CN107875372A - 重组肽rLj‑112在制备协同肝素抗凝药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种重组肽rLj‑112在制备协同肝素抗凝药物中的应用。本发明发现了重组肽rLj‑112具有与肝素特异性结合的特点，作为协同肝素抗凝药物，可有效强效延长肝素的凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）及活化部分凝血活酶时间（APTT），即rLj‑112起到了促进肝素抗凝的作用，同时重组肽rLj‑112不会导致出血等不良反应，可应用于制备肝素的协同抗凝药物。

Description

重组肽rLj-112在制备协同肝素抗凝药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种重组肽rLj-112的用途，尤其是一种重组肽rLj-112在制备协同肝素抗凝药物中的应用。
背景技术
富组氨酸糖蛋白（HRG）在血液中能够与纤溶酶原、纤维蛋白原及凝血酶敏感蛋白结合，通过替代纤维凝块中的纤维蛋白与凝血酶的结合而具有抗血栓功能。富组氨酸糖蛋白与凝血酶的结合与Zn2+浓度相关，并且这种结合是具有高度特异性的，如HRG与凝血因子XIIa具有高亲和性，并能够延长活化部分凝血活酶时间（APTT），但是对凝血因子XII、XI和XIa并不具有结合能力，说明HRG对内在凝血途径的调节也是具有特异性的，并且Zn2+能够促进这种调节作用[1]。HRG与纤维蛋白原（Fbg）的相互作用具有二价阳离子依赖性，但是在乙二胺四乙酸（EDTA）存在时能够解除二者的结合。人类HRG的富组氨酸区361-389蛋白水解片段能够与固定的纤维蛋白原结合，证明富组氨酸区负责HRG与纤维蛋白原的结合[2]。通过对结合位点的分析，发现HRG的富组氨酸区通过Zn2+介导其与Fbg1、Fbg2的结合，并且与Fbg2的酸性区域有更高的亲和性[3]。有报道称在人类中发现了家族性HRG先天性缺陷，这种先天性缺陷使半胱氨酸酶抑制剂样结构域中一个甘氨酸替代谷氨酸，导致HRG降低至正常水平的20%，而这种缺陷更容易发生血栓疾病，所以HRG缺陷与血栓形成相关[4]。某些疾病状态也会改变HRG水平，在败血症、心脏病和肝硬化等疾病的患者中测量的HRG水平，患者血浆中HRG的浓度降低，而急性心肌梗塞的患者血浆中HRG的浓度则升高[5]。在子痫前期的女性，可以检测到胎盘中HRG水平降低和纤维蛋白原水平提高，与怀孕期间的血管生成有关[6]。HRG缺陷的小鼠在稳定期没有严重的异常，并可以进行繁殖，同时HRG-/-小鼠的止血参数也没有任何重大缺陷。研究认为小鼠中HRG的靶向缺失可能导致抗凝血酶活性的提高、纤维蛋白原含量的提高和血小板凝血异常，缩短出血时间，雌性小鼠表现更为显著。HRG缺陷小鼠的外周血中的血小板数目减少，说明血小板的活化增强[7]。这些研究成果证明了HRG的抗凝作用。
由于肝素具有带强负电荷的理化特性，能干扰血凝过程的许多环节，在体内外都有抗凝血作用。其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）结合而增强AT-Ⅲ对活化的凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ的抑制作用，最后导致血小板凝集的抑制作用、阻止凝血激活酶的形成、阻止凝血酶原变为凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白［1］。
肝素是需要迅速达到抗凝作用的首选药物，可用于外科预防血栓形成以及妊娠者的抗凝治疗，对于急性心肌梗死患者，可用肝素预防病人发生静脉栓栓塞病，并可预防大块的前壁透壁性心肌梗死病人发生动脉栓塞等。肝素的另一重要临床应用是在心脏、手术和肾脏透析时维持血液体外循环畅通。肝素也用于治疗各种原因引起的弥散性血管内凝血（DIC）等。
重组肽rLj-112是以rLj-RGD3为原型进行RGD缺失突变获得的基因重组肽，富含有17个组氨酸，不含有其野生型母本的RGD模体，其在一级结构上与马来线虫富含组氨酸糖蛋白（Histidine-rich glycoprotein，HRG）有约40%同源性，与人HRG的富含组氨酸/脯氨酸结构域（His/Pro-rich domain）有约30%同源性。目前已证实其具有HRG蛋白所特有的抗真菌及抗肿瘤活性，并已获中国发明专利（ZL201310487361.9，ZL201110094370.2.）。但是，迄今为止并没有关于重组肽rLj-112在制备协同肝素抗凝药物中应用的相关报道。
参考文献：
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发明内容
本发明是发现了重组肽rLj-112能通过与肝素的特异性结合而行使强效促进肝素的抗凝作用，从而发明了重组肽rLj-112在制备协同肝素抗凝药物中的应用。
本发明的技术解决方案是重组肽rLj-112在制备协同肝素抗凝药物中的应用。
