CN103547922A - 用于从样品检测细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于从样品检测细胞的方法,包括以下步骤:(a)将液相的样品或样品的部分以流动的方向施加至多孔的一般二维载体,所述载体具有孔,所述孔在其表面具有至少一个特异于待检测的细胞或这些细胞的片段的结合分子;(b)使待检测的细胞或这些细胞的片段能够从样品或样品部分进入所述多孔的一般二维载体的孔中,所述孔的平均孔径使得待检测的细胞或片段能够进入孔中;(c)通过至少一个特异于待检测的细胞或片段的结合分子留住待检测的细胞或片段;(d)通过成像方法在所述一般二维载体上进行光学读出方法,可选地在待检测的细胞或细胞片段已经通过标记剂被标记之后进行;其中(e)被用于读出方法的包括例如透镜系统的光学系统的光轴通常在样品或样品部分的流动的方向上延伸;并且(f)细胞或细胞片段的检测是在所述多孔的一般二维载体的表面上进行的。
Description
技术领域
本发明涉及用于从样品检测细胞(特别是微生物的)的方法。
背景技术
复杂的样品溶液中的细胞的定量和定性检测是微生物学、细胞学和现代生物技术的基本操作。
在这一方面,食品样品中微生物的快速和直接检测是特别严格的。由于样品基质的可能较高的复杂性,而且就特别相关的细菌(例如沙门氏菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria)或军团杆菌(Legionella)(饮用水))而言确保无菌性的需要,以及因此的细菌的检出限,它具有高的要求。特别地,食品工业要求一种不需要富集(enrichment)(即微生物的繁殖)的步骤,的方法。提供新的快速并廉价的微生物检测方法是具有很大现实意义的问题。尽管近数十年来,为改善公众健康取得了显著的创新性科学成就,并且传染病减少,但是全世界每年约300万人死于食源性疾病。因此,在死因统计中,与食物相关的感染被发现与AIDS处于相同的水平,并且比肺结核更高。
在根据德国食品和饲料法(German Food and Feed Act)(LFGB, 2006)的要求和建议的最近建立的检测方法中,一等分的食物(通常25g)或一研磨海绵样品或从胴体表面和棉签(swabs)穿刺而出的样品,被悬浮在225ml的液体培养基中,从而增加均匀地和部分地污染的食物的检测灵敏度。通过该方法,一方面,细菌被洗脱进培养基,而另一方面,对于培养相关的方法,介质用于激发亚致死性损坏的细菌。这一步骤通常在一个或多个非选择性或选择性的持续数小时的初始富集步骤中进行。假设菌落从每个细菌形成,随后通过将初始培养基接种到营养琼脂平板上进行经典的检测步骤。因此,例如在已建立的微生物肉类检测中,待检测的病原体在一个或多个液体选择性富集介质中进行初步培养24至48小时。在固体培养基(选择性琼脂)培养之后,对细菌进行形态学和表型评估。转移至无抑制剂琼脂之后,菌株最后被进行生化和血清学表征直至食用水平。从样品到达实验室到结果陈述,例如对于单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria
monocytogenes),检测的整个过程需要三天(阴性样品)至五天(阳性样品)。
为了实现法例规定,其要求大量额外的中间控制,特别地没有大量延迟,前述采用的技术太慢和太复杂。此外,微生物特定的富集/繁殖发生的所有过程都必须在经当局批准的微生物实验室中进行(德国感染保护法第64款)。食品制造商通常从相关的逻辑学及财务支出回避,并要求快速的方法从而避免上述问题。
因此,在过去二十年中进行了许多努力,以发展更快的方法,其中在非选择性初步富集之后,能够不需要形成菌落而进行检测,这可以缩短方法。以下简单地介绍这些方法。
核酸检测方法(PCR,RNA杂交,NASBA):作为规则,这包括细胞裂解,随后进行核酸提取、特定核酸目标的扩增和最终检测。对于使用的平均量为1-10
µl的模板,能够达到约为10基因组当量/样品的检出限。由于使用的样品体积通常仅为10-50 µl,预孵育数个小时之后必须达到103
至104的细菌数量,从而能够确定起始样品的无菌性。
免疫测定法(ELISA,免疫层析法):这是基于抗原和其相应的抗体的高度特异结合反应以及随后反应产物的光学检测,该检测通过酶或染料标记的检测抗体结合至先前形成的复合物。免疫测定法需要样品体积约50-200
µl,检出限约为103至104 CFU/样品
(ELISA)或104 至105 CFU/样品(免疫层析法)。数小时的初始富集步骤在这里是必须的,从而得到这样的细菌数量并且确保起始样品的无菌性。
流式细胞术:与荧光共轭物和磁性粒子结合的流式细胞数被应用于食物检测。检出限近似103 CFU/ml。因此,该方法不能在没有初始富集的情况下也不能被应用。此外,流式细胞术被应用于血细胞(特别是白细胞)的免疫表型。当被用于微生物学时的相似的方法学缺点如下。约5000个细胞必须被检测,从而得到有效的结果。因为红细胞的大量过剩,对于白细胞,这会导致非常长的检测时间。为避免这一点,在此也必须进行白细胞的初始富集,例如通过浓度梯度的离心来分离白细胞或者通过红细胞的选择性渗透裂解来测定。 这些方法是繁琐的,其中一些没有充分的选择性,并导致细胞的流失。
