CN103547289A - 治疗阿尔茨海默氏病的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗阿尔茨海默氏病的方法和组合物。具体地，本发明涉及药物组合物，以及相关的治疗方法，其中该药物组合物包含适于给药以治疗阿尔茨海默氏病的EGFR抑制化合物。此外，本发明涉及筛选方法，其基于抑制EGFR活性的能力鉴别用于治疗阿尔茨海默氏病的化合物。

Description

治疗阿尔茨海默氏病的方法和组合物

相关申请的交叉参考

本申请要求享有于2011年1月26日提交的美国临时申请61／436,363的益处，其全部内容和公开在此引入作为参考。

发明领域

本发明涉及治疗阿尔茨海默氏病的方法和组合物。具体地，本发明涉及药物组合物，及相关的治疗方法，其中所述药物组合物包含适用于给药以治疗阿尔茨海默氏病的EGFR抑制性化合物。此外，本发明涉及筛选方法，其基于抑制EGFR活性的能力鉴别用于治疗阿尔茨海默氏病的化合物。

现有技术

已报道阿尔茨海默氏病(AD)的果蝇模型(Iijima et al.，PNAS101(17)：6623-6628，2004；Iijima et al.，PLoS ONE3(2)：e1703，2008)，其中分泌型Aβ42的泛神经表达导致了概括AD临床症状主要特征的表型，这些特征包括年龄依赖性记忆丧失、神经退行性病变和Aβ沉积物的蓄积。一项在果蝇AD模型中的突触可塑性后续研究显示Aβ42的表达影响长期抑郁(LTD)(Chiang etal.，FASEBJ.23：1969-1977，2009)。一项独立研究还暗示改变的PI3激酶活性导致Aβ42-诱导的LTD(Chiang et al.，PNAS107：7060-7065，2010)。

发明概述

在一方面中，本发明涉及通过向患者给予有效量的EGFR抑制剂治疗患者中阿尔茨海默氏病的方法。EGFR抑制剂可为多肽(如可溶型EGFR或抗-EGFR抗体)或小分子。用于本发明方法中适合的小分子EGFR抑制剂包括吉非替尼、厄洛替尼、EKB-569、CL-387,785、拉帕替尼、卡奈替尼(Canertinib)、HKI-272、BIBW2992、HKI-357、ZD-6474、AEE788、XL647、BMS-599626、IPI-504、17-AAG、JKF-006、JKF-011和JKF-027。

在另一方面中，本发明涉及药物组合物，其包含用于治疗阿尔茨海默氏病的有效量的EGFR抑制剂和可药用载体。

在再一方面中，本发明涉及鉴别用于治疗阿尔茨海默氏病的化合物的筛选试验。该试验包括分别在存在候选化合物时和不存在候选化合物时将在细胞表面表达人EGFR的细胞系的培养细胞暴露于Aβ42寡聚体，并比较存在候选化合物时和不存在候选化合物时暴露于Aβ42寡聚体的细胞中EGFR活化水平，其中EGFR活化水平的降低指示候选化合物治疗阿尔茨海默氏病的有效性。

附图简述

图1A-C.EGFR参与果蝇中Aβ42-诱导的瞬时记忆丧失的鉴定。(A)在5日龄的成年雌蝇中，未在表达Aβ42的雌蝇中观测到记忆效应，但观测到由于InR或EGFR的泛神经表达引起的轻微记忆缺陷(elav／+；UAS-InR^wt/+或elav／+；UAS-EGFR^wt／+)。N=10-13。所有数据，除非另外说明，均以平均值±标准误(means±s.e.m)表示，而对于t检验：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。(B)EGFR而不是InR对Aβ42-诱导的记忆丧失的协同作用(elav／+；UAS-Aβ42／+；UAS-EGFR^wt／+和elav／+；UAS-Aβ42／UAS-InR^wt)。N=14-29。(C)Aβ42-诱导的记忆丧失的复苏。顶部：本图和后续图中的给药范式与所示范式相同。下部：直方图表示药物喂食效果的瞬时记忆。药物浓度(μg／ml)如括号中所示，且对照组经蔗糖处理。Mem：美金刚(memantine)；Ge：吉非替尼；ER：厄洛替尼。每组8只。

图2A-B.EGFR抑制剂对果蝇记忆能力的毒性。(A)为指示食药果蝇，将红色食品着色剂溶解在药物溶液中。绿色箭头指向正在吃药的果蝇；红色箭头指向已完成吃药的果蝇(红色腹部)。(B)与经蔗糖处理的对照组果蝇(+／Y；UAS-Aβ42／+)相比，未发现两种使用的EGFR抑制剂有显著的记忆毒性。浓度(μg／ml)：吉非替尼(Ge)100和厄洛替尼(Er)40。N=8。

