CN103536277A - 自动化的超弱光成像系统及操作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种自动化生物超弱光子信号成像系统，包括成像子系统、实验操作子系统和自动控制子系统，用暗箱和遮光罩进行双重避光、用单镜片进行成像、用机械快门对光子成像器件进行保护，共同组成高信噪比、低衰减的光路系统，并由电动滤光镜转盘实现分波段成像；用多通道时程控制器控制系统各活动部件，用PC机对时程控制器进行编程并实时控制，整合多通道局部加药部件、多通道生物组织灌流部件、智能光刺激部件到超弱光成像系统中。本系统具有灵敏度和信噪比高、操作性和拓展性好、功能丰富等优点，可广泛应用于生命科学研究（特别是神经科学）、医学临床检查、农业生产、食品安全与环境保护等领域中的生物超弱光子信号检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用生物超弱光子辐射信号（又称生物光子信号），对生物（个体、组织、细胞和分子等）进行生物光子检测，实现生物光子信号成像，属于生物和生物医学技术成像领域。
背景技术
几乎所有的生命体，包括微生物、植物、动物以及人类在生理或病理条件下都会辐射出极其微弱的光子流，这种现象被称为生物超弱发光（Ultra-weak photon emissions，UPEs），又被称为生物光子（Biophotons）。生物光子包括诱发光和自发光，诱发光是指生物组织的光致发光现象，即生物组织受到外部光激发后，长时间发出光子的现象；自发光是生命体在没有外界光刺激的情况下自发释放出超弱光子流的现象。要特别强调的是：这里所描述的生物超弱发光与通常所指的医学光子和分子荧光等是不同的概念并赋予不同的科学含义。
研究发现不管是在细胞水平还是在有机体整体水平，生物光子与有机体的生理、病理状态都密切相关，能很敏感地反映出有机体的生理状态，甚至可能介导细胞间的通讯、参与脑功能实现。正因为生物光子活动可以很灵敏地反映有机体的生理状态，使其在神经科学中的信息传递与处理研究、医学上的临床诊断、农业生产中的选种与质量控制以及食品安全监控与环境污染检测等领域具有了一定的理论研究和应用价值。
但生物光子强度极其微弱，检测其时空分布对探测技术提出了较高的要求。20世纪70-80年代，超弱光探测技术由原先一维计数的真空光电倍增管模式跨越到二维成像的光子成像模式。自此，不断涌现出各种具有较高探测灵敏度的新型光子成像器件，理论上甚至可以探测单光子信号，如像增强CCD（ICCD）、雪崩光电二极管（APD）及由其集成的阵列（APD Arrays）和电子倍增CCD（EMCCD）等等。这些设备的出现，使得对生物光子等超弱光进行成像成为可能。
虽然光子成像器件在生物超弱光子信号成像系统中起核心作用，但要顺利完成成像、深入研究生物光子现象，或利用生物光子信号进行某种应用鉴别，除了光子成像器件，还需要一套完整的成像实验系统。
发明内容
本发明为实现对生物超弱光子信号进行成像，并以此进行某种应用鉴别，基于当前灵敏度最好的光子成像器件，本发明提供一种自动化的超弱生物光子信号成像系统。该系统具有灵敏度和信噪比高、操作性和拓展性好、功能丰富等优点，可广泛应用于生命科学研究、医学临床检查、农业生产、食品安全与环境保护等领域中的生物光子检测。
本发明的技术方案：该自动化的超弱光成像系统，共包括三部分：成像子系统、实验操作子系统和自动控制子系统。
成像子系统用于超弱生物光子信号成像，包括一由暗箱1和遮光罩2组成的双重避光部件，所述的暗箱1是由外层钢板内层铅板组成的立方体或长方体，用于隔绝外界光线和宇宙射线，使成像过程免受外界光的影响，所述的遮光罩2连接于镜头和样品台间，用于屏蔽暗箱1内的光致发光对成像的影响；一单镜片高透光镜头，用于成像；一机械快门13，用于非成像时对光子成像器件进行隔光保护，所述部件的开关受外部控制；一电动滤光镜转盘12，用于对生物超弱光子信号的光谱进行检测，所述部件的动作受外部控制；一光子成像器件11及其控制器14，用于检测超弱光信号，所述部件可以为当前常用的光子成像器件，比如雪崩光电二极管APD阵列、电子倍增CCD（EMCCD）、像增强CCD、电子轰击EBCCD、多阳极微通道阵列器件MAMA等等，其开关受外部控制；一低温冷却液循环泵17，用于对光子成像器件进行辅助制冷；一样品台；用于放置和定位待成像样品；一定制支架，用于各部件的安装支架及成像的调焦操作。
