CN103525929A - 快速检测空肠弯曲菌gyrA基因突变位点的引物组及其应用 - Google Patents

快速检测空肠弯曲菌gyrA基因突变位点的引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测空肠弯曲菌gyrA基因突变位点的引物组及其应用。本发明提供的引物组，由特异引物对和测序引物组成；特异引物对由序列1所示单链DNA分子甲和序列2所示单链DNA分子乙组成；所述测序引物为序列3所示单链DNA分子丙。以待测空肠弯曲菌为模板，采用特异性引物对，通过PCR反应获得含有257突变位点在内的gyrA基因片段，PCR反应产物经过单链分离纯化可以获取DNA单链，直接放入焦测序仪进行测序。本发明能够鉴定空肠弯曲菌的C257T突变，从而确定待检空肠弯曲菌是否高水平耐受喹诺酮类抗生素。本发明为耐喹诺酮类空肠弯曲菌的检测及分子流行病学监测提供了有力的技术手段。

Description

快速检测空肠弯曲菌gyrA基因突变位点的引物组及其应用
技术领域
本发明涉及一种快速检测空肠弯曲菌gyrA基因突变位点的引物组及其应用。
背景技术
空肠弯曲菌又称空肠弯曲杆菌，是引起人急性胃肠炎的最重要的食源性致病菌之一，临床上95%以上的弯曲菌性肠炎都是由空肠弯曲菌和结肠弯曲菌引起。空肠弯曲菌可通过食物链传播给人，污染的禽肉、牛奶和饮用水都是主要的传播途径。喹诺酮类药物是治疗空肠弯曲菌引起的肠炎中使用最普遍的药，同时也是临床上针对弯曲菌感染的一线治疗药物。耐药空肠弯曲菌的出现导致临床上空肠弯曲菌病病程迁延不愈和治疗失败，极大的威胁人类健康，同时耐药菌株也导致治疗成本增加等问题，造成巨大的经济损失。空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素的耐药性是由其DNA促旋酶A亚基的编码基因（gyrA基因）上的喹诺酮耐药决定区(QRDR)的点突变所引起。gyrA基因如序列表的序列4所示，其读码框为序列4第287至2878位核苷酸所示（2592个核苷酸），读码框第257位核苷酸由C突变为T（因此又称C257T突变），造成其编码的蛋白质的第86位氨基酸残基由苏氨酸（由aca编码）突变为异亮氨酸（由ata编码），引起空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素表现出高水平耐药（最小抑菌浓度均≥64mg/μL）。因此，gyrA基因读码框的第257位核苷酸被称为257突变位点，又被称为喹诺酮类抗生素耐药突变位点。为了确定待检空肠弯曲菌是否高水平耐受喹诺酮类抗生素，有必要建立一种快速准确的分子生物学检测方法。
目前用于检测空肠弯曲菌耐药的方法主要有传统的药物敏感性试验法和基因型突变检测法。传统的基因型突变检测法主要有聚合酶链式反应-线性探针法、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析法、错配扩增突变聚合酶链反应法及荧光定量聚合酶链式反应法等方法，上述几种以聚合酶链式反应为基础的基因型突变检测方法成本较高，不适宜对大量样品进行检测，而且仅是定性试验，无法进行点突变基因突变方向判定的定性试验。传统的药物敏感性试验需要进行空肠弯曲菌培养，要求较高的培养条件，需要花费大量的时间，不满足急性传染病紧急疫情防治工作的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测空肠弯曲菌gyrA基因突变位点的引物组及其应用。
本发明提供了一种引物组，由特异引物对和测序引物组成；所述特异引物对由单链DNA分子甲和单链DNA分子乙组成；所述测序引物为单链DNA分子丙；所述单链DNA分子甲如序列表的序列1所示，所述单链DNA分子乙如序列表的序列2所示，所述单链DNA分子丙如序列表的序列3所示。
所述单链DNA分子甲或所述单链DNA分子乙的5’末端可标记有生物素。
本发明还保护所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测待测空肠弯曲菌的gyrA基因是否发生了C257T突变。
本发明还保护一种检测待测空肠弯曲菌的gyrA基因是否发生了C257T突变的试剂盒，包括所述引物组。所述试剂盒还可包括PCR扩增缓冲液等常规PCR试剂，如TAKARA公司的Premix Ex TaqTMVersion2.0(Loading dye mix,货号是D336A。所述试剂盒还可包括焦磷酸测序仪，如PSQ-96MA型焦磷酸测序仪。所述试剂盒还可包括binding buffer、washing buffer、annealing buffer和Denaturation buffer。