抗体直接荧光过滤技术:在该技术中,微生物的分离是通过体积排阻在表面过滤器上进行的。通常,使用0.45 µm的过滤器。通常通过使用活体染料的染色(活/死染色,见下文)进行检测,或者通过免疫荧光共轭。通过该技术,原则上能够达到10-100 CFU/样品的检出限。问题是因为食物成分的颗粒沉积在过滤器上,该方法具有失效的高敏感性。因此,它仅能够被应用于相对干净的样品或者在红细胞成分的分离之后,并且由于其失效的敏感性,其被特别限制为1-10
ml的样品。
在专利文献中,已经描述了对这些平台技术的某些特别的设计。因此,EP-A-1 223 429描述了一种用于检测活微生物和/或真核细胞(特别是样品中的单细胞生物、霉菌)的方法,其中液体形式的样品被与载体接触,该载体具有特异于将要检测的微生物的受体,所述微生物被结合至受体,并且测定一个表示活微生物的因素。在此描述的方法中的载体包括以模制品形式的柱提供的材料、颗粒形式的松散填料,以琼脂的形式或作为分散体,其携带用于特别地结合待确定的微生物的至少一个受体,并且对流体是可渗透的。载体材料的平均孔径为1至200 µm,并且孔体积分数为20~80%。该载体材料没有或者仅具有非常低的、非特异的对微生物的吸水性(sorptivity),并且具有每ml载体102至1018 受体的载量。通常通过圆柱形过滤元件或填料在微型柱内进行分析,并且整体检测过滤器上的光学变化。流动的方向和评估的方向相互垂直。该方法达到与上述免疫分析方法相似的检出限。
WO-A-2008/118400公开了生长于透明的半透膜上的微生物的群体的快速测定和鉴定。该测定是使用显色指示剂在常规的琼脂平板上完成的。这是一种改进的经典微生物操作方法,允许更有效的操作。
WO-A-2004/072097公开了用于HIV诊断的基于微芯片的系统。其中描述的一种方法的变形涉及结合有抗体的核孔膜上的细胞的检测,膜的孔径比待检测的细胞更小。
WO-A-91/01485涉及使用定量评价的比色或荧光快速测试。为了检测细胞成分,后者被提取,并且抗原的检测在负载抗体的载体上进行。
EP-A-0421235公开了层压至载体结构的亲水膜,以应用于侧向流试纸测试。
WO-A-85/05451描述了在多孔固相上进行的三明治检测(sandwich assays)。当检测进行时,固相被沿轴向穿过。多孔膜的孔不是特定的。但是,看上去使用的孔径小于待检测的细胞的尺寸。
EP-A-2
317 319提出了用于结合检测的多孔固相,该检测能够使测试样品(例如全血)被迅速、便捷、准确、廉价地分析,而不需要预处理,并公开了使用所述多孔固相的结合测试方法。在加入测试样品之前,至少一种表面活性剂被结合至用于结合测试的多孔固相,所述至少一种表面活性剂选自:(A)包括通式(I)所示化合物的含糖表面活性剂, (B)包括蔗糖脂肪酸酯的含糖表面活性剂,其中构成脂肪酸具有5至14个碳原子,以及(C)甾类表面活性剂。参考文献没有提到待分析的组分的穿透进多孔固相的孔中的重要性。
发明内容
本发明的目的是提供一种指示定义的原核细胞和真核细胞的测试方法。该测试能够简单并快速地进行,并且简单并廉价地准备。它应该允许细胞的检测,特别是微生物的检测,即使对于大约<
100个细胞(特别地大约< 10个细胞)的小细胞数量,并且它应该能够用于各种各样的复杂的液体样品。通过该测试,应该能够同时检测活细胞和死细胞。因此,应该能够将该方法使用于微生物学,但也可以在具有类似使用特点的其他领域应用中使用,例如体液或细胞培养基中特定的体细胞的检测。
本发明的目的通过以下方法实现。一种用于从样品检测细胞的方法,包括以下步骤:
(a)将液相的样品或样品的部分以流动的方向施加至多孔的、大体为二维的载体,所述载体具有孔,所述孔在其表面具有至少一个特异于待检测的细胞或待检测的细胞的片段的结合分子;
(b)使待检测的细胞或待检测的细胞的片段能够从样品或样品部分进入所述多孔的、大体为二维的载体的孔中,所述孔的平均孔径使得待检测的细胞或片段能够进入孔中;
(c)通过至少一个特异于待检测的细胞的结合分子留住待检测的细胞或片段;
在样品或样品的部分已经被施加并且待检测的细胞或细胞片段已经进入孔之后,所述样品载体被可选地洗涤;
(d)通过成像方法在所述大体为二维的载体上进行光学读出方法,可选地在待检测的细胞或待检测的细胞的片段已经通过标记剂被标记之后进行;其中
(e)被用于读出方法的包括透镜系统的光学系统的光轴大体在样品或样品部分的流动的方向上延伸;并且
(f)待检测的细胞或细胞片段的检测是在所述多孔的、大体为二维的载体的表面上进行的。
附图说明
图1示意性地示出了能够被应用于根据本发明的方法中的装置。
图2至4示出了膜部分的显微照片。
具体实施方式
在本发明的定义中,“大体为二维的载体”指厚度为10 µm至 mm且长度和宽度为1 mm至100 mm的载体。
本发明的定义中的特异性结合分子是从常规结合实验和亲和层析中已知的生物的和合成的配体,其结合至待检测的细胞或对已经被加入样品中的细胞特异的结合分子,优先于样品的其他组分。特别地,这些包括天然的或重组的抗体、抗体片段和类似物(mimetics)、免疫活性抗原、寡核苷酸、多聚和低聚糖、结合分子的多聚和低聚糖(例如外源凝集素)、细胞膜受体的配体、噬菌体或噬菌体蛋白质、结合IgG的蛋白(例如蛋白G、A或L),以及特定的亲和标签的结合配体(如步骤标签,His标签等)。此外,当结合特性被适当地选择时,如果它们允许特定的细胞或细胞类的至少部分选择性结合,具有疏水性、阴离子的、阳离子的或两性离子的特性或具有由分子印迹产生的表面结构的配体也可以被使用。其中的典型例子是革兰氏阴性微生物结合至弱阴离子交换剂。例如在由David