实验操作子系统用于特定的实验操作以实现特定的实验或应用目的，包括一多通道灌流系统6，由通道切换器3、蠕动泵4、储液瓶5、硅胶软管等部件组成，用于维持成像过程中生物组织的活性或稳定性，所述的灌流系统6可以实现不同灌流液间的自动切换，受外部控制；一多通道局部加药系统7，由多通道微量加药系统、两个定制的加药和吸药针头、蠕动泵等部件组成，用于对样品表面进行局部加药处理，所述的局部加药系统7可以实现不同药物间的自动切换，受外部控制；所述智能光刺激器8及其控制器18用于光诱发或刺激机体、组织、细胞和分子而导致的超弱生物光子活动或传递，其部件的开关受外部控制；所述智能光刺激器的光源是普通光源、LED灯光源或激光光源；刺激光通过不同的光传递器件或材料进行传导。
自动控制子系统用于对整个系统的活动部件进行外部控制，以实现成像实验过程的自动化，包括一多通道时程控制器9，用于对其他活动部件进行外部控制，所述部件可以受计算机编程，可以实时控制并可与其他子系统进行通信、；计算机10，用于对时程控制器进行编程，并对所获光子图像进行软件处理。
如上所述的自动化的超弱光成像系统，本成像系统的具体操作步骤如下：
（1）实验准备及成像系统预热：包括稳定室温，对光子成像器件进行制冷，并在正式成像前按成像时的设置启动光子成像器件的拍摄程序，对其进行预热，以稳定其背景基线。
（2）准备待检测样品：样品准备好后，将其放入样品台并调整好位置，使之处于光子成像器件的视野中间。
（3）拍定位照：在正常光照条件下拍摄样本（如大小鼠脑片）的定位照，以便用于后面的数据分析。
（4）开始正式成像：放下遮光罩，关闭暗箱，在电脑上设置时程控制器，控制系统各活动部件在成像过程中按实验设计定时开关，完成相关动作，使实验过程自动进行。设置完成后，开始实验。
（5）图像处理和数据分析：实验数据收集结束后，关闭并整理成像系统；并用图像处理分析软件和相关程序对图像和数据进行分析，得到成像图像和相关数据结果。这里所指的图像处理分析软件和相关程序是指结合使用光子成像器件的常规软件系统和相应常规软件系统共同完成。
本发明由于采取以上技术方案，使其具有以下优点：
（1）高灵敏度：当以滨松C9100-13型EMCCD为光子成像器件，并配合我们自己开发的相关图像处理程序，使系统灵敏度水平达到101photons/frame，足以研究生物超弱发光现象，包括生物自发光和生物诱发光。
（2）具有很好的信噪比：由于机械快门和遮光罩的作用，该套系统可以避免暗箱打开时外界光照对光子成像器件及其他物体所造成的光致发光对成像结果的影响，极大的提高了所获图像的信噪比。
（3）具有很好的操作性：由于计算机对时程控制器进行编程，进而控制整个成像实验系统，使成像实验过程自动化。
（4）具有灵活广泛的应用范围，可广泛应用于生命科学研究、医学临床检查、农业生产、食品安全与环境保护等领域中的超弱生物光子检测。
（5）具有很好的拓展和升级潜力：在该系统中，各子部件相对独立，根据具体的应用情况可进行灵活的改进、升级和拓展。
附图说明
图1为本发明的结构示意图；
图2为本发明实施例的处理结果图。
附图标记：1-暗箱；2-遮光罩；3-通道切换器；4-储液瓶；5-蠕动泵；6-灌流系统；7-局部加药系统；8-智能光刺激器；9-时程控制器；10-计算机；11-光子成像器件；12-电动滤光镜转盘；13-机械快门；14-光子成像器件控制器；15-灌流液；16-废液；17-低温冷却循环泵；18-智能光刺激器控制器。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的具体内容、操作流程和实际性能。但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，本领域技术人员可以对本发明作各种改进、升级和拓展等，这些等价形式同样在本申请所列权利要求书限定范围之内。
相关研究提示，中枢神经系统中可能存在有生物光子活动并具有信号传递的功能。基于此，本发明人利用本发明所述的自动化的超弱生物光子信号成像系统，如图1所示，以EMCCD（滨松C1900-13）为光子成像器件，检测和研究了谷氨酸诱发小鼠脑片生物光子活动的时空过程和影响。