图3A-I.在Morris水迷宫(MWM)试验中在小鼠中经药理学抑制EGFR使Aβ42-诱导的记忆丧失被复苏。(A)向8月龄双转基因小鼠给药，各图中的药物剂量为mg／kg／天；(B-D)通过不同浓度的Ge处理后的记忆复苏效果。(E)在Mem处理后无记忆改善。B中N=6-8；C中N=6-7；D中N=12-16；E中N=6-8。(F)在各个记忆复苏效果中，Ge的剂量效应。从第7天至第9天的逃避等待时间(Escape latency)结果纳入计算。Ge在极低浓度时是有效的。(G)在第1天和第10天跟踪探索的代表性游泳轨迹。(H-I)如在不同的象限内度过的时间所指示的，在除去没水站台(submerged stand)的试验中记忆复苏也是明显的。对照组(WT)和药物处理的小鼠更多的时间在平台所位于的目标象限中度过(方差分析(ANOVA)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。T，目标；R，右侧；O，对侧；L，左侧。

图4.双转基因小鼠的海马中增加的磷酸化EGFR(phosphor-EGFR)水平及其通过Ge处理进行的抑制。在12月龄的小鼠海马中，与对照组相比，双转基因小鼠中相对p-EGFR水平显著增加。进食Ge10mg／kg／天，持续18天，抑制了上升的EGFR活化作用。顶部：代表性的蛋白印迹。下部：显示个体数据(水平线)和平均值(小方块)(后续图中的蛋白印迹以相同的方法表示)。N=4。

图5A-C.单体Aβ42抑制EGFR活性而寡聚体增强EGFR活性。(A)顶部：制备的Aβ42肽经10-20％N-三羟甲基甘氨酸凝胶(Tricine gels)分离并用6E10抗体免疫印迹。五角星表示单体而箭头表示寡聚体。下部：统计结果指示在不同的制剂中有不同丰度的单体和寡聚体。(B-C)COS-7细胞未经人EGFR^wt和Aβ42质粒转染。检测内源性的p-EGFR和EGFR水平。与25μg／ml单体或寡聚体Aβ42一起培养15分钟对EGFR活化诱导出相反的影响(右侧)，而总的EGFR水平未受影响(左侧)。N=3-4。在本图和后续图中，蛋白印迹结果以所示的个体数据(水平线)和平均值(小方块)表示。

图6A-C.在培养细胞中，寡聚体Aβ42使EGFR激活并与其共沉淀。(A)响应寡聚体Aβ42和EGF的添加，p-EGFR升高(右侧)，但总的EGFR未升高(左侧)。COS-7细胞经人EGFR^wt质粒转染48小时，然后与25μg／ml寡聚体Aβ42制剂一起培养15分钟。人EGF(0.5μg／ml)作为阳性对照。N=3。(B)分别通过EGFR抑制剂Ge和Er抑制Aβ42-诱导的和-EGF诱导的p-EGFR活化。(C)Aβ42与EGFR的共沉淀。COS-7细胞经Aβ42和人EGFR^wt质粒转染48小时，然后细胞裂解物与偶联兔抗-EGFR的蛋白G-琼脂糖珠一起培养以进行免疫沉淀。可看到Aβ42的单体(五角星)和二聚体(箭头)。

图7A-H.合成化合物的行为筛选。(A)筛选过程和结果概要的示意图。(B)果蝇中Aβ42-诱导的记忆丧失的预防。显示了四种代表性化合物的效果。浓度为：50μg／ml。N=6-8。(C)双转基因小鼠的给药流程。年龄一致的小鼠(6月龄)经两个月药物处理，然后进行MWM试验。(D-G)小鼠中Aβ-诱导的记忆丧失的复苏。显示了如B中所示的四种化合物。浓度(mg／kg／天)：JKF-006为58，JKF-011为14，JKF-027为55和JKF-01为40。N=6-9。(H)在经EGFR^wt质粒转染的COS-7细胞中，四种阳性化合物对寡聚体Aβ42-诱导的p-EGFR活性的增加的影响。除JKF-01外，其它三种化合物能够抑制诱导的p-EGFR活性。N=3。

图8.合成化合物和来自药用植物的化学物质不影响正常的p-EGFR的水平。100μg／ml JKF-006、JKF-011和JKF-027被用于治疗表达EGFR^wt而无寡聚体Aβ42肽的COS-7细胞。所有化合物未改变p-EGFR水平。N=3-4。

发明详述

本文已证实egfr基因与Aβ42的毒性在遗传学上相互作用。本文还证实两种EGFR抑制化合物，吉非替尼和厄洛替尼(其均被批准用于人类患者的癌症治疗)，可以复苏果蝇AD模型中Aβ42-诱导的年龄依赖性记忆丧失。而且，本文已证实Ge还可复苏小鼠AD模型中的记忆丧失。此外，本文已证实Aβ42增加了COS-7细胞中EGFR的磷酸化和活化，而且Aβ42分子与EGFR发生免疫沉淀。本文进一步证实合成化合物包括JKF-006、JKF-011和JKF-027是EGFR活化的有效抑制剂，且其在复苏小鼠和果蝇AD模型中的记忆丧失中是有效的。