S. Hage 编辑的Affinity Chromatography (2006), Vol. 92,
Taylor & Francis中, 可以找到结合分子的进一步例子。
在可选的洗涤步骤中,因为待检测的细胞或待检测的细胞片段的结合,可以以与样品应用液体的流向相同或与样品应用流体的流向相反的方向加入洗涤液。
在本发明的特定实施方式中,在其应用至多孔的、大体为二维的载体之前或之后,对样品进行样品处理,使得细胞或细胞组分被标记。这可以例如通过染料染色进行。染色或标记方法对本领域技术人员是已知的。
可以被用于根据本发明的方法中的大体为二维的载体,例如多孔膜,特别地层厚度为0.05至1 mm。
根据本发明,可以通过例如通过适用于检测细胞或标记的光学显微镜法的光学读出方法来进行评估或分析,例如通过荧光显微镜以检测荧光基团(fluorophors)或者亮视野显微镜以检测发色基团。特别地,放大倍率为2x和40x之间的具有透镜系统的通常显微镜和数字照相机可以被用于此。
特别地,与德国食品和饲料法相关的微生物能够通过根据本发明的方法被检测。特别地,所述微生物可以选自沙门氏菌(Salmonella spp.)、李斯特菌(Listeria spp.)、大肠杆菌(E. coli)、大肠菌群细菌(coliform
germs)、弯曲杆菌(Campylobacter spp.)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、亚硫酸还原梭状芽胞杆菌(sulfite-reducing
clostridia)、凝固酶阳性葡萄球菌(coagulase-positive staphylococci)。
根据本发明,特异于待检测的细胞或其片段的受体可以特别地选自抗待检测的细胞或其片段的抗体、外源凝集素、噬菌体,以及细胞膜受体的特定的自然或重组配体。为了检测一组细胞或其它们的片段,特别是微生物(例如革兰氏阴性细菌),也可以使用简单的化学物质(特别是胺)。
在本发明的一个实施方式中,载体可以由发泡的、烧结的或纤维的无机或有机材料构成。
特异于待检测的细胞的结合分子可以被结合至材料,载体由已知的化学方法由该材料制成,如由David S. Hage编辑的Handbook of Affinity Chromatography (2006), Vol. 92,
Taylor & Francis,pp. 49 ff.中所描述的。例如,如果结合分子通过共价结合被连接至载体,载体上的功能基团与结合分子上的功能基团连接。这可以通过所谓的间隔物(通常是双功能分子)直接或间接地进行。如果所述发泡的、烧结的或纤维的无机或有机材料的表面上的功能基团没有足够的数目来提供结合分子的必要的密度,制成载体的材料可以被合适的方法功能化。为了该目的,合适的方法对于本领域技术人员来说是可用的。
当可以被用在根据本发明的方法中的载体被制备时,烧结的聚乙烯材料可以作为起始材料。适当的纤维材料也可以被使用。
与根据现有技术的方法相反,在根据本发明的方法中使用的多孔载体的孔径被选择使得细胞或细胞片段能够渗透入这些孔。因此,根据待检测的样品材料和细胞种类,孔径可以选自2 µm至200 µm,特别地10 µm至100 µm,即显著大于用于相同细胞种类的现有技术检测方法中的孔径。因此,例如,在根据本发明的方法中使用的用于检测细菌的孔径是2 µm至50 µm,而对于检测真核细胞则是40 µm至200 µm。在每种情况下,下限大约可以对应于待检测的细胞的直径的约两倍,从而细胞能够渗透进载体。已经证明,对于检测细胞,孔径为5 µm至25 µm的载体特别有利,而对于检测真核細胞,40 µm
至100 µm的孔径特别有利。
因为使用的孔径,根据本发明的方法使得样品能够通过体积排阻过滤器进行高效的预过滤,该过滤器的排阻阈值高于待检测的细胞的尺寸,但低于根据本发明的载体的孔径。因此,除了待检测的细胞之外,仍然存在于由此预过滤的样品中的固体能够穿过不受阻碍的载体。这降低了过滤器阻塞的可能性,并且相对于现有技术相应地显著提高了最大可过滤体积。
通常,孔径为2 µm至100 µm,特别为10 µm至40 µm。然后,结合分子的共价结合可以通过将它们化学地结合至表面的功能性基团或非共价地吸附至表面来进行。除了过滤器的结合特性,它们的光学特性和过滤特性以及与微生物剂的兼容性对于所述载体在所需应用的使用中是必要的。
有利的是,通过染色使细胞或其片段变得可检测,即使细胞或其片段原则上也可以通过直接显微镜观察来识别。可以通过由抗体和酶或抗体和染料或着色剂颗粒组成的共轭物,或者通过由寡核苷酸和染料组成的核酸、或者酶、嵌入染料、或者酶反应将待检测的细胞或其片段变得可检测。
以下染色技术可以被用于根据本发明的方法:
使用染料和荧光染料活/死染色方法:这是基于作为标记剂的染料动态结合至细胞膜或细胞器,或者通过细胞酶或通过检测呼吸链的中间体进行的染料前体的转换,或者通过DNA或RNA中的嵌入。合适的然和和它们的应用协议对于本领域技术人员是已知的,并且在例如Molecular
Probes Handbook、A Guide to
Fluorescent Probes and Labeling Technologies中有记录。