实施例：谷氨酸诱发小鼠脑片生物光子活动的时空过程
一、实验材料：
所用动物为成年昆明小鼠（30±5克，2-3月龄），购自湖北省疾病预防控制中心的实验动物研究中心。所有的动物实验均通过中南民族大学动物管理委员会认可。
二、实验步骤
1.实验准备及成像系统预热：首先是开启空调，保持实验时的室温为24-25℃；其次是清洗并启动脑片灌流系统；第三是配制所需浓度的谷氨酸溶液，并对实验中所用的生理盐水、人工脑脊液（ACSF）和谷氨酸溶液进行冰水浴和充氧；第四是开启EMCCD和低温冷却液循环泵，对EMCCD进行制冷降温，并按实验时的设置启动EMCCD的拍摄程序，对EMCCD进行预热，以稳定其背景基线。
2.制备小鼠脑片：小鼠断头处死后，将小鼠头部放入冰水浴的生理盐水中一分钟。之后迅速取出脑组织，在冰水浴的生理盐水中用震荡切片机切取小鼠脑片。然后将脑片放入暗箱中的灌流槽内，并调整好位置，使之处于EMCCD视野中间，同时撤去冰水浴，使其逐渐恢复到室温。
3.拍定位照：在正常光照条件下拍摄脑片的定位照，以便用于后面的数据分析。
4.开始实验成像：放下遮光罩，关闭暗箱，在电脑上设置时程控制器，使成像实验系统在第11分钟时开启灌流系统的加热功能，将灌流槽中的液体温度加热到31-32℃并保持稳定；在第31分钟时，灌流液由常规ACSF切换为含50mM谷氨酸的ACSF对脑片进行灌流；在第331分钟时，灌流液由含50mM谷氨酸的ACSF切换为常规ACSF对脑片进行灌流；在第431分钟时，灌流液又由常规ACSF切换为含50mM谷氨酸的ACSF，对脑片进行第二次谷氨酸灌流；在实验的第531分钟时结束成像。设置完成后，开始实验。
5.实验数据收集结束后，关闭并整理成像系统；并用配套的图像处理分析软件和我们自己开发的相关程序对图像和数据进行分析，得到成像图像和相关数据结果，如图2所示，具体过程如下：
（1）将EMCCD所获得的原始图像数据输出为TIF格式的序列图像数据。
（2）在Matlab7.0中，导入序列图像数据，用编写的程序对序列图像进行处理，得到校正后的序列灰度图像和光子计数图像。并依据数据分析所需，对所得图像进行叠加、剪裁等进一步的处理。
（3）在处理所得的序列图像中，利用实验前所拍的脑片定位照来提取目标区域的平均灰度值和光子计数值（Biophoton number）。将加药前30分钟目标区灰度均值的均值（n=30）作为基线，各图像目标区的灰度均值减去这个基线值，得到一次实验的信号相对灰度均值（Relative grayvalue）。
（4）使用Microsoft Excel计算每组各次实验目标区相对灰度均值和光子计数值的均值并作相应的曲线图。
三、实验结果
结果显示，在谷氨酸处理之前，小鼠脑片的生物光子辐射很弱，EMCCD几乎检测不到。但在50mM谷氨酸处理之后，小鼠脑片的生物光子辐射逐渐增加，在启动90分钟（91.5±7.9，n=5）后达到最大值并进入维持阶段（>200分钟）。而在谷氨酸处理300分钟后用不含谷氨酸的ACSF进行洗脱时，脑片的光子辐射迅速增加，在约13分钟（12.6±1.8，n=5）内到达一个峰值后又逐渐衰减。当100分钟后对脑片再次实施50mM谷氨酸处理时，脑片的光子辐射又会在4分钟内（3.5±0.2，n=5）迅速地增加，且它的峰值显著地高于洗脱时的峰值，随后脑片光子辐射迅速衰减。在洗脱和再给药的时间内（200分钟），脑片的光子辐射水平始终都明显高于之前的维持阶段的水平。
此外，从结果图片中可看出，脑片生物光子辐射存在一定的区域差异，皮层灰质、海马、丘脑等部位光子辐射较强，而白质部光子辐射较弱。
这些结果表明，谷氨酸能诱导小鼠脑片生物光子活动的增加，且在达到最大辐射强度后能维持相当长时间，并具有显著增加生物光子活动强度的洗脱和再给药效应，此外，不同脑区的生物光子活动存在着一定的差异。
以上所述，仅是用以说明本发明的具体实施案例而已，并非用以限定本发明的可实施范围，举凡本领域熟练技术人员在未脱离本发明所指示的精神与原理下所完成的一切等效改进、升级和拓展等，仍应由本发明权利要求的范围所覆盖。
Claims (10)
1.一种自动化生物超弱光成像系统，其特征在于包括：成像子系统、实验操作子系统和自动控制子系统；其中，
