CN108414476A - 一种通过超弱生物光子成像系统检测肉类新鲜度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过超弱生物光子成像系统检测肉类新鲜度的方法，包括以下步骤：B1、材料的预处理；B2、实验准备及成像系统预热；B3、开始试验；B4、定位拍照；B5、实验成像；B6、序列图像处理及数据分析；B7、对其他肉本检测。本发明肉在随存放时间的变化，而呈现的特征性的生物光子辐射的改变可用于快速、定性地判定检测肉的新鲜度，即新鲜肉、次新鲜肉和变质肉，本发明提供的方法具有操作简便、快速等特点，可广泛应用于生命科学研究、食品安全与环境保护等领域中。

Description

一种通过超弱生物光子成像系统检测肉类新鲜度的方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测和生物医学技术成像领域，也可应用到其它领域需要检测超弱生物发光的领域，具体涉及一种通过超弱生物光子成像系统检测肉类新鲜度的方法。

背景技术

生物超弱发光，简称生物光子是存在于生物体中的一种很常见的征象，又称超弱光子辐射(uitraweakphoton emission,UPE)，是生物体的自然表现，其辐射强度非常小，光谱范围通常约在200nm～800nm之间，但是偶尔会到红外波段。UPE广泛存在于植物、动物以及单细胞生物中，其反应了生物体的本原以及生命活动过程有关的信息。生物光子的来源主要是生物组织的代谢活动，如氧化代谢和还原代谢。生物体内代谢活动能产生生物光子的物质有酚类、醛类、脂肪酸、过氧化氢、花生四烯酸等。

肉类腐败是一个复杂的生理生化过程，其中伴随着物质能量的变化，其间生物超弱发光也将会随着肉类新鲜度的改变而发生变化。食品新鲜度检测常用的是理化检验的方法，它的指标通常有挥发性盐基氮、过氧化氢酶、pH值和球蛋白沉淀反应等，但是目前国家标准检验肉类新鲜度的方法只有检测挥发性盐基氮的方法，该方法能检测出不同新鲜程度的肉，区别鲜肉、次鲜肉和变质肉，并和感官检验相符，但其检测设备复杂，操作繁琐耗时，需要用到蒸馏和滴定装置，实验周期比较长，滴定终点颜色变化不容易判断，在实验操作过程中还发现对牛肉的新鲜度变化并不敏感的情况，需要操作熟练的技术人员才能得到比较可靠的判定结果，并且仪器清洗比较困难，很难在现场进行快速检测。

有鉴于此，急需提供一种通过超弱生物光子成像系统，简便、快速、准确地对肉类新鲜度检测进行探究，寻找肉类新鲜度变化与生物超弱发光之间的关系，准确的确定肉类新鲜度的检测方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种通过超弱生物光子成像系统检测肉类新鲜度的方法，包括以下步骤：

B1、材料的预处理；B2、实验准备及成像系统预热；B3、开始试验；

B4、定位拍照；B5、实验成像；B6、序列图像处理及数据分析；B7、对其他肉样本检测。

在上述方法中，所述步骤B1包括以下步骤：

从4℃冰箱中取出一份新鲜牛肉，用电子天平准确称取0.2000g牛肉，并用剪刀将其剪碎后放在玻璃研磨器中；

向玻璃研磨器中加400μL 1×PBS缓冲液，并将其放在冰上研磨5分钟后制得第一匀浆放在4℃冰箱中备用；

同上步骤，称取同样的牛肉再制备第二匀浆、第三匀浆、第四匀浆和第五匀浆，将第二匀浆、第三匀浆、第四匀浆和第五匀浆分别在4℃冰箱中放置3天、5天、7天和11天。

在上述方法中，所述步骤B2具体包括以下步骤：

稳定室温，保持实验时的室温为24-25℃，启动冷却液循环泵对光子成像器件进行制冷，使EMCCD稳定在-92℃左右的状态下工作，开启HCImage成像控制软件，并在正式成像前按成像时的设置启动光子成像器件的拍摄程序，对其进行预热，以稳定其背景基线。

在上述方法中，所述步骤B3具体包括以下：

取第一匀浆200μL加样到小皿中，使得匀浆液全部在EMCCD的镜头视野里，将小皿放在ONIX微流控培养板中，开启温控装置使小皿中待测样品温度保持在在37±0.5℃不变。

在上述方法中，所述步骤B4包括以下步骤：

将牛肉样本放在EMCCD的镜头正下方，将EMCCD的增益调至最低，设置每帧曝光时间为1s，在较暗光线下调节视野和焦距，在图像达到清晰时完成定位照的拍摄并将定位照保存到工作目录下。