通过抗体结合物的免疫染色:抗体-染料结合物可以通过抗体与染料分子或着色剂颗粒的结合来制备。为了这一目的,存在广泛的化学激活和可激活的染料。
抗体-酶结合物通常通过抗体与辣根过氧化物酶、半乳糖氧化酶或磷酸酶的结合来制备。如果结合至二维载体的微生物标记有这些结合物,可以通过加入基于四甲基联苯胺的沉淀底物或基于(E)-2-(2-[4-羟基苯基] 乙烯基)-3-乙基-1,3-苯并噻唑碘化物的蛋白结合底物来简单地使它们可见。进一步的合适的底物从生物化学和免疫组织化学中是已知的。
原位杂交:使用酶或染料标记的RNA的特定DNA/ RNA序列细胞内标记已经被建立来进行微生物的检测,例如在微孔板中。合适的探针对于许多微生物是商业可获取的,并且也可以通过已知的方法为其他细胞种类合成。这些方法很容易适应膜。
特别地,可以通过简单的固体光源激发的染料和显示出大于50nm的斯托克斯位移的染料可以被用在这些标记技术中。
被选择来读出多孔的、大体为二维的载体的方法可以通过标记剂或通过细胞的内在属性来确定。用于根据本发明的方法的可能的评估方法包括,例如入射光或透射光技术中的亮场或暗场显微镜、相衬显微镜和偏振显微镜以及荧光显微镜法,例如荧光显微镜、激光共聚焦显微镜,荧光寿命成像光谱、近红外光谱成像、多光子成像。特别地,通常的直立和倒置显微镜(例如来自Zeiss公司的)能够被用作此目的。
被使用的二维载体中,所述载体具有1 mm2至100 cm2的表面积和10 µm至2 mm的厚度,以在载体中检测荧光细胞。浸入式液体可以被可选地用来提高光学特性。还可能的是,使用具有大至200 cm2的表面积的大面积载体,并使用设备(例如螺旋接种仪)通过喷嘴来检测样品,这已经在微生物学中建立。它留下了痕迹,其能够通过光学方法来追踪和评估。
根据本发明的方法使被寻找的细胞能够被保留在根据本发明的载体的整个容积中。整个载体容积的高清晰度图像(其包括载体的整个厚度)特别地有利于完全地检测被保留的细胞。根据本发明,这可以通过机械、图像处理和光学措施被实现。例如,当采用该方法时,当载体被目视检查时,显微镜的焦平面可以通过载体的整个厚度位移。 并且,在数字图像采集中,可以准备聚焦堆栈,亦即使用相同的图像细节但不同的焦平面的图像集合,并且堆栈的整个维度的所有对象的高清晰度图像可以从中计算。对此合适的算法对本领域技术人员是已知的。特别地,以像素计的荧光显微镜的聚焦堆栈的所有图像的增加已经被证明是有用的。如果将要成像的对象大于10 µm,例如酶染料衬底反应的真核细胞或色晕。可以通过使用具有低放大倍率和数值孔径(numerical
apertures)的物体来实现所需的景深。特别地,这些物体的放大倍率为0.5x至5x,并且数值孔径为0.01至0.1。此外,光场显微镜和数字全息也可以被用作图像采集方法。
特别廉价的光学评估单元可以通过数字照相机来实现。可以通过将膜置于具有0.1至 2 µm的像素间距的图像传感器直接地进行成像。并且,可以通过结合照相机和微距镜头、或显微镜物物体和管来使用常规的成像系统。在两种方案中,可以在计算机屏幕上或通过电子图像处理方法来简单地进行评估。通过这些系统,可以通过没有技术支出,来制得空间分辨率为每像素2至0.5 µm且放大倍率高达400倍的图像,该图像非常适于屏幕测试。特别地,所述光学系统可以通过通常的USB显微镜来实现。
如果填充多孔的、大体为二维的载体的孔的介质的折射率np和多孔的、大体为二维的载体的折射率nt之间的差值nt-np小于0.05(特别地小于0.02),则能提高根据本发明的方法的敏感性。
如果孔被填充有折射率小于固相的液体,则能够获得孔和固相的折射率的近似值。这可以通过适当地选取检测中使用的试剂,或者通过在完成结合实验之后交换孔的内容物来完成。
在第一种情况中,可以在使混合物的折射率接近固相的浓度下,将检测试剂混合至例如与水混溶的或可溶于水的正在提升其折射率的物质。 特别合适的混合物是高密度的与水混溶的液体,例如甘油、短链的聚乙二醇、硫二甘醇。合适的水溶性物质是具有高溶解度和高分子量的物质,例如碘化钠、氯化铯、蔗糖。加入的物质的浓度应该保持较低,使得检测(例如抗体复合物的形成)不会被妨碍。
在另一种情况中,最后加入的检测试剂可以在结合实验的过程中或完成之后被替换为折射率与固相相同的液体。为了这一目的,首先,与在先前文本中描述的相同的水混合物和溶液使合适的。但是,物质可以被加入时的浓度限制较少。在某些情况下,免疫复合物的形成甚至可以被阻止。但是,已经被形成的免疫复合物的结合应该被维持。特别是当使用二甘醇时,所述物质可以以纯的形式被使用,据此,常规的固相(例如硝化纤维)的折射率也可以被达到。如果固相是充分可湿的,不与水混溶的物质(例如浸油)也可以被使用。
在一个实施方式中,可以被用在根据本发明的方法中的载体由多孔聚合物材料(特别是全氟聚合物和含氟聚合物)制成。特别地,它可以选自氟化乙烯-丙烯(FEP)共聚物、聚四氟乙烯(PTFE)、四氟乙烯-六氟丙烯-偏二氟乙烯(THV)、全氟烷氧基烷烃(PFA)、磺化的聚四氟乙烯(NAFION),或另一组聚乙烯、纤维素衍生物、聚酰胺、聚(甲基丙烯酸甲酯)。在本发明的一个实施方式中,根据本发明的多孔载体可以被实施为膜或平压的部分(玻璃(frit))。