因此，本发明提供用于治疗阿尔茨海默氏病的方法和组合物。因此，本发明提供筛选用于有效治疗阿尔茨海默氏病的化合物的方法。

药物组合物

在一方面中，本发明涉及用于治疗阿尔茨海默氏病的药物组合物。

如本文所用，本文的“治疗阿尔茨海默氏病”是指延迟该疾病的发作、减缓疾病的进展，和／或改善疾病的症状。

阿尔茨海默氏病是痴呆的最常见类型，而且其症状在临床上是公认的。早期症状包括不能获得新记忆(例如，难于回忆起近期事件)和不能获得新信息。随着疾病进展，学习和记忆的障碍变得更加显著，症状可包括语言障碍(包括说话困难和读写能力的丧失)、长期记忆丧失、运动协调丧失，及行为和神经精神症状，如意识错乱、易怒、具攻击性、情绪起伏不定(mood swings)和一般性脱瘾症状(general withdrawal)。晚期特征在于语言能力的丧失、肌肉质量和活动度的衰退，以及其他躯体机能的丧失。

“延迟”阿尔茨海默氏病的发作，是指本文提供的药物组合物和治疗方法能够推迟、妨碍或减慢该疾病的发生，从而使得在给定的时间框架内与未使用本文提供的组合物或方法相比，在一名患者中早期疾病症状显现的可能性或在多名患者中该疾病发生的可能性降低。

“减缓”阿尔茨海默氏病的进展，是指本文提供的药物组合物和治疗方法有效地抑制学习、记忆、或语言能力或其它躯体机能的进展性下降。

“改善”阿尔茨海默氏病的症状，是指本文提供的药物组合物和治疗方法减少疾病症状，和／或改善学习、记忆、或语言能力或其它躯体机能。

本文所用的术语“患者”指的是任何哺乳动物患者。在一项实施方案中，该患者为人类患者。

根据本发明，用于治疗阿尔茨海默氏病的药物组合物包含EGFR抑制剂。

如本文所用，“EGFR”抑制剂指的是抑制EGFR活性的分子。EGFR，也称为ErbB1或HER1，是ErbB家族受体的成员，该ErbB家族受体是细胞表面受体的受体酪氨酸激酶(RTK)超家族的亚家族，其中该细胞表面受体为响应细胞外生长因子的细胞信号转导的介质。EGFR通过与其配体(包括表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGFα))结合而被激活，这导致活性同二聚体和在一些情况中，异二聚体及ErbB受体家族另一成员的形成。二聚作用激活了内在的蛋白-酪氨酸激酶活性，导致了EGFR的胞浆域中若干酪氨酸残基的自磷酸化，其反过来通过其它具有磷酸酪氨酸结合的SH2域的蛋白质激活下游信号转导级联。

如本文所示，Aβ42，尤其是寡聚体形式的Aβ42，还触发EGFR的活化和磷酸化，而该活化被认为是由Aβ42直接结合EGFR引起的。

不同物种的EGF受体在结构和功能上是较为保守的。术语“EGFR”在属类上指任何动物物种的EGF受体。在特定实施方案中，该EGFR为哺乳动物EGFR，尤其是人EGFR。

EGFR的活性可在培养的细胞系中方便地测量，例如，基于与外源性添加的EGF或Aβ42结合的EGFR磷酸化的水平。适用的细胞系可为哺乳动物、昆虫或酵母细胞系等等，其外源性表达EGFR或经转染以表达有用的EGFR分子(例如人EGFR)。适合细胞系的实例包括S2、COS-7、SH-HY5Y、HEK-293、NIH3T3，和Hela等等。在一项特定实施方案中，经转染人EGFR基因的COS-7细胞系(其来自于猴类肾脏)用于测定EGFR的活性。

可检测一种或多种酪氨酸即Y992、Y1045、Y1068、Y1148和Y1173处EGFR的磷酸化，例如，在蛋白印迹中使用磷酸酪氨酸特异性抗体，而所检测的信号可使用本领域可采用的方法和软件来定量。在一些实施方案中，检测并定量Y1068处EGFR的磷酸化作为EGFR活化水平的测量。

特异性分子对EGFR活性的抑制可通过比较该分子存在下的EGFR活性和该分子不存在下的EGFR活性来测定，其中活性降低指示抑制。与该抑制剂不存在时相比，该抑制剂存在下当EGFR活性下降至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多时，抑制是显著的。

根据本发明，该抑制剂可为多肽，如可溶型EGFR(例如由EGFR胞外域或其EGF结合片段组成的多肽)，或针对EGFR胞外域的抗体，其包括多克隆抗体和单克隆抗体如人源化单克隆抗体。

抑制剂还可为小分子化合物。“小分子化合物”是指小分子有机化合物或其盐，通常具有分子量少于1500道尔顿，优选少于1000道尔顿，更优选少于800道尔顿。适用于本发明药物组合物的小分子EGFR抑制剂包括那些本领域已备案并开发用于治疗癌症的小分子EGFR抑制剂。而且，适用于本发明药物组合物的小分子EGFR抑制剂还包括通过本文公开的筛选试验确认或新鉴定为EGFR抑制剂的化合物。

