-型凝集素介导的免疫应答反应，也成为近期贝类C-型凝集素研究的热点问题。利用抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体一方面可以对栉孔扇贝体内C-型凝集素进行组织定位，检测其在栉孔扇贝不同组织器官内的凝集活性、以及病原感染后凝集素含量的变化等，为扇贝C-型凝集素的进一步研究提供方法手段和技术支持。 

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体，该抗体能与C-型凝集素特异性结合。 

本发明的另一个目的在于提供上述抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体的制备方法。 

本发明的又一个目的在于提供一种抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体在C-型凝集素检测中的应用。 

本发明的目的是由以下技术方案实现的：研制了一种抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞CfL290-1A2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏号为：CCTCC NO：C201391，保藏日期为：2013年06月17日的杂交瘤细胞分泌的。 

本发明所述的抗栉孔扇贝凝集素重组蛋白单克隆抗体，能与栉孔扇贝C-型凝集素发生特异性结合。 

在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞分裂旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限分裂增生能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由橘红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体。 

一种所述抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：首先，根据引物设计原则及克隆获得的GenBank（DQ209290）中公布的栉孔扇贝C-型凝集素全长cDNA序列，设计含特定酶切位点的C-型凝集素成熟肽段的特异性扩增引物，以从栉孔扇贝整体组织中抽提的总RNA经反转录合成的cDNA链作为模板，经常规PCR扩增获得栉孔扇贝C-型凝集素成熟肽段编码基因；将目的基因经双酶切后插入pET32a质粒，构建表达融合蛋白的载体pET32a-lec290；转化入大肠杆菌，PCR和测序验证无误后，将筛选到的阳性克隆菌放入含氨苄青霉素的培养基进行培养，经IPTG诱导表达后，表达的融合蛋白经亲和层析法纯化；以该纯化的融合蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合技术制备杂交瘤细胞，经过免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗栉孔扇贝C-型凝集素Lec290成熟肽段单克隆抗体的杂交瘤细胞CfLec290-1A2，然后采用常规方法培养上述所得到的杂交瘤细胞株CfLec290-1A2，收集细胞培养上清液，经纯化后得到抗栉孔扇贝C-型凝集素成熟肽段单克隆抗体。 

所述的免疫学检测筛选方法是：间接酶联免疫法，间接免疫荧光法和转印免疫印迹法。其中所述的间接酶联免疫法和转印免疫印迹法综合确定该单抗与栉孔扇贝C-型凝集素成熟段特异性结合反应真实存在；间接免疫荧光结果同样显示该单抗可以与栉孔扇贝多种组织发生特异性结合，这与C-型凝集素在栉孔扇贝体内广泛存在的事实相符。 

本发明的单抗经转印免疫印迹检测结果显示其能特异性与42 kDa重组表达的栉孔扇贝C-型凝集素融合蛋白发生特异性反应。 

所述抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体在凝集素体外检测中的应用。 

本发明的优点在于：由于本发明制备了抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体，为研究栉孔扇贝C-型凝集素在栉孔扇贝非特异性免疫应答及其它生理功能提供了重要工具。由于本发明重要的制备技术路线是：通过重组表达栉孔扇贝C-型凝集素成熟肽段融合蛋白，经纯化后免疫小鼠，采用细胞融合制备杂交瘤细胞，再经过免疫学检测筛选方法筛选出抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体。这样的制备技术路线设计新颖，严密而合理。 

由于使用的间接酶联免疫技术，通过包被纯化的栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白于酶标板上，使得确认该发明单抗与栉孔扇贝C-型凝集素发生的特异性结合反应真实存在。本发明将间接免疫荧光法和转印免疫印迹法结合起来，能够更加直观的显示该发明单抗与非变性的和变性后的栉孔扇贝C-型凝集素发生特异性结合反应。 

附图说明

图1为表达栉孔扇贝C-型凝集素的表达质粒 pET32a-lec290构建示意图。 

图2为栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白的表达鉴定图。 

其中条带M表示分子量标准蛋白；条带1表示诱导表达前的大肠杆菌电泳图谱；条带2表示诱导表达4h后的大肠杆菌电泳图谱；条带3表示分离纯化的栉孔扇贝C-型凝集素成熟肽段重组蛋白。 