所述载体具有孔体积并能够以不同方式中的一种制备。合适的方法特别地包括烧结法,其中颗粒或纤维高分子材料被通过加热压成一个形状。特别地,用于制备非织造物的方法或织物技术可以被用来制备纤维材料。对于颗粒材料,用于制备玻璃的方法是特别合适的。此外,生成孔的方法是合适的,例如特别是,通过挥发性发泡剂(发泡)或通过可溶性牺牲材料(在使用载体之前被从孔浸出)造成的起始材料的膨胀。除了这些转换材料的方法,孔形成发生在固相从溶剂中沉淀(例如水凝胶-晶胶或气凝胶方法)期间的方法也是合适的。
在一个实施方式中,所述载体是通过从直径为40µm的球形PMMA颗粒中烧结而制备的。当细胞通过固定化抗体被结合至表面并且通过抗体-荧光染料结合物被染色时,如果通过将水相替换为例如是83%的二甘醇17%的水的混合物来实现近似的折射率,可以获得特别鲜明的图像。
在另一个实施方式中,所述载体是从由纺制FEP制成的无纺布中制备的。在本例中,如果使用通常的缓冲介质(例如PBS),已经获得了折射率的匹配。
如果在用于载体的多孔材料的表面上没有用于结合分子的化学结合的功能性基团,可以通过使用合适方式的化学反应来使后者功能化,从而固定用于多孔载体的异质性结合试验所需的结合分子。
因此,例如,根据DE-A-10 2009 003374,“底物的永久亲水性多孔涂层及其多孔膜”,第0061段和表1,可以通过聚乙烯醇丙烯酸甲酯(PVMMA(2.5))的亲水涂层提供形成为膜的多孔载体。
由此被OH基团亲水化的PTFE膜可以被进一步与3-氨丙基三乙氧基硅烷在有机溶剂中反应,并因此具备氨基基团。例如,如由David
S. Hage编辑的handbook of Affinity Chromatography
(2006), Vol. 92, Taylor & Francis,pp.
54-55.所述,可以通过同型双功能的N-羟基酯来反应,使得结合分子能够被结合。琥珀酸作为双功能间隔剂的使用是特别有利的。
抗体被通过所述方式结合至的亲水化的PTFE膜(Millipore的 OMNIPORE JC)已经被证明是特别有利的。典型的修改程度是每100µg膜体积1至100 µg抗体(特别是5-10 µg抗体)。在50 µm的膜厚度,这一最佳值的上限值对应于每cm2 过滤器面积约4 µg抗体且具有大到约3 x 1013个特定的结合位点。由于在该方法中的结合产率一般为1-10%,在这种膜中可以假设约0.3-3
x 1012活跃的结合位点/cm2。通过结合分子的这样的密度,非常有可能将微生物或它们的特征片段生物特异性地结合至所述膜,特别是如果抗体直接抵抗在膜(例如多糖或脂多糖)上发生数次的抗原。
通过以下实施例进一步描述了本发明。
实施例
1
饮用水中军团菌(Legionella)的荧光检测。
1.
PTFE膜的功能化和抗体固定。
在第一个步骤中,通过OH基团亲水化的PTFE膜(来自Millipore的OMNIPORE JC)通过3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)的处理而被氨化。因此,50µl的3-氨丙基三乙氧基硅烷(Sigma-Aldrich Chemie GmbH)被溶解于4950 µl的丙酮中,并在90mm的玻璃培养皿中被施加至干的膜(d = 5 cm)。所述培养皿被转移至玻璃干燥器,该干燥器被快速地(<
10 min)排空至< 300 mbar。在关闭的干燥器中在定轨振荡器上在20 rpm室温下孵育12小时。随后,加入0.42 µl试剂级37%的盐酸(Carl Roth GmbH & Co. KG)。培养皿然后被转移至玻璃干燥器,该干燥器被快速地(<
10 min)排空至< 300 mbar。然后在关闭的干燥器中在定轨振荡器上在20 rpm室温下孵育6小时。此后,通过抽吸来去除液体,并且向所述膜加入6.25 ml的丙酮。此后,再次关闭干燥器,将培养皿在定轨振荡器上在40
rpm震动。重复每个步骤两次。最后,通过供应充足的空气,在室温下将膜干燥至少1小时。
在第二个步骤中,进行所述膜的COOH功能化。因此,在培养皿中的干燥的膜被使用5 ml 的DMF层覆盖并且在定轨振荡器上震动5 min。通过抽吸去除液体,并且重复先前的步骤。再次通过抽吸去除液体。
此后,所述膜被使用5 ml的琥珀酸酐溶液(400 mg溶于10 ml的DMF中)层覆盖并且在定轨振荡器上震动10 min。随后,加入5 µl的吡啶,并且培养皿在具有干燥剂的关闭的干燥器中在定轨振荡器上在20 rpm在室温下被孵育12小时。通过抽吸去除液体,而所述膜被使用5 ml的双蒸水层覆盖。所述膜在定轨振荡器上震动5 min。重复两个先前的步骤。
在第三个步骤中,进行抗体至膜的结合。
因此,来此步骤2的湿的膜被使用5 ml的MES缓冲液(19.5 g的2-(N-吗啉)乙磺酸溶于1升H2O中形成的0.05 M溶液,pH = 5.5)覆盖,然后在定轨振荡器上震动5 min。重复前述步骤。通过抽吸去除液体,所述膜被使用5 ml的EDC溶液(328.6 mg的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基] 碳二亚胺盐酸盐溶于20.53 ml的MES粉末中)覆盖,并在定轨振荡器上震动10
min。此后,加入0.5 ml的磺基-NHS溶液(406.2 mg的N-羟基琥珀酰亚胺,1.127 ml的MES缓冲液),在孵育30 min后,吸掉液体,而所述膜被使用5 ml的MES层覆盖。它然后在定轨振荡器上震动10
