CN103524580A

CN103524580A - 一种从红腺忍冬花及花蕾或枝叶中提取分离马钱子苷的方法

Info

Publication number: CN103524580A
Application number: CN201310505271.8A
Authority: CN
Inventors: 宋志军; 缪剑华; 姚彩云; 蓝鸣生; 陈路; 杜芳黎; 李汉浠; 陈广钜; 吴庆华; 黄丹娜
Original assignee: Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants
Current assignee: Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants
Priority date: 2013-10-24
Filing date: 2013-10-24
Publication date: 2014-01-22

Abstract

一种从红腺忍冬花及花蕾或枝叶中提取分离马钱子苷的方法。属医药技术领域，发明公开了一种从广西特色药材红腺忍冬(Loliseria hypoglauca Miq)的花及花蕾或枝叶中提取制备化合物马钱子苷(Loganin)的方法，其特征是通过高浓度低级醇(如甲醇，乙醇)提取，浓缩后经乙酸乙酯萃取除去脂溶性成分，再用正丁醇萃取，聚酰胺柱色谱法富集，经SephadexLH-20凝胶色谱，以低级醇(如甲醇，乙醇)为洗脱剂洗脱、回收溶剂浓缩、析出结晶、重结晶，得到纯度95％以上的马钱子苷。本发明是从红腺忍冬花和采花后修剪的废枝叶中回收具有广阔市场前景的天然药物活性成分，对于红腺忍冬的综合利用有巨大的促进作用。

Description

一种从红腺忍冬花及花蕾或枝叶中提取分离马钱子苷的方法

技术领域

本发明涉及天然药物化学领域。具体涉及一种从红腺忍冬话及花蕾，或农作物废弃物“红腺忍冬枝叶”中以较低成本快速提取制备马钱子苷的方法。

背景技术

红腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq)的花和花蕾，在传统中医药中被作为金银花(Honeysuckle Flower；Japanese Honeysuckle)使用，在2005以后版的“药典”明确规定红腺忍冬的花为山银花，而忍冬(Lonicerajaponica Thunb)的花作为金银花，从化学成分来讲，它们有一定的差异性，但并不大。而在广西地区，特别是喀斯特熔岩地貌地区，红腺忍冬最适宜种植，这不仅可以提高农民收入还可以对环境石漠化进行很好的治理，对当地的水土保持及自然环境修复治理起到至关重要的作用，目前已形成了良性循环。但是，随着山银花与金银花的在药典中的分开，原先许多传统中药原料药用“金银花”(包括现在的金银花及山银花)的品种，在现行药典中还是沿用以前的规定：“金银花”为原料药。从而使一些质量优良的山银花价格急剧下降，严重挫伤了药农的生产积极性，对广西地区的山银花产业几乎是毁灭性的打击。广西一些地方出现盲目的毁山银花而改种金银花的现象(喀斯特地区不适宜)。如何提高山银花的种植收益，提高药农的生产积极性，迫在眉睫。为此我们对山银花在广西的代表植物-红腺忍冬展开全面的研究，以期从活性成分、基因遗传的亲缘关系、药理药效等各方面为挽救广西山银花产业提供理论依据。调查资源时发现，药农每年在红腺忍冬产花后就要对其枝叶进行修剪，从而产生了大量的废弃枝叶。在研究红腺忍冬化学成分异同的过程中，我们发现红腺忍冬的花和枝叶中，含有丰富的环烯醚萜类成分，提取回收利用这些有效成分，对于山银花附加值的提升有重大的价值和意义。

绿原酸及其衍生物，黄酮类、三萜及其皂苷类化合物是目前报道的金银花或山银花的主要活性成分。以往有些研究也表明金银花中含有环烯醚萜类化合物，但是作为主要活性物质，环烯醚萜类化合物在金(山)银花生物活性中所起的作用目前研究尚不够。环烯醚萜类化合物(iridoids)是一类特殊的单萜类化合物，为蚁臭二醛(iridodial)的缩醛衍生物。作为众多植物药的有效成分之一，环烯醚萜类化合物具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化、保肝利胆、解痉镇痛、增强免疫、降糖调脂等多种活性，并且对神经系统、心血管系统和消化系统具有药理作用。关于忍冬属植物中环烯醚萜苷类有效部位药理作用的研究尚不多见，有必要对其化学成分和药理作用进行深入研究，为忍冬属植物的质量控制和应用提供依据和参考。

