CN103536902A - Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白(rLj-112)可阻止真菌细胞膜麦角固醇的合成,从而破坏了真菌细胞的完整性,使真菌细胞膜破坏、膜通透性增高、细胞内容物质释放、细胞破裂溶解,从而杀死真菌,即能够剂量依赖性的抑制真菌而对细菌无抑制作用,发明了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白(r Lj-112)的新用途,尤其是一种Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。
背景技术
自发现第一个抗真菌抗生素灰黄霉素以来,抗真菌药物领域已取得了长足的进展。现有抗真菌药物根据作用机制可分为:①作用于真菌细胞膜,干扰真菌细胞膜麦角固醇的合成(如唑类、丙烯胺类和吗啉类)以及损害细胞膜脂质结构及其功能的药物(如多烯类);②影响真菌细胞壁合成的药物(如卡泊芬净);③干扰真菌核酸合成的药物(如5-氟胞嘧啶,灰黄霉素);④作用机制尚未明确的药物(如碘化钾等)。但是,现有药物由于存在着疗效、安全性、耐药性等问题而远远不能满足需要。
Lj-RGD3为来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白,由118个氨基酸残基组成,Lj-RGD3的一级结构除具有三个RGD 模体和一对半胱氨酸这一典型的RGD毒素蛋白特征外,还含有17个组氨酸,17个精氨酸,是一类HRG的碱性蛋白。中国专利申请号为201110094370.2、名称为“类HRG的七鳃鳗Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112在抗肿瘤药物中的应用”的发明专利,公开了Lj-RGD3的三个RGD模体全缺失突变体Lj-112基因。Lj-112基因人工合成序列324bp长,其蛋白质由108个氨基酸组成,其中含有17个组氨酸残基,组氨酸所占比例为15.7%,Lj-112蛋白分子量为1.2KDa。Lj-112基因可克隆于载体,获得Lj-112重组蛋白(r Lj-112)并可在大肠杆菌等进行了高效诱导表达等。Lj-112重组蛋白(r Lj-112)具有抑制血管新生、抗肿瘤功能。但是,迄今为止并没有关于Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。
发明内容
本发明是发现了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白具有抑制真菌的作用,从而发明了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白
在制备抗真菌药物中的应用。
本发明的技术解决方案是一种Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白(rLj-112)在制备抗真菌药物中的应用。
本发明发现了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白(rLj-112)可阻止真菌细胞膜麦角固醇的合成,从而破坏了真菌细胞的完整性,使真菌细胞膜破坏、膜通透性增高、细胞内容物质释放、细胞破裂溶解,从而杀死真菌,即能够剂量依赖性的抑制真菌而对细菌无抑制作用,发明了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。
附图说明
图1是rLj-112的最小杀菌浓度(MBC)及抑制率测试结果图。
图2牛津杯法检测rLj-112的抑菌活性的效果图。
图3 白色念珠菌经rLj-112处理后的扫描电镜图。
具体实施方式
可按现有技术方法获得本发明发现了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白(rLj-112)。
实验:
1.最小杀菌浓度(MBC)及抑菌率的测定
(1)菌液制备:将甘油保菌复苏,30℃孵育过夜(18-24h),用牛肉膏蛋白胨液体培养基校正菌液浓度至1-2×108CFU/ml;所述菌为白色念珠菌,AS2.2086,产品货号:BZW23170,供应商:南京康恩特有限公司。
(2)蛋白的制备:用牛肉膏蛋白胨培养基将蛋白(rLj-112)2倍依次稀释,1~8管蛋白浓度依次为90.4、45.2、22.6、11.3、5.6、2.8、1.4、0.7、0.35μM;然后在每管内加入等量上述菌液,使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第8管蛋白浓度分别为45.2、22.6、11.3、5.6、2.8、1.4、0.7、0.35、0.175μM。
(3)阳性对照酮康唑的制备:用甲醇将酮康唑10倍依次稀释,1~5管药物浓度为94、9.4、0.94、0.094、0.0094μM。然后在每管内加入等量上述菌液,使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第5管药物浓度分别为47、4.7、0.47、0.047、0.0047μM。
(4)孵育:将接种好的稀释管放入30℃培养箱中孵育16-24h。
(5)酶标仪检测:与阳性对照管比较能够抑制99%以上活菌生长管药物浓度为受试菌MBC;存活百分率(%)= OD (抗菌药+菌夜)—OD(抗菌药+液体培养基) / OD(水+菌夜)—OD(水+液体培养基)X100。
结果如图1所示:横坐标为受试蛋白或对照药浓度,单位为μM;纵坐标为真菌存活百分率(%)。A,阳性对照,酮康唑 ;B,rLj-112。结果表明rLj-112的MBC值为7.7μM,阳性对照酮康唑(ketoconazole)的MBC值为15μM。
2. 用牛津杯法检测rLj-112的抑菌活性
具体操作方法如下:
(1)指示菌培养基:牛肉膏蛋白胨培养基,用0.1MPa压力灭菌20 min;固体培养基中加入2.0%的琼脂;
(2)指示菌菌悬液:白色念珠菌(出处同上)接种于牛肉膏蛋白胨培养基中,30℃摇床培养24h;
(3)检测平板的制备,牛肉膏蛋白胨固体培养基用0.1MPa压力灭菌20 min,5冷却至60℃左右,取一定量倒入已灭菌的培养皿中,使其凝固,待用;
(4)涂布:取0.2~0.5ml,106CFU/ml白念珠菌均匀涂布在培养皿中,涂布后以平板无可见水滴为准;
(5)加待测蛋白:用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中,将待测的蛋白rLj-112加入牛津杯中(牛津杯最大容量200ul);
(6)4℃扩散:将平皿放置到4℃冰箱中扩散数小时,使待测蛋白均匀扩散到培养基中;
(7)培养:将平皿放置到30℃培养箱中培养16~024h,拍照。
所拍照片如图2所示:A,阳性对照,酮康唑 ;B,rLj-112(30μl);C,rLj-112(60μl); D,rLj-112(90μl);E,rLj-112(120μl); F,rLj-112(150μl); G,rLj-112(180μl); H,阴性对照,Tris。结果表明:随着rLj-112剂量的增加,牛津杯抑菌环增大,即rLj-112剂量依赖性的抑制白念珠菌的生长。
3.rLj-112处理后白色念珠菌的扫描电镜观察
(1)菌液制备:将甘油保菌(白色念珠菌,出处同上)复苏,30℃孵育过夜(18-24h),用牛肉膏蛋白胨液体培养基校正浓度至1~2×108CFU/ml;
(2)孵育:将rLj-112(2.6μM)与上述菌1:1孵育16-24h;
(3)固定:用PBS(pH7.2)冲洗3次,用体积分数3%戊二醛室温下固定 2-4 h;
(4)逐级脱水:PBS(pH6.8)冲洗 2-3 次,每次间隔 20 min,后经系列乙醇(体积分数为 30%、50%、70%、80%、90%、100%)脱水,每次20 min, 其中100%乙醇脱水2次;
(5)干燥、黏样、镀膜后,在扫描电镜下观察。
电镜图如图3所示:A,PBS对照;B,rLj-112。用PBS处理的对照组,白念珠菌细胞形态完整,细胞膜表面光滑;而 rLj-112处理过的白念珠菌显示出了明显的细胞膜破裂,细胞内容物外渗现象。
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1.一种Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。
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