本发明还保护所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为辅助鉴定待测空肠弯曲菌是否耐喹诺酮类抗生素。
本发明还保护一种辅助鉴定待测空肠弯曲菌是否耐喹诺酮类抗生素的试剂盒，包括所述引物组。
所述试剂盒还可包括PCR扩增缓冲液等常规PCR试剂，如TAKARA公司的Premix ExTaqTMVersion2.0(Loading dye mix,货号是D336A。所述试剂盒还可包括焦磷酸测序仪，如PSQ-96MA型焦磷酸测序仪。所述试剂盒还可包括binding buffer、washingbuffer、annealing buffer和Denaturation buffer。
本发明还保护一种检测待测空肠弯曲菌的gyrA基因突变位点的方法，包括如下步骤：
（1）以待测空肠弯曲菌的基因组DNA为模板，采用所述引物组中的所述特异引物对进行PCR扩增，得到生物素标记的PCR产物；
（2）将所述PCR产物和偶联抗生物素蛋白的琼脂糖凝胶磁珠震荡混合，得到混合产物；
（3）抓取所述混合产物中结合有所述PCR产物的琼脂糖磁珠，进行变性，得到焦磷酸测序单链模板；
（4）采用焦磷酸测序仪，采用所述引物组中的所述测序引物，对所述焦磷酸测序单链模板进行测序，根据测序结果判断待测空肠弯曲菌的gyrA基因是否发生了C257T突变。
所述PCR扩增的反应体系具体如下（50μL）：25μL PCR扩增缓冲液(TAKARA公司的Premix Ex TaqTMVersion2.0(Loading dye mix,货号是D336A))、1μL100ng/μL的基因组DNA、1μL上游引物、1μL下游引物、22μL双蒸水。初始时刻，上游引物和下游引物在反应体系中的浓度均为10pM。
所述PCR扩增的反应条件具体如下：95℃5min，1个循环；95℃15s、58℃30s、72℃20s，45个循环。
所述步骤（2）中，得到混合产物的方法具体如下：将50μL所述PCR产物与3μL偶联抗生物素蛋白的琼脂糖凝胶磁珠（GE Healthcare17-5113-01）、47μl的bindingbuffer震荡混合，使得总体积达到100μl，在室温（25℃）下震荡混合10min，得到混合产物。
所述步骤（3）中，得到单链模板的具体方法如下：在workstation中，4个对应的样品板内依次加入高纯水、70%乙醇水溶液、washing buffer和Denaturationbuffer；将焦磷酸测序仪反应面板上的抽真空开关置于on状态，vacuum prep tool先在高纯水中清洗30s，之后将vacuum prep tool移到混合产物中，抓取结合有PCR扩增产物的琼脂糖凝胶磁珠，依次将vacuum prep tool放入70%乙醇水溶液中10sec、Denaturation buffer中10sec、washing buffer中10sec，得到用于进行焦磷酸测序的单链模板，该单链模板吸附于vacuum prep tool上。
所述步骤（4）中，所述测序的方法如下：将吸附有单链模板的vacuum prep tool置于装有40μl测序体系的96孔板的相应位置的正上方（40μl测序体系如下：38.5μlannealing buffer，1.5μl测序引物；测序引物在测序体系中的浓度为0.3μM），对准位置后，再把工作面板的抽真空开关置于off状态，将vacuum prep tool放入测序体系中，轻轻摇动，释放结合琼脂糖磁珠的单链产物；再将96孔板置于80℃烘箱，放置2min，取出并冷却到室温；软件中设置反应程序，进入SQA系统后选择SQA Entries，从左往右的第二栏里，设定反应顺序为15ACTG，加好试剂舱，进行焦磷酸测序反应。
本发明还保护一种检测和/或辅助检测待测空肠弯曲菌是否耐喹诺酮类抗生素的方法，包括如下步骤：基于所述“检测待测空肠弯曲菌的gyrA基因突变位点的方法”的结果，如果待测空肠弯曲菌的gyrA基因发生了C257T突变，待测空肠弯曲菌为或候选为耐喹诺酮类抗生素的菌；若待测空肠弯曲菌的gyrA基因未发生C257T突变，待测空肠弯曲菌不为或候选不为耐喹诺酮类抗生素的菌。