环烯醚萜有闭环环烯醚萜及开环环烯醚萜两大类。马钱子苷(见结构式)属于闭环环烯醚萜苷，又名马钱素、番木鳖苷(CAS：1 8524-94-2，分子式：C₁₇H₂₆O₁₀，分子量：390，熔点：105～108℃)易溶于水，微溶于无水乙醇，几乎不溶于非极性溶剂(乙醚、乙酸乙酯、丙酮和氯仿)。对非持异性免疫功能有增强作用，能促进巨噬细胞吞噬功能，延缓衰老，广泛用作山茱萸等中药材的质量控制指标。作为常用的中成药物原料有效成分之一，有良好的抗炎、抗菌、镇咳及祛痰等作用。马钱苷能降低大鼠前脂肪细胞内cAMP的含量，且可拮抗肾上腺素使大鼠前脂肪细胞内的cAMP水平升高的作用，并使其cAMP含量恢复到正常水平。据报道该成分无溶血性，无明显的血管刺激性，并且注射给药剂量小于口服给药剂量，而药效优于口服给药，可将其开发为中药注射剂供临床应用。

基于以上原因，我们针对红腺忍冬花及花蕾以及枝叶中的环烯醚萜类化合物-马钱子苷的提取分离进行了研究，通过研究提出本发明。

发明内容

红腺忍冬干燥花及花蕾或枝叶，适当粉碎后，用70％到95％含水低级醇(甲醇、乙醇，下同)，在静态或动态下，室温或加热(包括浸渍、超声、渗漉、回流、微波等)提取3次，提取液减压或常压蒸馏回收醇溶剂至大量起泡(相对密度1.05～1.35／60℃)，加0.5到1倍体积水混合均匀，冷却后过滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取三次，接着母液再改用正丁醇萃取三次，正丁醇萃取部分减压或常压蒸发浓缩除去有机溶剂，得到流浸膏。浸膏用适量乙醇溶解后，上聚酰胺柱层析，用水-低级醇溶剂系统(100：0～5：95)进行梯度洗脱，用TLC检测合并马钱子苷部分(10％-60％低级醇洗脱部分馏分)，回收醇溶剂，浓缩液上sephadexLH-20葡聚糖凝胶柱层析以低级醇洗脱，洗脱液回收醇溶剂放冷析出粗结晶，以低级醇反复重结晶纯化到马钱子苷含量在95％以上，制得白色或无色结晶或白色无定型粉末，即可。重结晶母液可用于下一批次循环使用(见附图1)。

附图说明

图1是化合物1(马钱子苷)提取工艺流程简图

图2是化合物1(马钱苷)的¹H-NMR谱图(in CDCl₃ and CD₃OD)

图3是化合物1(马钱苷)的¹³C-NMR谱图(in CDCl₃ and CD₃OD)

具体实施实例l

红腺忍冬枝叶中马钱子苷的提取分离

红腺忍冬干燥粉碎的枝叶(5.0kg)，用5倍量75％乙醇浸泡24小时后，超声提取30min.，滤取提取液后，继续超声提取两次，每次75％乙醇5倍量、超声提取30min.，提取液过滤合并后，减压蒸馏回收醇溶剂致大量起泡(相对密度1.05／60℃)，加0.5到1倍体积水混合均匀，冷却后过滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取三次，回收溶剂得到乙酸乙酯部位；接着母液再改用正丁醇等体积萃取三次，正丁醇萃取部分减压浓缩除去有机溶剂，得到流浸膏。流浸膏用适量乙醇溶解后，上聚酰胺柱层析，用水-乙醇溶剂系统(100：0～5：95)进行梯度洗脱，TLC检测收集合并20％-40％乙醇洗脱部分馏分，该部分经旋转薄膜蒸发仪减压浓缩，回收溶剂后，以少量甲醇溶解，上sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析以甲醇洗脱。洗脱液浓缩至小体积，放冷析出粗结晶，过滤收集粗结晶，热甲醇重结晶纯化制得白色无定型粉末，过滤得到的晶体再以95％热乙醇溶解重结晶得目标化合物，进一步用95％乙醇重结晶纯化制得纯度95％以上的马钱子苷(1.765g，以下称为‘化合物1’)。