图3为栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白的凝集活性分析图。 

其中A表示栉孔扇贝重组蛋白与鳗弧菌发生凝集反应；B表示栉孔扇贝重组蛋白与金黄色葡萄球菌发生凝集反应；C表示栉孔扇贝重组蛋白与枯草芽孢杆菌发生凝集反应；D表示重组表达标签蛋白与鳗弧菌反应结果；E表示重组表达标签蛋白与金黄色葡萄球菌反应结果；F表示重组表达标签蛋白与枯草芽孢杆菌反应结果，即D、E和F为阴性对照。 

图4为ELISA方法分析单克隆抗体对栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白的特异性结合图。 

其中1表示单克隆抗体与重组表达标签蛋白结合的OD值，即阴性对照；2表示单克隆抗体与栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白发生结合反应的OD值。 

图5为转印免疫印迹法分析单抗与栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白的特异性结合图。 

其中条带M表示分子量标准蛋白；条带1表示诱导表达后的阳性大肠杆菌SDS-PAGE图谱；条带2表示单抗与栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白发生结合反应；条带3表示阴性对照。 

图6为间接免疫荧光法分析单抗与栉孔扇贝多种组织的特异性结合反应图。 

其中A表示在40倍物镜下观察的单抗与血细胞表面特异性结合反应；C表示在20倍物镜下观察的单抗与鳃组织发生特异性结合反应，E表示在20倍物镜下观察的单抗与外套膜组织发生特异性结合反应，G表示20倍物镜下单抗与肝胰腺组织发生特异性反应，荧光信号呈点状分散排布；B、D、F和H分别为骨髓瘤上清与血细胞、鳃、外套膜和肝胰腺反应，为阴性对照。 

图7为栉孔扇贝感染鳗弧菌后血细胞中凝集素含量随时间变化图。 

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。 

实施例1：构建表达栉孔扇贝C-型凝集素的重组质粒与蛋白表达

（1）以抗凝剂（27 mM 柠檬酸钠，336 mM NaCl，115 mM 葡萄糖，9 mM EDTA, pH 7.2）1：1的比例抽取栉孔扇贝血细胞，离心分离获取栉孔扇贝血细胞，并分别解剖获得栉孔扇贝其他主要组织器官，包括鳃、外套膜、肝胰腺、性腺、肾脏以及肌肉，将血细胞以及其他组织混合，组织匀浆后，以Trizol法分别抽提总RNA。

（2）根据引物设计原则及公布的一种栉孔扇贝C-型凝集素全长cDNA序列（GenBank：DQ209290），利用引物设计软件Primer5.0，结合pET32a质粒的多克隆位点的特点，选择BamH I和Not I的酶切位点处作为目的基因的插入位置，设计C-型凝集素成熟肽段表达引物： 

上游引物：5’-CGCGGATCCTATATTTCAAAGCATGGTACGGGAGATG-3’ 划线部分为BamH I酶切位点；

下游引物：5’-CGCGCGGCCGCTTAGCGTACAATCTCGCAGATATAGAAC-3’ 划线部分为Not I酶切位点。

（3）以提取的总RNA为模板，先逆转录合成cDNA第一链，然后进行常规PCR扩增，反应条件：94 oC变性5 min； 94 oC变性，30 s，65 oC退火30 s，72 oC延伸60 s，进行30个循环，最后72 oC延伸10 min，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA片段回收试剂盒对目的基因进行纯化回收。 

（4）将质粒pET32a和纯化回收的PCR扩增产物分别用限制性内切酶BamH I和Not I进行双酶切，连接后构建质粒pET32a-lec290（图1）。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21，然后把大肠杆菌BL21涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板表面，37 oC培养过夜，挑取菌落后经特异性引物PCR扩增检测确认有目的基因插入后，阳性菌落经扩大培养提取质粒进行双酶切鉴定，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，可见经BamH I和Not I双酶切后，成为两个片段，分别为pET32a和栉孔扇贝C-型凝集素成熟肽段编码基因（基因序列如下），与理论值相符。经DNA序列测定结果正确。 