本发明提供的方法涉及聚合酶链式反应技术（PCR）和焦磷酸测序技术。焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）是近年发展起来的一种依靠生物发光进行脱氧核苷酸（DNA）序列分析的新技术，是目前唯一得到定量序列结果的突变检测技术，可达到实时测定DNA的序列的目的。焦磷酸测序技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，具有分析结果快速、准确性极高、重现性佳、高通量、低成本、自动化、操作简便（PCR产物可直接用于测序，不需进行产物二次处理）和所需样品量小的特点，是一种通用型技术平台，功能多样，应用领域广泛，适合于从基因型层面快速、准确检测喹诺酮类抗生素耐药弯曲菌。在焦磷酸测序检测突变的过程中，对目的片段很好的扩增和对待测位点的确定是整个实验的关键。
基于C257T突变引起空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素的耐药性这一事实，本发明设计了特异性引物对（其中下游引物使用生物素标记）和特异性测序引物。先以待测空肠弯曲菌为模板，采用特异性引物对，通过PCR反应获得含有257突变位点在内的gyrA基因片段，PCR反应产物经过单链分离纯化可以获取DNA单链，无需二次处理直接放入焦测序仪进行测序，在仪器SQA程序反应下，通过加入特异性测序引物从而获取含有257突变位点在内的一小段核苷酸序列。本发明能够鉴定空肠弯曲菌的C257T突变，从而确定待检空肠弯曲菌是否高水平耐受喹诺酮类抗生素，具有操作简便、准确性高、所需时间短、特异性高、灵敏度高、适于大批量样本的检测等优点，非常适合大批量快速筛查喹诺酮类抗生素耐药菌，继而提供准确的用药指导。本发明为耐喹诺酮类空肠弯曲菌的检测及分子流行病学监测提供了有力的技术手段。
附图说明
图1为耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲菌的焦磷酸测序图谱。
图2为喹诺酮类抗生素敏感空肠弯曲菌的焦磷酸测序图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
本发明的主要原理：利用PCR反应制备待测序模板（用于PCR的引物对中，一条引物用生物素标记），PCR产物和偶联抗生物素蛋白的琼脂糖凝胶磁珠孵育，DNA双链经碱变性分开，纯化得到具有生物素标记的待测序单链；测序引物与待测序单链相结合，然后将其与DNA聚合酶、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）硫酸化酶、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶，以及底物腺苷酰硫酸（APS）和荧光素一起孵育，四种三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模板配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来，释放出来的PPi的量与和模板结合的dNTP的量成正比，腺嘌呤核苷三磷酸硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号，光信号由CCD摄像机检测并反应为峰，每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比，ATP和未掺入的dNTP由腺苷三磷酸双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系，然后加入下一种dNTP，最终从反应光强的信号峰中读出待测样品中的gyrA基因是否发生C257T突变。
binding buffer（pH=7.6）的制备方法：将1.21g Tris、117g NaCl、0.292g EDTA和1mL Tween20溶于900mL高纯水，用1M HCl水溶液调pH至7.6，加入1mL吐温20，用高纯水定容至1000mL。
washing buffer（pH=7.6）的制备方法：将1.21g Tris溶于900mL高纯水，用4M醋酸水溶液调pH至7.6，用高纯水定容至1000mL。
annealing buffer（pH=7.6）的制备方法：将2.42g Tris、0.43g四水醋酸镁溶于900mL高纯水，用4M醋酸水溶液调pH至7.6，用高纯水定容至1000mL。
Denaturation buffer（pH=13.3）：0.2M NaOH水溶液。
实施例中所用的焦磷酸测序仪为PSQ-96MA型焦磷酸测序仪。
实施例1、引物组的获得
通过大量序列分析、设计和筛选，获得一对特异引物如下（靶序列为147bp）：