在上述方法中，所述步骤B5包括：

取下镜头上的遮光罩，关闭暗箱，调整EMCCD处于最大增益模式下，光子模式为3，曝光时间为60s，设置总拍摄时间为60min后开始拍摄成像，并形成序列图像；

在上述方法中，所述步骤B6包括以下步骤：

采用EMCCD配套的图像处理分析软件Simple PCI 6.0和Madlab 7.0对图像进行处理，首先将EMCCD获得的序列图像转换为TIF格式，再将其导入Madlab 7.0中，使用实验室编制的程序对图像进行处理，消除宇宙射线导致的亮斑；然后将Madlab 7.0处理后的序列图像进行样本信息提取，使用图像处理分析软件Simple PCI 6.0标定样本所在的图像位置，系统将自动提取样本所在位置的平均灰度值，同时也提取非样本区域的平均灰度值作为图像的平均背景灰度值；再通过样本灰度值减去背景灰度值，即得到区域的相对灰度值。

在上述方法中，所述步骤B7包括：

根据步骤B3～B6，分别对第二匀浆、第三匀浆、第四匀浆和第五匀浆进行检测分析，分别获得第二匀浆、第三匀浆、第四匀浆和第五匀浆的区域的相对灰度值。

本发明肉在随存放时间的变化，而呈现的特征性的生物光子辐射的改变可用于快速、定性地判定检测肉的新鲜度，即新鲜肉、次新鲜肉和变质肉，本发明提供的方法具有操作简便、快速等特点，可广泛应用于生命科学研究、食品安全与环境保护等领域中。

附图说明

图1为本发明提供的超弱生物光子成像系统检测牛肉新鲜度的流程图；

图2为本发明中放置3天后的牛肉样本生物光子成像示意图，其中，

(a)为定位照图，(b)为30分钟成像的叠加图；

图3为本发明提供的通过超弱生物光子检测方法检测5个不同的牛肉样本的相对灰度值的变化趋势图；

图4为本发明提供的挥发性盐基氮法检测牛肉新鲜度的流程图；

图5为本发明提供的牛肉中挥发性盐基氮含量随时间的变化趋势图；

图6为本发明提供的超弱生物光子成像法和挥发性盐基氮法检测牛肉新鲜度的结果相关性图。

具体实施方式

肉类作为有机物，其自身不断向外辐射极其微弱的生物光子信号，肉类的新鲜度不同，其代谢产生的生物光子强度也不同，因此，超弱生物光子检测可以为贮藏后肉类新鲜度检测提供一种新思路。我们以4℃贮存的牛肉为例，通过检测牛肉辐射的生物光子强度来定性判断牛肉的新鲜度，并通过具有国家标准的挥发性盐基氮法作为食物新鲜度检测参照标准来评估这一技术的可行性。

下面结合具体实施方式和说明书附图对本发明做出详细的说明。

如图1-6所示，本发明提供了一种通过超弱生物光子成像系统检测牛肉新鲜度的方法；其中，成像器件为当前常用的电子倍增CCD(EMCCD)；具体可参见专利CN103536277A。

如图1所示，下面通过具体实施例来说明本方法。

实施例：牛肉新鲜度的超弱生物光子检测

一、实验材料：

牛肉(成年黄牛，购买于武汉市洪山区新竹路的冷鲜肉批发市场)

二、实验步骤

S1、材料的预处理，包括以下步骤：

S11、从4℃冰箱中取出一份新鲜牛肉，用电子天平准确称取0.2000g牛肉，并用剪刀将其剪碎后放在玻璃研磨器中；

S12、向玻璃研磨器中加400μL 1×PBS缓冲液，并将其放在冰上研磨5分钟后制得第一匀浆放在4℃冰箱中备用；

S13、同上步骤，称取同样的牛肉再制备第二匀浆、第三匀浆、第四匀浆和第五匀浆，将第二匀浆、第三匀浆、第四匀浆和第五匀浆分别在4℃冰箱中放置3天、5天、7天和11天，以便通过超弱生物光子检测法对5个不同的牛肉样本进行11天的分段检测。

S2、实验准备及成像系统预热：包括

S21、稳定室温，保持实验时的室温为24-25℃，启动冷却液循环泵对光子成像器件进行制冷，使EMCCD稳定在-92℃左右的状态下工作，开启HCImage成像控制软件，并在正式成像前按成像时的设置启动光子成像器件的拍摄程序，对其进行预热，以稳定其背景基线。

S3、开始试验：取第一匀浆200μL加样到自制的设有温控装置的小皿中，使得匀浆液全部在EMCCD的镜头视野里，将小皿放在经过改造的细胞工作站ONIX微流控培养板中，开启温控装置使小皿中待测样品温度保持在在37±0.5℃不变；温控装置具体可为设于小皿底面用于加热小皿中溶液的加热金属板，加热金属板通过控制器自动控制。