在一些实施方案中，该小分子EGFR抑制剂选自吉非替尼(易瑞沙：N-(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺)、厄洛替尼(特罗凯；N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺)、EKB-569(4-(3-溴苯胺基)-6,7-二甲氧基-3-氰基喹啉)、CL-387,785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)、拉帕替尼(GW572016；Tykerb；N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[(2-甲基磺酰基乙基氨基)甲基]-2-呋喃基]喹唑啉-4-胺)、卡奈替尼(CI-1033；PD183805；N-[4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]喹唑啉-6-基]-2-丙烯酰胺二盐酸盐)、HKI-272(来那替尼，或(2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]氨基]-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺)、BIBW2992(阿法替尼，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)、HKI-357(惠氏，(E)-N-[4-[3-氯-4-[(3-氟苄基)氧基]苯胺基]-3-氰基7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)、ZD-6474(凡德他尼，N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺)、AEE788(诺华，(R)-6-(4-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)苯基)-N-(1-苯基乙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、XL647(Exelexis)、BMS-599626(百时美施贵宝，[4-[[1-(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基氨基]-5-甲基吡咯并[2，1-f][1，2，4]三嗪-6-基]氨基甲酸(3S)-3-吗啉基甲基酯)、IPI-504(Infinity Pharmaceuticals，17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素对苯二酚盐酸盐)、17-AAG(Kosan，17-(烯丙基氨基)-17-去甲-氧基格尔德霉素)、JKF-006(4-氯-3[5-[2-氰基3-[(4-氟苯基)氨基]-3-氧代-1-丙烯-1-基]-2-呋喃基苯甲酸])、JKF-011(哌嗪-2-酮)和JKF-027(2-氰基-N-[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]-3-[5-(4-吗啉基)-2-呋喃基]2-丙烯酰胺)，其可药用盐，或其组合。

在一项特定实施方案中，该小分子EGFR抑制剂为吉非替尼或厄洛替尼，或这两者的组合。

除EGFR抑制剂外，本发明的药物组合物可包括可药用载体。可药用载体包括溶剂、分散介质、等张剂等。任何传统介质、试剂、稀释剂或载体，除非对受者或对其中所包含的活性成分的治疗有效性有损害，其使用均为适宜的。载体可为液体、半固体(例如糊剂)，或固体载体。载体的实例包括油、水、油／水乳剂、盐水溶液、醇、糖、凝胶、脂质体、树脂、多孔基质、粘合剂、填充剂、包衣、防腐剂等，或其组合。

活性成分可与载体以任何方便并实用的方式(例如通过混合、溶解、混悬、乳化、胶囊化、吸收等)组合，且可通过传统制剂方法(见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.Gennaro，ed.，MackPublishing Co.，Easton，Pa.，1990；and Remington，The Science and Practice ofPharmacy20th Ed.Mack Publishing，2000)制成适用于注射、植入、吸入、摄食等的制剂如片剂、胶囊、粉剂、糖浆剂、混悬剂。

治疗方法

在另一方面中，本发明涉及通过给予上文所述的药物组合物治疗阿尔茨海默氏病的方法，其中该药物组合物包含治疗有效量的EGFR抑制剂。

术语“治疗有效量”是指在治疗阿尔茨海默氏病中达到如本文所定义的有益的结果(即向受者给药适宜的时间周期后，延迟疾病的发作、减缓疾病的进展或改善疾病的症状)所必需的量。

取决于活性成分的性质、受者的健康状况和病况，以及给药途径，药物组合物治疗有效的精确量可能改变，但其可由熟练的医生决定。本文已证实Ge有效复苏记忆丧失的浓度100倍至1000倍低于其用于治疗癌症的浓度。

例如，在一些实施方案中，本文所提供用于治疗阿尔茨海默氏病的方法包括向患者给予剂量范围为0.5至100mg／天／人的Ge，而在一些实施方案中，为1至50mg／天／人，例如1、5、10、15、20和25mg／天／人，或上面所列的任意两数值之间的量。

药物组合物可一天一次或多次、隔天或任何其它适宜的给药方案给药，且可通过任何适宜的途径(包括口服、肠道外(例如，静脉、腹膜内、皮内、皮下或肌内)、颅内、大脑内或椎管内途径)给药。

筛选试验

在再另一方面中，本发明提供鉴别适用于治疗阿尔茨海默氏病的化合物的筛选试验。该筛选试验的设计基于本文公开的独特认识：Aβ42通过直接结合激活EGFR，而后激活下游信号转导通路，其反过来负面影响突触可塑性并最终引起记忆丧失。因此，候选化合物，例如组合库(combinatorial library)中的化合物，由于其干扰Aβ42-介导的EGFR活化而被筛选。

本发明的筛选试验采用在培养中的细胞系，且测定在响应外源性添加的Aβ42的培养细胞中化合物对EGFR活化的影响。

适用于筛选试验的细胞系可为哺乳动物、昆虫或酵母细胞系等等，其外源性表达EGFR或经转染以表达有用的EGFR分子(例如人EGFR)。适合细胞系的实例包括S2、COS-7、SH-HY5Y、HEK-293、NIH3T3和Hela等等。在一项特定实施方案中，经转染人egfr基因的COS-7细胞系(其来自于猴类肾脏)用于试验。

可向细胞培养物中添加浓度范围为约0.5至约20μM的Aβ42寡聚体或富含Aβ42寡聚体的制剂，在一些实施方案中，为1至10μM，在特定实施方案中，为约5μM。合成和重组产生的Aβ42肽均可用于制造Aβ42寡聚体。