（5）将阳性克隆菌和含pET32a空载体的菌株分别放入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37 oC恒温条件下振荡培养过夜，次日按1:100稀释培养过夜的菌液，继续培养至菌液浓度达到OD₆₀₀=0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG）至终浓度为1 mmol/L，未加IPTG诱导的菌液作为对照，继续培养4 h后，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。 

结果表明，诱导后的菌液蛋白在相对分子质量Mr=42 kDa处有明显的条带，而未诱导的菌液蛋白无相应条带（图2）。序列分析显示，C-型凝集素理论分子量约为23.5 kDa，而重组蛋白带有的pET32a载体组氨酸等标签蛋白的理论分子量约为21 kDa，所以构建的C-型凝集素重组蛋白分子量约为42 kDa，与SDS-PAGE凝胶显示的目的蛋白分子量一致。 

（6）采用上述方法，进行大量诱导。收集菌液，将菌体细胞用缓冲液B（50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% NP-40, pH 8.0）重悬后，反复冻融5次后置于冰浴条件下进行超声破碎8 min（Sonics & Materials；振幅39％；pulse on，4 s.；pulse off，1 s.），1500 g离心30 min收集包涵体沉淀；以Ni离子螯合的亲和层析柱（HisTrap HP 1 ml, GE）对重组蛋白进行纯化，纯化获得的目的蛋白经SDS-PAGE检测纯化情况，剩余的用PBS缓冲液（NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO₄ 10 mmol/L， KH₂PO₄ 2 mmol/L， pH 7.2）重悬，-80 ℃保存备用。 

结果显示，经亲和层析纯化后的目的重组蛋白条带单一，分子量为42 kDa左右，无其他明显蛋白条带（图2）。 

实施例2：栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白活性检测

一、制备异硫氰酸荧光素标记菌体

（1）分别培养大肠杆菌Trans1-T1、迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母。

（2）调整菌体浓度至10⁹ cells/mL，加入含有4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液至终浓度为1%，振荡固定30 min；6000 g离心5 min，去除上清。 

（3）菌体沉淀经TBS缓冲液重悬洗涤3次后，加入10 mg/mL异硫氰酸荧光素（FITC，溶解于DMSO）至终浓度为10 μg/mL，振荡孵育3 h；6000 g离心5 min，去除上清，菌体沉淀经TBS缓冲液重悬洗涤3次，调整菌体浓度至10⁸ cells/mL，4 oC避光保存备用。 

二、凝集活性测定 

（1）在96孔U型培养板上进行，2倍比浓度系列稀释栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白。

（2）20 μg/mL栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白分别与等体积FITC标记的9种菌体（大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母）混匀，20 oC避光静置1 h，荧光倒置显微镜观察。 

结果显示，栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白可以与鳗弧菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌发生凝集反应，表现为，荧光倒置显微镜下菌体成团成簇聚集，呈现为斑块状强烈荧光信号，阴性对照未发生凝集反应，菌体则成弥散状，为均匀散点荧光信号（图3）。 

实施例3：小鼠抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体的制备

一、免疫

用纯化的栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白作为抗原。每次的免疫剂量为0.1mL，免疫共分4次进行，前2次免疫间隔为2周，后3次免疫间隔为1周，前两次为腹腔注射，后两次为尾静脉注射：

（1）基础免疫：纯化的栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白1mg/mL与福氏完全佐剂等量（V/V）混匀作为抗原；

（2）加强免疫：纯化的栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白1mg/mL与福氏不完全佐剂等量（V/V）混匀作为抗原；

（3）二次加强免疫：纯化的栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白0.5 mg/mL作为抗原；

（4）融合前三天的扩增免疫：纯化的rLec290融合蛋白作为抗原。

二、细胞融合 

（1）脱颈椎处死免疫小鼠，无菌取出脾脏和胸腺后，分别过100目网筛，用RPMI-1640溶液吹打形成单细胞悬液；

（2）分别将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液1000 rpm离心3 min，弃去上清液，脾细胞沉淀用RPMI-1640溶液重悬，胸腺细胞沉淀用含有1% HAT的RPMI-1640 (含10% 胎牛血清)选择性细胞培养液重悬。