本发明发现了重组肽rLj-112具有与肝素特异性结合的特点，作为协同肝素抗凝药物，可有效强效延长肝素的凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）及活化部分凝血活酶时间（APTT），即rLj-112起到了促进肝素抗凝的作用，同时重组肽 rLj-112不会导致出血等不良反应，可应用于制备肝素的协同抗凝药物。
附图说明
图1：由固相肝素亲和层析得到的rLj-112蛋白的SDS-PAGE图。
图2：重组肽rLj-112促进肝素对凝血酶时间（TT）的延长效果图。
图3：重组肽rLj-112促进肝素对凝血酶原时间（PT）的延长效果图。
图4：重组肽rLj-112促进肝素对活化部分凝血活酶时间（APTT）的延长效果图。
具体实施方式
1. 重组肽rLj-112与固相肝素的结合实验：采用固相肝素结合测定法来测定重组肽rLj-112与肝素的特异性结合。肝素固相结合柱选用GE公司的肝素预装柱，通过AKTA纯化系统对诱导表达的经破碎离心的上清液进行纯化，纯化的蛋白进行SDS-PAGE。具体步骤如下：
（1）将肝素亲和柱连接到已经用20％乙醇冲洗好的AKTA纯化仪器，用10倍柱体积的蒸馏水对柱子进行充分的润洗，润洗的过程中随时监测整个系统的UV值，是系统的UV只保持在稳定的水平上，初始值为0。
（2）用10倍柱体积的 Binding buffer（20mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 7.4）
来平衡柱子，使柱子处于稳定的状态，要求UV基线值为0；将提取的重组肽rLj-112上清液进样，用15倍柱体积的Binding buffer平衡柱子。
（3）用Elution buffer（20 mM Tris-HCl, 2.0 M NaCl, pH7.4）洗脱目的蛋白。对系统进行检测，当UV基线重新为0的时候说明蛋白已经完全洗脱干净，可停止收集。对收集的蛋白进行SDS-PAGE检测及N端测序。结果如图1所示。图1中，M：蛋白Marker；1: 洗脱峰收集管，经鉴定为rLj-112蛋白；2：流穿峰收集管，经鉴定无蛋白成分。结果显示rLj-112能够结合在固相肝素层析柱上，并通过高浓度盐溶液将rLj-112从固相肝素层析柱上洗脱下来，且流穿液无目的蛋白，说明重组肽rLj-112可与肝素特异性结合。
2. 重组肽rLj-112对肝素的抗凝血作用的影响
应用血凝仪测定与各蛋白温育后的肝素对血凝时间参数凝血酶时间（thrombin time，TT），凝血酶原时间（prothrombin time，PT）和活化部分的凝血活酶时间（activatedpartial thromboplastin time，APTT）：
（1）将SD大鼠麻醉后，于腹主动脉取血，9:1加入3.8%枸橼酸钠抗凝；
（2）3000转/分钟，离心10分钟，收集上清得到血浆；
（3）重组肽rLj-112蛋白、肝素与血浆37℃孵育；
（4）按试剂盒操作方法测定TT/PT/APTT时间，测定时如果时间超过120
秒或者不凝，按照120秒计；
（5）整理数据，绘制成表。
2.1重组肽rLj-112促进肝素的血浆中凝血酶时间（TT）延长。TT实验是通过加入标准量的凝血酶溶液，记录血浆凝固所需要的时间，主要与血浆中纤维蛋白原的减少和抗凝物质加入有关。结果如图2所示：与NS组相比，单独加入rLj-112对TT时间无影响；单独加入肝素时延长TT时间，延长率为11.5 %；同时加入rLj-112和肝素时，促进肝素对TT时间的延长，加入量为1.0、2.0、3.0 μmol/L，对TT的延长百分比为19.5 %、31.0%和41.4%，作用效果呈剂量依赖性。
2.2 重组肽rLj-112促进肝素的血浆凝血酶原时间（PT）延长。PT实验是在血浆中加入凝血活酶和钙离子后，测定血浆凝固凝固所需时间。结果如图3所示：与NS组相比，单独加入rLj-112对PT时间无影响；单独加入肝素时能够延长PT时间，延长率为19.1%；同时加入rLj-112和肝素时，促进肝素对PT时间的延长，加入量为1.0、2.0、3.0 μmol/L，对PT的延长百分比为27.9%、36.8%和47.8%，作用效果随rLj-112浓度的增加而增大。
2.3 重组肽rLj-112促进肝素的活化部分凝血活酶时间（APTT）延长。 APTT是用激活剂及凝血因子Ⅺ、Ⅻ，用部分凝血活酶取代血小板第三因子（PF3），测定钙离子Ca2+后血浆凝固凝固所需时间。APTT的检测内源性凝血检测中常用的检测方法。APPT检测的结果如图4所示：与NS组相比，单独加入rLj-112对APTT时间无影响；单独加入肝素时能够延长APTT时间，延长率为16.1%；同时加入rLj-112和肝素时，促进肝素对APTT时间的延长，加入量为1.0、2.0、3.0 μmol/L，对APTT的延长百分比为25.4%、41.9和56.9%，作用效果随rLj-112浓度的增加而增大。

Claims (1)

1.一种重组肽rLj-112在制备协同肝素抗凝药物中的应用。
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