EGFR的活化可基于EGFR的磷酸化水平测定。例如，可检测一种或多种酪氨酸即Y992、Y1045、Y1068、Y1148和Y1173处EGFR的磷酸化，例如，在蛋白印迹中使用磷酸酪氨酸特异性抗体，而所检测的信号可使用本领域可采用的方法和软件来定量。在一些实施方案中，检测并定量Y1068处EGFR的磷酸化作为EGFR活化水平的测量。

因此，可鉴别降低Aβ42-诱导的EGFR活化的化合物。这样的化合物可在阿尔茨海默氏病地动物模型中进一步测试以确认其实用性和有效性。

实施例1.材料和方法

果蝇品系

之前已有文献描述本文所用的人野生型Aβ42转基因果蝇(UAS-Aβ42)(Iijima et al.，PLoS ONE3(2)：e1703，2008)。UAS-InR^wt和UAS-EGFR^wt由布鲁明顿果蝇品系中心(Bloomington Drosophila Stock Center)(印第安纳，美国)获得。elav^C155-Gal4为实验室品系。果蝇在室温(22-24℃)饲养并维持。用于巴甫洛夫嗅觉条件反射(Pavlovian olfactory conditioning)的所有品系均经5个与w¹¹¹⁸(isoCJ1)远交的世代而平衡。

巴甫洛夫嗅觉联合的瞬时记忆

训练和测试过程与之前所述相同(Tully and Quinn，J Comp PhysiolA157：263-277，1985)。在一个训练期，一组100只果蝇顺序地暴露于两种气味：3-辛醇(OCT，Fluka)或4-甲基环己醇(MCH，Fluka)60秒，两次暴露之间暴露于新鲜空气45秒。果蝇在暴露于第一种气味时经受足部电击(1.5秒脉冲，3.5秒间隔，60V)(CS+)而暴露于第二种气味时未经足部电击(CS-)。为测量“瞬时记忆”(也称为“学习”)，将果蝇在训练至T型迷宫的选择点后立即转移，并强迫其在两种气味之间选择2分钟。然后果蝇被困在T型迷宫的两臂中，将其麻醉并计数。由该组果蝇在T型迷宫中的分布计算行为指数(PI)。互反组的果蝇以OCT作为CS-和以MCH作为CS+来训练并测试。所谓的半-PI(OCT)和PI(MCH)最终被平均为n=1的情况，再乘以100。PI为0指示50：50的分布(无学习)，而PI为100指示“完美学习”即100％的果蝇逃避了之前伴随足部电击的CS+。各测试中对照组与实验组的年龄匹配。对果蝇的给药处理，将吉非替尼和厄洛替尼(LC Laboratories)溶解在二甲基亚砜(DMSO，Sigma)中并在-20℃保存。果蝇在空瓶中饥饿3小时，然后喂食稀释于4％蔗糖中的药物，持续另外4小时。果蝇在处理后转移至正常食物。在处理期内，喂药每天进行一次。使用20μg／ml美金刚(Sigma)作为阳性对照。

Aβ42寡聚体的制备

制备过程之前已有描述(Tully and Quinn，J Comp PhysiolA157：263-277，1985)。将合成和重组的野生型Aβ42(AnaSpec，Inc.)最初溶解在1mM六氟异丙醇(Sigma)中。在Speed Vac中真空下除去六氟异丙醇，而肽薄膜在-20℃保存。为进行寡聚体制备，该肽首先再悬浮在DMSO中至浓度为12.5mg／ml，然后用DMEM／F-12(无酚红，Invitrogen)稀释至终浓度为500μg／ml且在4℃培养24小时。通过蛋白印迹检测寡聚体。

细胞培养物、转染和寡聚体处理

在37℃5％CO₂下，在含有10％胎牛血清(Invitrogen)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(D-MEM)中培养COS-7细胞。人野生型Aβ42质粒为实验室品系。由Dr.Parsons提供人EGFR^wt和EGFR^K721A。转染依据Lipofectamine2000手册(Invitrogen)进行。48小时后，用新鲜培养基洗涤细胞一次并与10或25鹏／ml Aβ42寡聚体一起在37℃5％CO₂下培养15分钟。0.5μg／ml人EGF(Sigma)用作阳性对照。然后细胞用PBS洗涤3次并收集。

蛋白印迹分析

整个果蝇头部或细胞裂解物通过使用含有以下组分的RIPA缓冲液制得：0.3％SDS、50mM Tris-HCl、pH7.4、0.5％NP-40、1％脱氧胆酸钠、150mMNaCl、5mM EDTA、每50ml一片完全蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics)。将裂解物稀释在SDS样品缓冲液中并在10-20％Tris-Tricine凝胶(Invitrogen)上分离，然后转移至硝酸纤维素膜(Invitrogen)。将这些膜在PBS中煮沸3分钟，用5％脱脂干牛奶封闭并用第一抗体印迹。本文所用的第一抗体包括小鼠抗-Aβ42(6E10，Covance Research Products)、小鼠抗-dEGFR(Abcam)、兔抗-hEGFR(Cell S ignaling)、小鼠抗-hEGFR-p(CellSignaling)和兔抗-肌动蛋白(Sigma)。使用ImageJ软件(National Institutes ofHealth)分析数据。