S4、定位拍照：将步骤S3的牛肉样本放在EMCCD的镜头正下方，将EMCCD的增益调至最低，设置每帧曝光时间为1s，在较暗光线下调节视野和焦距，在图像达到清晰时完成定位照的拍摄并将定位照保存到工作目录下。

S5、实验成像：取下镜头上的遮光罩，关闭暗箱，调整EMCCD处于最大增益模式下，光子模式为3，曝光时间为60s，设置总拍摄时间为60min后开始拍摄成像，并形成序列图像；

S6、序列图像处理及数据分析：采用EMCCD配套的图像处理分析软件Simple PCI6.0和Madlab 7.0对图像进行处理，首先将EMCCD获得的序列图像转换为TIF格式，再将其导入Madlab 7.0中，使用实验室编制的程序对图像进行处理，消除宇宙射线导致的亮斑(因为其灰度值非常高，对图像分析有重要影响)。然后将Madlab 7.0处理后的序列图像进行样本信息提取，使用图像处理分析软件Simple PCI 6.0标定样本所在的图像位置(感兴趣区域)，系统将自动提取样本所在位置的平均灰度值(Average grey values,AGVs)，同时也提取非样本区域的平均灰度值作为图像的平均背景灰度值(Background grey values，BGVs)。最终通过样本灰度值减去背景灰度值，即得到区域的相对灰度值(Relative greyvalues,RGVs)，做进一步的统计学分析。

S7、对其他牛肉样本检测：根据步骤S3～S6，分别对第二匀浆、第三匀浆、第四匀浆和第五匀浆进行检测分析，分别获得第二匀浆、第三匀浆、第四匀浆和第五匀浆的区域的相对灰度值(Relative grey values,RGVs)；并如图3所示，为通过超弱生物光子检测方法对5个不同的牛肉样本进行11天的分段检测后的相对灰度值随时间的变化趋势图。

参照对比实验：挥发性盐基氮法检测牛肉新鲜度

本参照对比实验采用半微量凯氏定氮法来测定牛肉样本中的挥发性盐基氮(TVB-N)的含量，如图4所示，具体步骤如下：

A1、材料的预处理，包括以下步骤：

A11、从4℃冰箱中取出另一份同样的新鲜牛肉，去除脂肪、骨、及腱；

A12、用电子天平准确称取10g并用剪刀将其剪碎后放入250ml的锥形瓶中，向锥形瓶中注100ml超纯水，浸渍30min，其间间断地摇晃；

A13、进行过滤获得第一滤液，并将第一滤液置4℃冰箱中待用；

A14、再通过上述步骤，称取同样的牛肉再制备第二滤液、第三滤液、第四滤液和第五滤液，第二滤液、第三滤液、第四滤液和第五滤液分别在4℃冰箱中放置3天、5天、7天和11天后，以便通过半微量凯氏定氮法来测定5个不同的牛肉样本中的挥发性盐基氮的含量。

A2、预热：将半微量凯氏定氮器组装好，并打开电炉调至功率1000瓦后对装置进行预热10分钟；

A3、开始试验：取一个50mL锥形瓶，先向锥形瓶中加入10mL硼酸吸收液，再加入5-6滴混合指示液，再将锥形瓶置于冷凝管正下方并将冷凝管下端插入锥形瓶液面下；

A4、蒸馏：精确吸取5mL第一滤液(待检样本)滴入蒸馏器反应室中，然后滴入5mL氧化镁混悬液，立即盖紧塞子，同时向塞子和瓶口接触处滴水来避免发生漏气，向反应室中通入蒸汽，进行蒸馏，待第一滴蒸馏液滴入接收瓶开始计时5min，获取吸收液；

A5、滴定：取0.01moL/L的盐酸标准液对吸收液进行滴定，变色终点为蓝紫色，并且做空白试验。

A6、计算：

式中：X表示待检样本中挥发性盐基氮的含量(m/100g)；X的值为重复试验三次后取算术平均值的三位有效数。

V1表示吸收液消耗盐酸或硫酸标准液的体积(mL)；

V2表示空白消耗盐酸或硫酸标准液的体积(mL)；

C1表示盐酸或硫酸标准液的实际浓度(mol/L)；

m₁表示样品质量(g)；

14表示1.00mL盐酸标准滴定溶液[C(HCl)＝1.00mol/L]相当的氮的质量。

A7、对其他牛肉样本滤液检测：根据步骤A2～A6，分别对第二滤液、第三滤液、第四滤液和第五滤液进行检测分析，分别获得第二滤液、第三滤液、第四滤液和第五滤液的挥发性盐基氮(TVB-N)的含量；并如图5所示，为通过挥发性盐基氮法对5个不同的牛肉样本进行11天的分段检测后的TVB-N的含量随时间的变化趋势图。