上游引物（序列表的序列1）：5’-TTTGTCAAATCAGCCCGTATAGT-3’；
下游引物（序列表的序列2）：5’-AGATCCAAAGTTGCCTTGTCC-3’。
下游引物的5’末端用生物素进行标记。
在靶序列的基础上，根据上下游引物选择最优的与之组合配套的测序引物如下：
测序引物（序列表的序列3）：5’-TTATCACCCACATGGAG-3’。
上游引物、下游引物和测序引物形成引物组。上述引物组可用于检测待测空肠弯曲菌中是否含有gyrA基因的C257T突变。上述引物组可作为检测待测空肠弯曲菌中是否含有gyrA基因的C257T突变的试剂盒的组分。
实施例2、引物组在检测空肠弯曲菌中是否含有gyrA基因的C257T突变中的应用
一、检测耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲菌中是否含有gyrA基因的C257T突变
本步骤中所用的耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌为空肠弯曲杆菌ZP11；参考文献：Xia Chen,Gao-Wa Naren,Congming Wu,Yang Wang,Lei Dai,Li-Ning Xia,Peng-jie Luo,Qingjing Zhang,Jian-Zhong Shen.Prevalence and antimicrobialresistance of Campylobacter isolates in broilers from China.Vet Microbiol.2010.144:133-139；陈霞.山东省肉鸡源耐药弯曲菌流行病学调查及其对喹诺酮和氨基糖苷类耐药机制研究.[博士学位论文].北京.中国农业大学.2011；公众可从中国农业大学获得该菌株。
1、基因组DNA的提取
提取耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲菌的基因组DNA。
2、将步骤1提取的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，通过1％琼脂糖凝胶电泳（150V电压）回收PCR扩增产物。
PCR反应体系（50μL）：25μL PCR扩增缓冲液(TAKARA公司的Premix Ex TaqTMVersion2.0(Loading dye mix,货号是D336A))、1μL100ng/μL的基因组DNA、1μL上游引物、1μL下游引物、22μL双蒸水；初始时刻，上游引物和下游引物在反应体系中的浓度均为10pM。
PCR反应条件：95℃5min，1个循环；95℃15s、58℃30s、72℃20s，45个循环。
上述PCR反应体系中，模板以外的其他组分组成PCR试剂。上述PCR试剂均可作为检测空肠弯曲菌中是否含有gyrA基因的C257T突变的试剂盒的组分。
3、制备焦磷酸测序单链模板
将50μL步骤2得到的PCR扩增产物与3μL偶联抗生物素蛋白的琼脂糖凝胶磁珠（GE Healthcare17-5113-01）、47μl的binding buffer震荡混合，使得总体积达到100μl，在室温（25℃）下震荡混合10min，得到混合产物（借助抗生物素蛋白和生物素的结合作用，琼脂糖凝胶磁珠与PCR扩增产物充分结合；需在震荡结束后3分钟内进行后续的抓取工作）。
在workstation（工作站，焦磷酸测序仪的组成部分）中，4个对应的样品板内依次加入180ml高纯水、180ml70%乙醇水溶液、180ml washing buffer和120mlDenaturation buffer。
将焦磷酸测序仪反应面板上的抽真空开关置于on状态，vacuum prep tool（抓取磁珠的96孔探头）先在高纯水中清洗30s，之后将vacuum prep tool移到混合产物中，抓取结合有PCR扩增产物的琼脂糖凝胶磁珠，依次将vacuum prep tool放入70%乙醇水溶液中10sec、Denaturation buffer中10sec、washing buffer中10sec，得到用于进行焦磷酸测序的单链模板，该单链模板吸附于vacuum prep tool上。
4、焦磷酸测序