免疫沉淀

蛋白G-琼脂糖(Roche Diagnostics)珠用PBS和RIPA缓冲液洗涤，然后与兔抗-hEGFR在4℃偶联4小时。然后将珠与细胞裂解物在4℃过夜培养。在经RIPA洗涤3次后除去细胞裂解物。将珠在100℃煮沸5分钟并依据标准蛋白印迹方案将其装载至10-20％Tris-Tricine凝胶上。

小鼠品系和基因分型

由Jackson实验室购得AD模型小鼠，该小鼠表达突变的嵌合小鼠／人APPswe和突变的人早老素1(Delta E9)，其均由朊蛋白启动子驱动[B6C3-Tg(APPswe.PSEN1dE9)85Dbo／J品系]。转基因小鼠来自于B6C3／Tg+×B6C3杂交。基因分型通过PCR依据Jackson实验室方案完成[Tg(APP)的引物：5’AATAGA GAA CGG CAG GAG CA3’和5’GCC ATG AGG GCA CTAATC AT3’；Tg(PSEN1)的引物：5’AGG ACT GAC CAC TCG ACC AG3’和5’CGG GGGTCT AGT TCT GCA T3’]。Tg+及其Tg-同窝鼠被随机分配到各组进行药物处理或空白对照。

Morris水迷宫

Morris水迷宫实验依据如此前所报道的过程(Jensen et al.，Neuroscience130：667-684，2005;Cohen et al.，Cell139：1157-1169，2009)进行。简而言之，将同窝出生的8月龄小鼠(体重为30-40g)放置于笼中，1只／笼，且在正常条件下饲养。将直径为120cm的水箱充满室温水(19-20℃)，用白色涂料使其不透明。将透明平台(Φ15em)放置在四个实分象限之一的中心处并将其浸没在水面下2cm从而使其不可见。在所有实验中提供远端暗示作为空间参考。让小鼠游泳直至其找到该平台并允许其停留5秒钟；如果小鼠未找到该平台，则轻轻的指导其至平台并给予5秒钟停留。给予未找到平台的动物60秒的等待时间。允许小鼠在各试验之间休息1小时。每天进行四个试验。在所有实验设置中，均利用视频跟踪系统(吉量软件科技有限公司，中国上海)。记录各试验中找到平台的等待时间(最多60秒)，将每日的四次试验结果平均，以便统计分析。对于药物处理，将吉非替尼溶解于0.5％吐温80的生理盐水中。从训练和测试前9天至实验结束，每天进行一次与体重匹配的药物灌胃，其中该药物稀释于生理盐水中。

统计分析

所有数据通过studentt检验或依据Bonferroni检验的单因素ANOVA(Origin8；OriginLab Corporation)分析。统计结果以平均值±标准误或个体数据(水平线)和平均数(小方块)表示。*表示关键值(*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001)。

实施例2.结果

通过抑制转基因果蝇和小鼠中的EGFR来减少Aβ42-诱导的早期记忆丧失

本发明进行实验以测定胰岛素受体(InR)和表皮生长因子受体(EGFR)介导的信号转导通路是否参与Aβ42-诱导的记忆丧失。首先，完成一项实验以分别测定在Aβ42转基因果蝇中正常InR和EGFR的泛神经过表达的效应。

通过公认的经典的厌恶条件反射(Tully and Quinn，J Comp Physiol A157：263-277，1985)检测不同基因型的5日龄雌性成年果蝇的学习分数，其中一种气味伴随足部电击。在5日龄转基因雌性果蝇中，Aβ42的表达无可检测的记忆丧失而过表达InR或EGFR(elav-Gal4／+；UAS-InR^wt/+或elav-Gal4／+；UAS-EGFR^wt／+)对记忆行为的影响非常小(图1A)。与之相反，共表达EGFR和Aβ42(elav-Gal4／+；UAS-Aβ42／+；UAS-EGFR^wt/+)对降低瞬时记忆产生协同作用，而共表达InR和Aβ42(elav-Gal4／+；UAS-Aβ42／UAS-InR^wt)得到的记忆分数与单独过表达InR相似(图1B)。这种遗传相互作用数据暗示，增加的EGFR而不是InR的活性，与引起Aβ42-诱导的记忆丧失有关。

为了验证该遗传学观察，我们测试了两种EGFR抑制剂(吉非替尼(Ge)和厄洛替尼(Er))的效应，其均用于临床癌症的治疗(Gschwind，et al.，Nat RevCancer4：361-370，2004)。两种药物通过与ATP结合位点结合抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，其中的ATP结合位点在果蝇和人类之间高度保守(Birnbaum and Ready,CurrTreat Options Oncol6：75-81，2005)。为了看到更强的记忆丧失表型，我们选择了3日龄雄性成年果蝇(elav-Gal4／Y；UAS-Aβ42／+)进行药物处理。在每天喂药4小时、连续喂7天后，于孵化后第10天测量记忆分数(Chiang，et al.，Proc NatlAcadSci USA107：7060-7065，2010)(图1C和图2A)。我们有趣地注意到美金刚这种临床可用于AD治疗的药物，能够预防表达Aβ42的果蝇中的记忆丧失(图1C)。以一定的浓度范围(0.01，0.1，1，10μg／ml；图1C)喂食任一种EGFR抑制剂也可预防10日龄表达Aβ42的雄性果蝇中的记忆丧失。在喂食更高浓度的Ge(100μg／ml)或Er(40μg／ml)的对照组果蝇中记忆未受影响(图2B)。行为数据暗示抑制EGFR预防了果蝇中Aβ42-诱导的记忆丧失。