min。重复两个先前的步骤。随后,所述膜被使用2.5 ml的抗体溶液(80 µg/ml的抗Legionella 抗体5F4,Senova GmbH,魏玛,溶于 MES缓冲液)覆盖,在定轨振荡器上震动120
min。通过抽吸去除液体,所述膜被使用含有0.25%乙醇胺溶液(封闭的)的5 ml的MES层覆盖30分钟。随后去除液体,所述膜被使用5 ml的MES缓冲液覆盖,然后在定轨振荡器上震动10
min。重复前述步骤。
最后,通过抽吸去除液体,所述膜被使用5 ml的干燥缓冲剂层覆盖,然后在定轨振荡器上震动60
min。通过抽吸去除液体,通过强制空气循环在室温下将所述膜干燥1小时。
2. 过滤器组件的制备。
使用打孔器从所述膜上打孔形成直径为1至5 mm的圆形过滤器。所述过滤器被置于聚乙烯玻璃2(Durst
Filtertechnik,Besigheim,德国,型号XM112,d = 5 mm,h =
1.6 mm)上,并被引入有机玻璃的样品架的腔中。在所述膜上方,一短块PTFE挠性管3被压入所述腔,而微型柱(750 µl
ABICAP,Senova GmbH,魏玛)的鲁尔口(Luer port)4被插入至挠性管3。图1示出了在实施例1中使用的组件。
3. 样品的应用、使用抗-Legionella-藻红蛋白染色、以及光学评估。
在第一个步骤中,将500 µl的待检测的样品用移液管吸取至微型柱。在样品由于重力流过所述组件之后,将750
µl的洗涤缓冲液(0.1% BSA和0.05%
Tween 20溶于PBS缓冲液,pH =
7.4)用移液管吸取至Abicap柱。
洗涤缓冲液(500 µl的抗-Legionella-藻红蛋白结合物(ImmunoTools GmbH,罗斯托克,德国)溶于含酪蛋白(1 mg/ml)的PBS缓冲液形成的0.5 µg/ml溶液,pH = 7.4)在第二个步骤中被加入。在结合物溶液在约4 min内流过所述组件后,使用750 µl的洗涤缓冲液进行洗涤步骤三次。随后,移除Abicap柱和PTFE挠性管,然后使用数µl的生理盐水覆盖所述膜。使用落射荧光显微镜(Axiostar plus,光源为HXP150C,滤光片为43 HE,物镜为A-Plan 10x/0.35;全部来自Zeiss
MicroImaging GmbH,耶拿,德国)和显微照相机(AxioCam MRc5,Zeiss MicroImaging GmbH,耶拿,德国),计算透明的膜上荧光标记的细菌的数量。通过这一方法,达到每个过滤器10个细菌的检出限。图2示出了根据实施例1的膜部分的显微照片。应用的样品含有约500个 Legionella细菌。
实施例
2
通过HRP/TMBprec.检测的饮用水中Legionella细菌的检测。
1. 在HDPE膜上的抗体固定。
在第一个步骤中,通过类似于Meyer M.F. et al., Biosensors and Bioelectronics
2007, 22 (6), p. 973中描述的方法,抗-Legionella
抗体(5F4, Senova, 魏玛)通过HDPE膜(Porex Inc. 型号T3,孔径5-10 µm,厚度200 µm,高密度聚乙烯=
HDPE)上的物理吸附被固定。因此,50个圆形过滤器(d =
5 mm)被冲出,并且被置于具有20 ml乙醇(96%)的50 ml的烧杯中,并在10 Torr下在干燥器中脱气,在磁力搅拌器上轻微搅拌20
min。随后,使用50%的乙醇溶液洗涤过滤器,并最终将过滤器在10 ml的碳酸盐缓冲液(100 mM, pH 9.5)中脱气三次。随后,伴随搅拌加入100 µl的溶于碳酸盐缓冲液的1 mg/ml 抗-Legionella
溶液。在干燥器中在室温下轻微搅拌孵育所述过滤器6小时。随后,使用封闭(block)溶液(5.5 mg/ml的酪蛋白溶于PBS缓冲液(150 mM,pH = 7.3))替换抗体溶液,脱气之后,搅拌封闭1小时。随后,使用干燥缓冲液(PBS,1% BSA,1%蔗糖)替换封闭溶液,并在干燥器中孵育1 h。最后在流化床干燥机(FPD200 Endicots,英国)中在室温下干燥所述膜15
min。
2. 过滤器组件的制备。
类似于实施例1的项目2,进行过滤器组件的制备。
3. 样品的应用,使用抗-Legionella-HRP 结合物 +沉淀TMB染色,以及光学评估。
在第一个步骤中,浓度为10 cfu/ml、100
cfu/ml、1000 cfu/ml的样品溶液每个2x 500 µl被用移液管吸取至所述装置。随后,先后加入750
µl 的PBS洗涤缓冲液和500
µl的抗-Legionella-过氧化物酶结合物在PBS缓冲液(Senova GmbH,魏玛,德国)中形成的5 µg/ml的溶液。结合物溶液流过所述组件之后,3x
750 µl的洗涤缓冲液及随后的500 µl的沉淀TMB底物溶液(SDT 公司,Baesweiler,德国)被用移液管吸取进所述组件。4分钟之后,750
µl的洗涤缓冲液再次被用移液管吸取至柱以终止(quenching)检测反应。随后,移除所述膜,并将其转移至显微镜载玻片上,而细菌的特征色晕被使用透射光显微镜(Axiostar plus,具有卤素光源且物镜为A-Plan 5x/0.12;全部来自Zeiss