（3）取3×10⁷个处于对数生长期的P3-X63-Ag8U1骨髓瘤细胞，1000 rpm离心3 min，去上清液后，用RPMI-1640溶液重悬； 

（4）将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均匀后，1000 rpm离心3 min，完全吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀成糊状；用吸管吸取预温到37 oC的聚乙二醇（PEG）溶液l mL，滴加到离心管内，在1 min内加完；然后在37 oC水浴静置5 min；

（5）继续滴加已经预温到37 oC的RPMI-1640溶液15 mL，使PEG稀释而失去作用；

（6）补加RPMI-1640溶液至40 mL，经1000 rpm离心3 min，弃去上清液；

（7） 将沉淀的细胞用3 mL 37 oC的RPMI-1640（含10%胎牛血清）细胞培养液重悬，冻存2 mL；

（8）将剩下的1 mL细胞悬液加入（2）制成的胸腺细胞悬液，混合均匀后滴加到96孔培养板中；

（9）将培养板放入37 oC，CO₂浓度为4.5%的培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，大约两周后，取杂交瘤细胞培养上清液检测。

三、筛选和克隆 

   （1）筛选：融合后，待杂交瘤细胞群长到96孔培养板的孔底面积1/3时开始检测，采用间接酶联免疫技术筛选阳性杂交瘤细胞。

① 包被抗原：将纯化的栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白用碳酸盐包被液（pH 9.6）1:10稀释，加入96孔酶标板中（50 μL/孔），4 oC包被过夜； 

② 吸出包被液，用含0.05% 吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤，每次5 min，洗三次；

③ 每孔加入200 μL 3%的牛血清白蛋白（PBS配），37 oC封闭1 h；

④ 同②法洗涤三次；

⑤ 将杂交瘤细胞培养上清作为第一抗体按每孔50 μL加入至酶标板，37 oC温箱孵育1 h；

⑥ 同②法洗涤三次；

⑦ 碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig（1:4000稀释）作为第二抗体按每孔50 μL加入至酶标板，37 oC温箱孵育1 h；

⑧同②法洗涤三次；然后每孔加入100 μL 4-硝基酚磷酸盐（pNPP）应用液，暗处反应5-20 min，每孔加入50 μL 2M的NaOH，稳定3-5 min即可用405 nm工作波长测定OD值。

以包被含pET32a空载体的菌落表达的标签蛋白作为阴性对照，测波长为405nm时各孔光吸收值，计算各实验孔与阴性对照光吸收值之比（P/N），当P/N≥2.1时该孔为阳性。 

（2）克隆：采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，步骤如下： 

①脱颈椎处死小鼠，无菌取出胸腺，在100目网筛上研磨，用RPMI-1640溶液吹打形成单细胞悬液；

②把胸腺细胞悬液1000 rpm离心3 min，弃去上清液，胸腺细胞沉淀用10 mL RPMI-1640（含10%胎牛血清）细胞培养液重悬；

③把要克隆的阳性细胞孔中的细胞用血球记数板记数，然后用培养液以10倍梯度稀释，取出100个杂交瘤细胞，放入胸腺细胞悬液中；

④细胞悬液用滴管吹打均匀，滴加到96孔培养板中，每孔100 μL，平均每个孔含有一个杂交瘤细胞；

⑤放入CO₂培养箱中培养；

⑥两周后通过间接酶联免疫技术检测各孔杂交瘤细胞培养上清，把所得阳性克隆孔的杂交瘤细胞按上述方法再克隆一次，以保证形成单克隆。

四、冻存 

取生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，制成细胞悬液，200 g离心5 min，去上清，加冻存液（9份RPMI-1640培养基＋1份二甲亚砜），使最终细胞密度为5×10⁶个/mL，将1 mL细胞悬液装于2 mL冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管装入盛有棉花的小盒内，放于-80 oC超低温冰箱内过夜（8-12小时）后，再浸入液氮内长期保存。本发明获得的生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，其名称为：杂交瘤细胞CfL290-1A2，保藏号为：CCTCC NO：C201391，保藏日期为：2013年06月17日。