为确定这类观察的普遍意义，我们测试了Ge在表达以下两种突变的AD-相关转基因的Tg(APPswe.PSEN1dE9)双转基因小鼠中的效果，所述Ge能穿透血脑屏障并在治疗脑肿瘤中有一些效果(Ceresoli et al.，Ann Oncol 15：1042-1047，2004；Heimberger et al.，Clin Cancer Res8：3496-3502，2002)，所述两种突变的AD-相关的转基因是：嵌合的人淀粉样β(A4)前体蛋白(APPswe)和人早老素1“DeltaE9”突变型(Jankowsky et al.，The Biomolecular Engineering17：157-165，2001)。据报道在早龄期可见广泛斑，且在约6-9月龄的双转基因小鼠中记忆-丧失表型是明显的(Jankowsky et al.，The BiomolecularEngineering17：157-165，2001；Reiserer,et al.，Genes Brain Behav6：54-65，2007；Savonenko et al.，Neurobiol Dis18：602-617，2005；Cohen et al.，Cell139：1157-1169，2009；Jankowsky et al.，J Neurosci25：5217-5224，2005)。Morris水迷宫用于行为试验，其中小鼠学习以找到隐藏的平台(Martinez-Coria et al.，Am JPathol176：870-880，2010)。尽管两个月(从6月龄至8月龄)的药物喂食产生阳性效果，但在训练前仅9天的药物处理(图3A)足以复苏8月龄小鼠的记忆丧失(图3)。相反，在如此短期的处理下，美金刚不能改善记忆丧失的表型(图3E)，尽管有报道在更长期的处理下，其为有效的(Martinez-Coria et al.，Am J Pathol176：870-880，2010；Scholtzova et al.，J Neurosci Res86：2784-2791，2008)。Ge在以浓度为0.01至10mg／kg／天给药时最有效(图3B-D，F)，其即使不是上千倍也是上百倍低于在小鼠中用于治疗肿瘤的浓度(Heimberger etal.，Clin Cancer Res8：3496-3502，2002；Wakeling et al.，Cancer Res62：5749-5754，2002)。这在代表性路径的作图(图3G)中和在象限占有时间(图3H-I)中也是一致的。

Aβ42寡聚体诱导的EGFR活化

为确定在Aβ-诱导的记忆丧失中所观测的EGFR的遗传和药理效应的分子机制，我们通过p-EGFR^Tyrl068位点的蛋白印迹检测海马区EGFR活化水平，该位点与Grb2结合导致MAPK的活化(Rojas，et al.，J BiolChem271：27456-27461，1996)。在双转基因小鼠的海马中p-EGFR水平显著增加(图4)。重要的是，在18天(记忆复苏所用的时间)的Ge处理(10mg／kg／天，图4)后，升高的p-EGFR水平恢复到类似于对照组的水平，这显示升高的EGFR活性与Aβ-诱导的记忆丧失具有良好的相关性。

为了证实EGFR活化是由表达的Aβ引起的，我们测量了培养的COS-7细胞中p-EGFR水平，所述COS-7细胞是来自猴肾的细胞系，具有低水平的Aβ42本底亲和力(Laurén et al.，Nature457：1128-1132，2009)，且经人野生型EGFR(EGFR^wt)转染。蛋白印迹表明，尽管在添加25μg／ml Aβ42寡聚体制剂后EGFR的表达水平未受影响(图5A)，p-EGFR或活化的EGFR的水平显著升高(图5B和图6A)。与之相反，经单体Aβ42制剂处理对EGFR活化具有相反的影响(图5C)。EGFR抑制剂，Er和Ge，抑制EGF-和Aβ42寡聚体-激活的EGFR(图6B)。

为了更深入的研究这类Aβ-诱导的EGFR活化，我们进行免疫沉淀以测定外源性产生的Aβ42是否能直接与EGFR结合。COS-7细胞经编码分泌型Aβ42的基因和人EGFR^wt共转染。检测细胞裂解物，48小时后与兔抗-EGFR免疫共沉淀。我们发现Aβ42单体和寡聚体(根据分子量很可能是二聚体)均与EGFR^wt一起被拉下(图6C)。