MicroImaging GmbH,耶拿德国)和显微镜照相机(AxioCam MR3,Zeiss MicroImaging GmbH,耶拿,德国)来计数。图3示出了由此获得的针对样品的不同Legionella内容物的膜的部分显微照片。通过该方法,能够达到5-15个细胞的检出限。图3a示出了根据实施例2的膜部分的显微照片。应用的样品不含有Legionella细菌。图3b示出了根据实施例2的膜部分的显微照片。应用的样品含有约100个Legionella细菌。图3c示出了根据实施例2的膜部分的显微照片。应用的样品含有约1000个Legionella细菌。
实施例
3
通过在透明膜上的活体染色的Salmonella细菌检测。
1. 抗体的固定。
使用根据实施例1项目1的膜。代替其中使用的抗体,单克隆的抗-Salmonella 菌属抗体(1E6,Sifin GmbH,柏林)被固定在膜上。
2. 过滤器组件的制备。
直径为24 mm的圆形过滤器被使用打孔器从所述膜上冲出。所述过滤器被固定至空的20 ml的具有可插入底部的柱(SpinColumn,AHN
Biotechnology,北豪森,德国)的底部。蠕动泵被连接至柱的较低鲁尔口。
3. 样品制备。
25 g的热消毒肉样品和225 ml的缓冲蛋白胨水被加入至兜包袋(Stomacher
bag)(BA6141/STR,Seward
Limited,英国)的内部过滤袋,并使用10 µl的Salmonella typhimuria (ATCC 14028)预培养物(1000
germs/ml)孵育。随后在37 °C下孵育样品,并且4、6、8和10个小时后从外部袋移除每个样品的10.1 ml。
4. 参考检验。
每个子样品100 µl被接种到XLD琼脂上。在37 °C孵育24小时后,通过计数确定菌落的数目。
5. 样品的应用,染色,以及光学评估。
被从兜包袋移除后,10 ml的子样品立即被加入至柱,并被通过蠕动泵在1
ml/min的流速下抽出。滤液被完全地从泵的可挠管中移除后,反转泵的流向,5 ml的洗涤缓冲液被以1 ml/min的流速通过膜压进柱。去除在柱中由此形成的上清液。在第二个步骤中,回复原始流向,5 ml的LIVE/DEAD BacLight(Invitrogen,Carlsbad,美国)被加入至柱,并以0.5 ml/min的流速通过蠕动泵被抽出。随后5 ml的生理盐水被加入柱,并以2 ml/min的流速通过蠕动泵被抽出。在最后的步骤中,膜被从柱移除,并被转移至显微镜载玻片上,并用一层生理盐水(其被盖玻片覆盖)覆盖。使用落射荧光显微镜(Axiostar
plus,具有光源HXP150C,滤光片14和38 HE,物镜A-Plan 10x/0.35;全部来自Zeiss MicroImaging GmbH,耶拿,德国)以及显微镜照相机(AxioCam
MRc5,Zeiss MicroImaging GmbH,耶拿,德国),1.4 mm x 20 mm and 20 mm x 1 mm的所述膜的两个横向排列的区域被分别检验。荧光标记的细菌被计数,并且使用不同的荧光颜色来分类。
6. 检验方法的比较。
在膜区段(=总面积的 1/12)上,对以下数目的有活性的细菌进行计数,并从中计算每ml样品的细菌数目。
孵育时间 | 4 小时 | 6小时 | 8小时 | 10小时 |
绿色荧光细胞的数目 | 5 | 119 | 1620 | > 10,000 |
每ml的细胞的计算数目 | 4 | 94 | 1300 | Y 7,900 |
通过接种来确定菌落形成单元的以下数目(cfu),从中计算每ml样品的细菌的数目。
菌落的数目 | 0 | 8 | 141 | 细胞菌苔 |
每ml的细胞的计算数目 | 0 | 80 | 1410 | — |
在上述方法之间找到很好的一致性,就四小时孵育之后尽快的Salmonella加载而言,膜方法产生阳性结果。
实施例
4
通过免疫荧光染色的PTFE膜上T淋巴细胞的检测。
1. 抗体的固定。
根据DE-A-10 2009 003374使用OH基团改性并且孔径为约40 µm 的FEP膜(TITK Rudolstadt,德国)被用作载体。所述膜是类似于实施例1.1制备的。替代其中使用的抗体,80 µg/ml的单克隆抗-CD3-IgG(eBioscience,圣地亚哥,美国)被固定化。
2. 过滤器组件的制备。
采用来自实施例1.2的过滤器组件。
3. 样品的应用、染色、光学评估、以及与参考方法的比较。
10 µl的肝素化毛细管血液被使用2 ml的PBS缓冲液(150 mM;pH =
7.4)稀释。在第一个步骤中,250 µl的样品被使用移液管吸取进Abicap柱。样品由于重力流过组件之后,洗涤缓冲液(0,1%
BSA和0.05% Tween 20溶于生理盐水)的每种750 µl被使用移液管吸取进Abicap柱三次,并加入500 µl的抗-CD3-藻红蛋白结合物(Cat No. 12-0039,eBioscience,圣地亚哥,美国)溶于 PBS封闭缓冲液(150 mM,pH = 7.4,酪蛋白(1 mg/ml))形成的0.5 µg/ml溶液。结合物溶液在约4分钟内流过所述组件后,进行使用750 µl的洗涤缓冲液的洗涤步骤三次。随后,移除Abicap柱和PTFE可挠管,并且所述膜被使用一层数µl的生理盐水覆盖。使用落射荧光显微镜(Axiostar plus,具有光源HXP150C,滤光片43 HE,物镜A-Plan 10x/0.35;全部来自Zeiss