实施例4：本发明单抗的间接酶联免疫法鉴定：

（1）包被抗原：将纯化的栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白用碳酸盐包被液（pH 9.6）1:10稀释，加入96孔酶标板中（50 μL/孔），4 oC包被过夜；

（2）吸出包被液，用PBST洗涤，每次5 min，洗三次；

（3）每孔加入200 μL 3%的牛血清白蛋白（溶解于PBS），37 oC封闭1 h；

（4）同（2）法洗涤三次；

（5）将杂交瘤细胞CfL290-1A2培养上清作为第一抗体按每孔50 μL加入至酶标板，37 oC温箱孵育1 h；

（6）同（2）法洗涤三次；

（7）碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig（1:4000稀释）作为第二抗体按每孔50 μL加入至酶标板，37 oC温箱孵育1 h；

（8）同（2）法洗涤三次；然后每孔加入100 μL pNPP应用液，暗处反应5-20 min，每孔加入50 μL 2M的NaOH，稳定3-5 min即可用405 nm工作波长测定OD值。

用包被同等浓度的纯化的pET32a空载体菌落表达的标签蛋白作为阴性对照，包被PBS作为空白对照，测波长为405 nm时各孔光吸收值，计算阳性血清与PBS光吸收值之比（P/N），当P/N≥2.1时为阳性。 

结果：阳性：0.6226；阴性对照：0.0815。此结果证实本发明单抗能与栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白发生特异性结合反应（图4）。 

实施例5：本发明单抗的转印免疫印迹法鉴定

（1）十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳：

①将收集的阳性大肠杆菌等比例加入含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮3-5min；

②将①处理过的样品加入上样孔中，每孔内加样品10μL，在恒流条件下,起始时用低电流(30-40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流（50-70mA），电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶；

③剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(孔径0.22 μm)以电转移缓冲液（电转移缓冲液：25 mmol/L Tris-Base，192 mmol/L甘氨酸，20%甲醇，pH 8.3）润湿，放在电泳后的凝胶上。在硝酸纤维素膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持,将第二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面；按上述放置顺序，使胶块与硝酸纤维素膜及滤纸形成一套夹心的"三明治"；

④将"凝胶三明治"置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内，将硝酸纤维素膜面向阳极；电泳恒流200 mA，通电5小时；

⑤转移完毕，取出硝酸纤维素膜。 

（2）免疫印迹： 

①将硝酸纤维素膜用PBS洗10分钟，然后置3%的牛血清白蛋白溶液（PBS配）中封闭1 h，37 oC；

②用PBST洗3次，每次5分钟；

 ③将硝酸纤维素膜置于杂交瘤细胞CfL290-1A2培养上清中，37 oC缓慢摇动1 h；以骨髓瘤细胞培养上清孵育硝酸纤维素膜作为阴性对照；

④同②法洗涤三次；

⑤将硝酸纤维素膜加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig抗体(1:4000稀释)中，37℃缓慢摇动1 h；

⑥同②法洗涤三次；

⑦把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液（NBT-BCIP发色液）中发色，直到颜色清晰为止；

⑧用去离子水洗涤，以终止反应。将硝酸纤维素膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。

结果：本发明单抗与栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白分子量为42kDa蛋白发生特异性反应（图5），而阴性对照无条带显示。 

实施例6：本发明单抗在栉孔扇贝各组织中C-型凝集素分布检测中的应用：

（1）血细胞底片的制备：将离心获取的栉孔扇贝血细胞以0.01 M PBS重悬，将浓度调整到1×10⁷个/mL；将血细胞悬液滴在干净的载玻片上，每滴20 μL，在室温下湿盒中沉降1小时后取出放入丙酮中固定10分钟，取出风干，-20 oC冰箱中保存备用。