总的来说，这些数据支持以下论点：EGFR起Aβ肽的细胞膜受体的作用，而Aβ寡聚体-诱导的EGFR活化在记忆丧失中起关键作用。

通过行为鉴定的有效的合成化合物抑制了EGFR活化。

与上述机制指导的研究相平行，我们进行了2000种合成化合物(从TimTec LLC，USA购得)的行为筛选(图7A)，这些化合物具有假定靶向蛋白激酶活性的结构。药物喂食如图1C所示。仅选择雄性果蝇进行7天药物处理，然后在孵化后的第10天经受行为试验。历经最初的n=2筛选和随后的n>6确认，发现45种合成化合物在复苏Aβ42转基因果蝇的记忆丧失中是有效的。在它们之中，9种在双转基因小鼠中测试，且在2个月处理(6月龄至8月龄)后4种化合物表明有阳性结果(图7A-G)。我们惊奇的发现3种命名为JKF-006、JKF-011和JKF-027的化合物不仅在复苏记忆丧失中显示有效的结果，而且显著抑制10μg／ml Aβ42寡聚体诱导的COS-7细胞中表达的人EGFR的磷酸化(图7H)，但不能影响内源性p-EGFR水平(图8)。

如上所示，egfr基因而不是胰岛素受体基因，与Aβ42的毒性在遗传学上相互作用。而且，显示吉非替尼(Ge)和厄洛替尼(Er)均在果蝇AD模型中复苏Aβ42-诱导的年龄依赖性记忆丧失。此外，Ge还在表达AD相关的APP基因突变体及AD相关的早老素基因突变体的小鼠AD模型中复苏记忆丧失。还显示，Aβ42增加培养的COS-7细胞中EGFR的磷酸化和活化，以及Aβ42分子与EGFR发生免疫沉淀。

总的来说，这些数据指示，Aβ42过表达导致EGFR的异常活化，其反过来激活下游通路，如PI3激酶-介导的信号转导通路，然后再影响突触可塑性并最终引起记忆丧失。抑制这种Aβ42-诱导的EGFR的直接活化复苏了果蝇和基于Aβ的AD小鼠模型中的记忆丧失。如上所示，EGFR抑制剂(Ge和Er)不影响正常动物中的学习，但复苏AD动物中的记忆丧失。值得注意的是，在AD小鼠喂食Ge仅7天后观察到复苏效应，这暗示该药物对于在引起记忆丧失方面介导Aβ42急性毒性的机理起作用。与之相反，在该研究中，目前市售用于治疗AD的药物美金刚在18天处理后无效果。而且Ge复苏记忆丧失的有效浓度100倍至1000倍低于其用于治疗癌症的浓度。因此，可以预期使用有效剂量的Ge治疗AD会有最小的副作用。

Claims (20)

1.治疗患者阿尔茨海默氏病的方法，其包括向所述患者给予有效量的EGFR抑制剂。

2.权利要求1的方法，其中所述EGFR抑制剂为多肽或小分子。

3.权利要求2的方法，其中所述EGFR抑制剂为选自可溶型EGFR或抗-EGFR抗体的多肽。

4.权利要求2的方法，其中所述EGFR抑制剂为小分子。

5.权利要求4的方法，其中所述小分子选自：吉非替尼、厄洛替尼、EKB-569、CL-387,785、拉帕替尼、卡奈替尼、HKI-272、BIBW2992、HKI-357、ZD-6474、AEE788、XL647、BMS-599626、IPI-504、17-AGG、JKF-006、JKF-011和JKF-027。

6.权利要求4的方法，其中所述EGFR抑制剂为吉非替尼或厄洛替尼。

7.权利要求6的方法，其中所述EGFR抑制剂为吉非替尼且以1至100mg／kg／天／人的剂量向患者给药。

8.权利要求1的方法，其中所述EGFR抑制剂经口服或胃肠道外途径向患者给药。

9.药物组合物，其包含用于治疗阿尔茨海默氏病的治疗有效量的EGFR抑制剂和可药用载体。

10.权利要求9的药物组合物，其中所述EGFR抑制剂为小分子。

11.权利要求10的药物组合物，其中所述小分子选自：吉非替尼、厄洛替尼、EKB-569、CL-387,785、拉帕替尼、卡奈替尼、HKI-272、BIBW2992、HKI-357、ZD-6474、AEE788、XL647、BMS-599626、IPI-504、17-AGG、JKF-006、JKF-011和JKF-027。

12.权利要求11的药物组合物，其中所述EGFR抑制剂为吉非替尼或厄洛替尼。

13.权利要求12的组合物，其中在组合物中所述EGFR的量为1至100mg／天。

14.鉴别用于治疗阿尔茨海默氏病的化合物的筛选试验，其包括：提供在细胞表面上表达人EGFR的细胞系，分别在存在候选化合物时和不存在候选化合物时将所述细胞系的培养细胞暴露于Aβ42寡聚体，并比较存在候选化合物时和不存在候选化合物时暴露于Aβ42寡聚体的细胞中EGFR活化水平，其中EGFR活化水平降低指示所述候选化合物治疗阿尔茨海默氏病的有效性。

15.权利要求14的试验，其中所述细胞系为被编码人EGFR的核酸分子转染的COS-7细胞系。

16.权利要求14的试验，其中所述EGFR活化水平是基于EGFR磷酸化水平测定的。

17.权利要求16的试验，其中所述EGFR磷酸化水平是通过蛋白印迹使用磷酸酪氨酸的特异性抗体检测的。

18.权利要求17的试验，其中所述磷酸酪氨酸为Y1068。

19.权利要求14的试验，其中所述候选化合物为小分子化合物。

20.权利要求19的试验，其中所述小分子化合物为组合库中的化合物。

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