所述成像子系统包括一由暗箱（1）和遮光罩（2）组成的双重避光部件、一单镜片高透光镜头、一机械快门（13）、一电动滤光镜转盘（12）、一光子成像器件（11）及其控制器（14）、一低温冷却液循环泵（17）、一样品台和一定制支架，所述遮光罩（2）连接于镜头和样品台之间；
所述实验操作子系统包括一多通道灌流系统（6）、一多通道局部加药系统（7）、一智能光刺激器（8）及其控制器（18）；
所述自动控制子系统包括一多通道时程控制器（9）和一计算机（10）。
2.如权利要求1所述的自动化生物超弱光成像系统，其特征在于：所述成像子系统用于超弱生物光子信号成像，其中，
所述暗箱（1）是由外层钢板内层铅板组成的立方体或长方体，用于隔绝外界光线和宇宙射线，使成像过程免受外界光的影响；
所述遮光罩（2）用于屏蔽暗箱（1）内的光致发光对成像的影响；
所述单镜片高透光镜头用于成像；所述机械快门（13）用于非成像时对光子成像器件进行隔光保护，其部件的开关受外部控制；
所述电动滤光镜转盘（12）用于对生物超弱光子信号的光谱进行检测，其部件的动作受外部控制；
所述光子成像器件（11）及其控制器（14）用于检测生物超弱光信号，其开关受外部控制；
所述低温冷却液循环泵（17）用于对光子成像器件进行辅助制冷；
所述样品台用于放置和定位待成像样品；
所述定制支架，用于各部件的安装及成像的调焦操作。
3.如权利要求2所述的自动化生物超弱光成像系统，其特征在于：所述光子成像器件（11）为雪崩光电二极管APD阵列、电子倍增CCD、像增强CCD、电子轰击EBCCD、多阳极微通道阵列器件MAMA中的一种。
4.如权利要求1所述的自动化生物超弱光成像系统，其特征在于：所述实验操作子系统用于特定的实验操作以实现特定的实验或应用目的，其中，
所述灌流系统（6），由通道切换器（3）、蠕动泵（4）、储液瓶（5）和硅胶软管组成，用于维持成像过程中生物组织的活性或稳定性，实现不同灌流液间的自动切换，受外部控制；
所述局部加药系统（7），由多通道微量加药系统、两个定制的加药和吸药针头和蠕动泵组成，用于对样品表面进行局部加药处理，实现不同药物间的自动切换，受外部控制；
所述智能光刺激器（8）及其控制器（18）用于光诱发或刺激机体、组织、细胞和分子而导致的超弱生物光子活动或传递，其部件的开关受外部控制；所述智能光刺激器的光源是普通光源、LED灯光源或激光光源；刺激光通过不同的光传递器件或材料进行传导。
5.如权利要求1所述的自动化生物超弱光成像系统，其特征在于：所述自动控制子系统用于对整个系统的活动部件进行外部控制，以实现成像实验过程的自动化，其中，
所述时程控制器（9）用于对其他活动部件进行外部控制，所述部件可以实时控制并可与其他子系统进行通信；
所述计算机（10），用于对时程控制器进行编程，并对所获光子图像进行软件处理。
6.一种如权利要求1-5所述的自动化生物超弱光成像系统的操作方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤一、实验准备及成像系统预热；
步骤二、准备待检测样品；
步骤三、拍定位照；
步骤四、开始正式成像；
步骤五、图像处理和数据分析。
7.如权利要求6所述的自动化生物超弱光成像系统的操作方法，其特征在于：所述步骤一具体包括稳定室温，对光子成像器件进行制冷，并在正式成像前按成像时的设置启动光子成像器件的拍摄程序，对其进行预热，以稳定其背景基线。
8.如权利要求6所述的自动化生物超弱光成像系统的操作方法，其特征在于：所述步骤二中样品准备好后，将其放入样品台并调整好位置，使之处于光子成像器件的视野中间；所述步骤三在正常光照条件下拍摄样本的定位照，以便用于后面的数据分析。
9.如权利要求6所述的自动化生物超弱光成像系统的操作方法，其特征在于：所述步骤四放下遮光罩，关闭暗箱，在电脑上设置时程控制器，控制系统各活动部件在成像过程中按实验设计定时开关，完成相关动作，使实验过程自动进行。设置完成后，开始实验。
10.如权利要求6所述的自动化生物超弱光成像系统的操作方法，其特征在于：所述步骤五中实验数据收集结束后，关闭并整理成像系统；并对图像和数据进行分析，得到成像图像和相关数据结果。
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