三、检测结果：

如图6所示，通过采用生物光子检测法和挥发性盐基氮法分别对4℃下5个不同的牛肉样本进行11天的分段检测，做出了牛肉生物光子辐射(相对灰度值)随时间变化的关系曲线和挥发性盐基氮含量随时间变化的关系曲线，并以挥发性盐基氮法检测出的牛肉新鲜度作为参照标准得出以下结论：

(1)当牛肉处于新鲜肉阶段时，可以结合感官检测判断出肉精确的新鲜度，比如放置2天或者放置5天的肉；当肉处于次新鲜阶段以及变质阶段时则根据其相对灰度值得出其比较精确的新鲜度信息。

(2)在4℃存放的牛肉，其相对灰度值在280到360之间为新鲜肉；相对灰度值在260到280之间为次新鲜肉；相对灰度值小于260为变质肉。

本发明提供了一种通过超弱生物光子成像系统检测牛肉新鲜度的方法，具有以下特点：

(1)当牛肉处于次新鲜阶段以及变质阶段时则可直接根据本发明的超弱生物光子成像技术，根据牛肉辐射的相对灰度值得出其比较精确的新鲜度信息。

(2)本方法操作快速、经济和简便，一个小时内就可快速判定肉质新鲜度，并且无材料消耗、无污染；

(3)扩展性好：该系统中，各器件相互独立，更换方便，选择多样，稍加扩展可用于生命科学研究、食品安全等相关领域。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下作出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种通过超弱生物光子成像系统检测肉类新鲜度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

B1、材料的预处理；B2、实验准备及成像系统预热；B3、开始试验；B4、定位拍照；B5、实验成像；B6、序列图像处理及数据分析；B7、对其他肉样本检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B1包括以下步骤：

从4℃冰箱中取出一份新鲜牛肉，用电子天平准确称取0.2000g牛肉，并用剪刀将其剪碎后放在玻璃研磨器中；

向玻璃研磨器中加400μL 1×PBS缓冲液，并将其放在冰上研磨5分钟后制得第一匀浆放在4℃冰箱中备用；

同上步骤，称取同样的牛肉再制备第二匀浆、第三匀浆、第四匀浆和第五匀浆，将第二匀浆、第三匀浆、第四匀浆和第五匀浆分别在4℃冰箱中放置3天、5天、7天和11天。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B2具体包括以下步骤：

稳定室温，保持实验时的室温为24-25℃，启动冷却液循环泵对光子成像器件进行制冷，使EMCCD稳定在-92℃左右的状态下工作，开启HCImage成像控制软件，并在正式成像前按成像时的设置启动光子成像器件的拍摄程序，对其进行预热，以稳定其背景基线。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤B3具体包括以下：

取第一匀浆200μL加样到小皿中，使得匀浆液全部在EMCCD的镜头视野里，将小皿放在ONIX微流控培养板中，开启温控装置使小皿中待测样品温度保持在在37±0.5℃不变。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤B4包括以下步骤：

将牛肉样本放在EMCCD的镜头正下方，将EMCCD的增益调至最低，设置每帧曝光时间为1s，在较暗光线下调节视野和焦距，在图像达到清晰时完成定位照的拍摄并将定位照保存到工作目录下。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤B5包括：

取下镜头上的遮光罩，关闭暗箱，调整EMCCD处于最大增益模式下，光子模式为3，曝光时间为60s，设置总拍摄时间为60min后开始拍摄成像，并形成序列图像。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B6包括以下步骤：

采用EMCCD配套的图像处理分析软件Simple PCI 6.0和Madlab 7.0对图像进行处理，首先将EMCCD获得的序列图像转换为TIF格式，再将其导入Madlab 7.0中，使用实验室编制的程序对图像进行处理，消除宇宙射线导致的亮斑；然后将Madlab 7.0处理后的序列图像进行样本信息提取，使用图像处理分析软件Simple PCI 6.0标定样本所在的图像位置，系统将自动提取样本所在位置的平均灰度值，同时也提取非样本区域的平均灰度值作为图像的平均背景灰度值；再通过样本灰度值减去背景灰度值，即得到区域的相对灰度值。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤B7包括：

根据步骤B3～B6，分别对第二匀浆、第三匀浆、第四匀浆和第五匀浆进行检测分析，分别获得第二匀浆、第三匀浆、第四匀浆和第五匀浆的区域的相对灰度值。