（2）组织冰冻切片的制备：取栉孔扇贝鳃、外套膜、肝胰腺、性腺、肾脏以及肌肉组织，切成不大于5 mm × 5 mm × 5 mm的小块，用无菌PBS溶液清洗干净后，置于OCT冷冻包埋剂中包埋，将包埋块置于-80 oC速冻后，-20 oC保存；使用冷冻切片机将-20 oC保存的组织包埋块进行连续切片，厚度为7 μm，将贴片后的载玻片丙酮浸泡固定10 min后取出，-20 oC冰箱中保存备用。 

（3）取扇贝血细胞滴片和各组织冰冻切片，在每张载玻片上滴加杂交瘤细胞上清，使之均匀覆盖在血细胞或组织切片区域上，于37 oC湿盒中避光孵育1 h。 

（4）倾斜玻片，去除多余液体，并迅速将载玻片置于PBST缓冲液中浸泡洗涤3次，每次5 min。 

（5）以异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠抗体为第二抗体，加在组织样品上，37 oC湿盒中避光孵育45 min。 

（6）同（4）洗涤玻片，滴加90%甘油进行封片。 

（7）荧光显微镜下观察。 

结果：本发明单抗与栉孔扇贝血细胞、鳃、外套膜以及肝胰腺发生特异性结合，呈现荧光阳性信号，而阴性对照则没有观察到荧光信号（图6）。 

实施例7：本发明单抗在鳗弧菌感染后栉孔扇贝C-型凝集素含量变化检测中的应用：

（1）健康栉孔扇贝分7组暂养于连续充气海水中，分别注射50μL PBS缓冲液、10⁶/mL鳗弧菌后，于0、3、6、9、12、24、36、48、96小时后，抽取血淋巴，离心，收集血细胞沉淀；

（2）将血细胞沉淀用PBS缓冲液重悬，离心洗涤2次，用适量PBS重悬血细胞沉淀；

（3）将血细胞样品用超声波破碎仪进行破碎（振幅39%，pulse on 3 s，pulse off 3 s）后，10000 g离心，收集上清，用改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定并调整蛋白浓度到100 μg/mL；

（9）将100 μL各血细胞蛋白粗提液样品包被于96孔酶标板（50 μL/孔），4 oC包被过夜；

（10）吸出包被液，用PBST洗涤，每次5 min，洗三次；

（11）每孔加入200 μL 3%的牛血清白蛋白（溶解于PBS），37 oC封闭1 h；

（12）同（10）法洗涤三次，将杂交瘤细胞CfL290-1A2培养上清作为第一抗体按每孔50 μL加入至酶标板，37 oC温箱孵育1 h；

（13）同（10）法洗涤三次，碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig（1:4000稀释）作为第二抗体按每孔50 μL加入至酶标板，37 oC温箱孵育1 h；

（14）同（10）法洗涤三次；然后每孔加入100 μL pNPP应用液，暗处反应5-20 min，每孔加入50 μL 2M的NaOH，稳定3-5 min即可用405 nm工作波长测定OD值。

用包被同等浓度的牛血清白蛋白（溶解于PBS）作为阴性对照，包被PBS作为空白对照，测波长为405 nm时各孔光吸收值，计算阳性血清与PBS光吸收值之比（P/N），当P/N≥2.1时为阳性。 

结果：本发明单抗检测发现，注射鳗弧菌后，栉孔扇贝血细胞中C-型凝集素的含量呈现先快速上升而后逐渐下降的趋势，一直显著高于对照组（图7）。 

Claims (3)

1.一种抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体是由保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C201391，保藏日期为：2013年06月17日的杂交瘤细胞CfL290-1A2分泌的。

2.一种如权利要求1所述抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：首先，通过重组表达栉孔扇贝C-型凝集素成熟肽段蛋白，经纯化后作为抗原免疫Balb/c小鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞；再通过免疫学检测筛选方法，筛选出分泌所述抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞CfL290-1A2，收集杂交瘤细胞培养上清，经纯化后得到抗栉孔扇贝C-型凝集素蛋白单克隆抗体。

3.一种如权利要求1所述抗栉孔扇贝C-型凝集素重组蛋白单克隆抗体在凝集素体外检测中的应用。

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