将吸附有单链模板的vacuum prep tool置于装有40μl测序体系的96孔板的相应位置的正上方（40μl测序体系如下：38.5μl annealing buffer，1.5μl测序引物；测序引物在测序体系中的浓度为0.3μM；请注意此时由于工作面板的真空泵还置于on的状态，所以单链模板被牢牢的吸在vacuum prep tool的96孔磁性探头上面，此时vacuum prep tool只能对准96孔的位置悬空于各孔的上方，千万不能直接插入测序体系中，否则会导致事先加好的测序引物和annealing buffer被吸走），对准位置后，再把工作面板的抽真空开关置于off状态，将vacuum prep tool放入测序体系中，轻轻摇动，释放结合琼脂糖磁珠的单链产物。
再将96孔板置于80℃烘箱，放置2min后，再取出任其自动冷却到室温。
软件中设置反应程序，进入SQA系统后选择SQA Entries，从左往右的第二栏里，设定反应顺序为15ACTG，并根据软件提示加好试剂舱，进行焦磷酸测序反应。引物链随着不同dNTP的加入延伸。
焦磷酸测序结果见图1，自测序引物以后读取的序列为ATATAGCAGTTTAT。
可以看出，菌株发生了C257T突变，焦磷酸测序结果与菌株的耐药表型鉴定一致，说明本发明的方法正确可靠。
二、检测喹诺酮类抗生素敏感空肠弯曲菌中是否含有gyrA基因257位点突变
本步骤中所用的喹诺酮类抗生素敏感空肠弯曲菌为空肠弯曲菌NCTC11168株（标准株，获自NCTC，编号为11168）。
1、提取喹诺酮类抗生素敏感空肠弯曲菌的基因组DNA。
2、同步骤一的2。
3、同步骤一的3。
4、同步骤一的4。
焦磷酸测序结果见图1，自测序引物以后读取的序列为ATACAGCAGTTTAT。
可以看出，菌株未发生C257T突变，焦磷酸测序结果与菌株的不耐药表型一致，说明本发明的方法正确可靠。
从上述实验可以看出，采用本发明的引物组或含有本发明的引物组的PCR试剂或含有本发明的引物组的试剂盒，采用本发明的方法，可以鉴定待测空肠弯曲菌的gyrA基因是否发生了C257T突变，从而判断该待测空肠弯曲菌是否耐喹诺酮类抗生素，具体如下：若待测菌株的gyrA基因发生了C257T突变，则待测空肠弯曲菌为或候选为耐喹诺酮类抗生素的菌株；若待测菌株的gyrA基因未发生C257T突变，则待测空肠弯曲菌不为或候选不为耐喹诺酮类抗生素的菌株。
Figure IDA0000395498610000011
Figure IDA0000395498610000021
Figure IDA0000395498610000031

Claims (8)

1.一种引物组，由特异引物对和测序引物组成；所述特异引物对由单链DNA分子甲和单链DNA分子乙组成；所述测序引物为单链DNA分子丙；所述单链DNA分子甲如序列表的序列1所示，所述单链DNA分子乙如序列表的序列2所示，所述单链DNA分子丙如序列表的序列3所示。
2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述单链DNA分子甲或所述单链DNA分子乙的5’末端标记有生物素。
3.权利要求1或2所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测待测空肠弯曲菌的gyrA基因是否发生了C257T突变。
4.一种检测待测空肠弯曲菌的gyrA基因是否发生了C257T突变的试剂盒，包括权利要求1或2所述引物组。
5.权利要求1或2所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为辅助鉴定待测空肠弯曲菌是否耐喹诺酮类抗生素。
6.一种辅助鉴定待测空肠弯曲菌是否耐喹诺酮类抗生素的试剂盒，包括权利要求1或2所述引物组。
7.一种检测待测空肠弯曲菌的gyrA基因突变位点的方法，包括如下步骤：
（1）以待测空肠弯曲菌的基因组DNA为模板，采用所述引物组中的所述特异引物对进行PCR扩增，得到生物素标记的PCR产物；
（2）将所述PCR产物和偶联抗生物素蛋白的琼脂糖凝胶磁珠震荡混合，得到混合产物；
（3）抓取所述混合产物中结合有所述PCR产物的琼脂糖磁珠，进行变性，得到焦磷酸测序单链模板；
（4）采用焦磷酸测序仪，采用所述引物组中的所述测序引物，对所述焦磷酸测序单链模板进行测序，根据测序结果判断待测空肠弯曲菌的gyrA基因是否发生了C257T突变。
8.一种检测和/或辅助检测待测空肠弯曲菌是否耐喹诺酮类抗生素的方法，包括如下步骤：基于权利要求7所述方法的结果，如果待测空肠弯曲菌的gyrA基因发生了C257T突变，待测空肠弯曲菌为或候选为耐喹诺酮类抗生素的菌；若待测空肠弯曲菌的gyrA基因未发生C257T突变，待测空肠弯曲菌不为或候选不为耐喹诺酮类抗生素的菌。
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