MicroImaging GmbH,耶拿,德国)和显微镜照相机(AxioCam MRc5,Zeiss MicroImaging GmbH,耶拿,德国),对膜上的荧光标记细胞进行计数。发现了1800 ±200个细胞,其对应于1.4 x 106/ml的细胞计数。从相同的血液样本,使用临床流式细胞仪(Beckman-Coulter GmbH,克雷菲尔德,德国)确定的T淋巴细胞数目为1.62 x 106/ml。
实施例
5
在载体的整个深度的细胞检测。
如实施例1所述制备膜,而来自实施例1的实验是通过将10,000个细菌/ml的军团菌的悬浮液作为样品进行的。使用落射荧光显微镜(AxioVert star 200,光源为HBO100,滤光片为43 HE物镜为A-Plan 20x/0.45;显微镜照相机AxioCam
MRc5,Zeiss MicroImaging GmbH,耶拿, Germany),得到膜的代表性细节的20张荧光图像。在单个图像之间,膜被沿着光轴每次转移5 µm,因此制得通过膜的整个深度的聚焦堆栈。图4a示出了一张图像的细节,该图像的焦平面靠近膜的前表面。在图像处理程序(AxioVision,Zeiss MicroImaging GmbH,耶拿,德国)中,通过逐个像素地累加单个照片,制得具有归一化的对比范围的平均化图像。图4b示出了与图4a一致的该平均化图像的细节。比价两幅图像,可以看出,在单个图像中仅产生弱色雾的物体在平均化图像中也可以通过高清晰度识别。
Claims (16)
1. 一种用于从样品检测细胞的方法,包括以下步骤:
(a)将液相的样品或样品的部分以流动的方向施加至多孔的、大体为二维的载体,所述载体具有孔,所述孔在其表面具有至少一个特异于待检测的细胞或这些细胞的片段的结合分子;
(b)使待检测的细胞或这些细胞的片段能够从样品或样品部分进入所述多孔的、大体为二维的载体的孔中,所述孔的平均孔径使得待检测的细胞或片段能够进入孔中;
(c)通过至少一个特异于待检测的细胞或片段的结合分子留住待检测的细胞或片段;
(d)通过成像方法在所述大体为二维的载体上进行光学读出方法,可选地在待检测的细胞或细胞片段已经通过标记剂被标记之后进行;其中
(e)被用于读出方法的光学系统的光轴大体在样品或样品部分的流动的方向上延伸;并且
(f)细胞或细胞片段的检测是在所述多孔的、大体为二维的载体的表面上进行的。
2. 根据权利要求1所述的方法,其中在步骤(c)和(d)之间,并且在样品或样品的部分已经被施加并且待检测的细胞或细胞片段已经进入孔之后,所述样品载体被可选地洗涤。
3. 根据权利要求1或2所述的方法,其中在被施加至所述多孔的、大体为二维的载体之前或之后,所述样品被进行样品处理,以标记所述细胞或片段。
4. 根据权利要求1或3所述的方法,其中所述标记是通过使用染料的染色进行的。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述大体为二维的载体是多孔膜,特别是层厚度为0.05至1 mm的多孔膜。
6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述光学读出是通过显微镜法进行的。
7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述待检测的细胞或细胞片段是德国食品和饲料法相关的微生物。
8. 根据权利要求7所述的方法,其中所述微生物选自沙门氏菌、麦角菌、李斯特菌、大肠杆菌、大肠菌群细菌、弯曲杆菌、蜡样芽胞杆菌、亚硫酸还原梭状芽胞杆菌、凝固酶阳性葡萄球菌。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述特异于待检测的细胞或细胞片段的结合分子选自抗所述待检测的细胞或细胞片段的抗体、外源凝集素、噬菌体以及特定的结合因子。
10. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述载体由发泡的、烧结的或纤维的无机或有机材料组成。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述待检测的细胞通过活/死染色而变得可检测。
12. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述待检测的细胞或细胞片段通过由抗体和酶或染料或着色剂颗粒组成的结合物而变得可检测。
13. 根据权利要求11所述的方法,其中所述待检测的细胞通过酶促反应而变得可检测。
14. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述待检测的细胞或片段通过核酸探针而变得可检测。
15. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中读出所述多孔的、大体为二维的载体的所述方法是通过光度测定、化学发光、荧光测定进行的。
16. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中填充多孔的、大体为二维的载体的孔的介质的折射率np和多孔的、大体为二维的载体的折射率nt之间的差值nt-np小于0.05。
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