具体实施实例2

红腺忍冬花及花蕾中马钱子苷的提取分离

红腺忍冬干燥粉碎的花及花蕾(5.0kg)，用5倍量75％乙醇浸泡24小时后，超声提取30min.，滤取提取液后，继续超声提取两次，每次75％乙醇5倍量、超声提取30min.，提取液过滤合并后，减压蒸馏回收醇溶剂至大量起泡(相对密度1.05／60℃)，加0.5到1倍体积水混合均匀，冷却后过滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取三次，回收溶剂得到乙酸乙酯部位；接着母液再改用正丁醇等体积萃取三次，正丁醇萃取部分减压浓缩除去有机溶剂，得到流浸膏。流浸膏用适量乙醇溶解后，经聚酰胺柱层析，用水-乙醇溶剂系统(100：0～5：95)进行梯度洗脱，TLC检测收集合并20％-40％乙醇洗脱部分馏分，该部分经旋转薄膜蒸发仪减压浓缩，回收溶剂后，以少量甲醇溶解，上sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析以甲醇洗脱。洗脱液浓缩至小体积，放冷析出粗结晶，过滤收集粗结晶，热甲醇重结晶纯化制得白色无定型粉末，过滤得到的晶体再以95％热乙醇溶解重结晶得目标化合物，进一步用95％乙醇重结晶纯化制得纯度95％以上的马钱子苷(3.751g，以下称为‘化合物2’)。

马钱子苷的结构鉴定

化合物1为白色无定型粉末。通过ESI-MS确定其分子式为C₁₇H₂₆O₁₀，分子量：390：酸水解实验证明其含有一个D-葡萄糖。

化合物1核磁数据如下：¹H NMR(600 MHz，in CD₃OD and CDCl₃)δ(ppm)(附图2)：

7.49(1H，s，H-3)，5.16(1H，d，J=4.8，H-1)，4.61(1 H，d，J=7.8，H-1′)，3.05(1H，q，J=8.4，H-5)，2.1 9(1H，ddd，J=1 3.8，7.8，1.2，H-6a)，1.59(1H，ddd，J=1 3.8，7.8，2.4，H-6b)，4.1 3(1H，brt，J=4.2，H-7)，1.82(1H，m，H-8)，2.02(1H，td，J=9.0，4.8，H-9)，1.04(3H，d，J=7.2，H-10)，3.21(1H，t，J=8.4，H-2′)，3.84(1H，dd，J=12.0，2.4，H-6′a)，3.69(1H，dd，J=12.0，5.4，H-6′b)，3.33(1H，dd，J=9.6，7.2，H-4′)，3.37(1H，m，H-5′)。

¹³C NMR(1 51 MHz，CD₃OD and CDCl₃)δ(ppm)(附图3)：

169.1 6(C-11)，151.63(C-3)，113.42(C-4)，99.44(C-1′)，97.17(C-1)，77.36(C-5′)，77.25(C-3′)，74.50(C-2′)，73.96(C-7)，70.83(C-4′)，62.24(C-6′)，51.72(-OCH3)，45.81(C-9)，42.06(C-6)，41.46(C-8)，31.44(C-5)，1 3.23(C-10).

其碳谱及氢谱数据与文献(杨俊山，天然研有机化合物核磁共振碳谱集(上).化学工业出版社：北京，2011，p488.Chemical and Pharmaceutical Bulletin 1995，43，(5)，729.)报道的马钱子苷一致，故鉴定为马钱子苷(Loganin)。

化合物2为白色无定型粉末，ESI-MS数据、酸水解后测定数据、核磁数据与化合物1完全相同，与化合物1混合测定熔点不下降(106～108℃)。故化合物2也鉴定为马钱子苷。

Claims

1.从红腺忍冬的花及花蕾或枝叶中提取分离一种环烯醚萜类化合物-马钱子苷，其特征在于通过高浓度低级醇提取，再经乙酸乙酯萃取除去脂溶性成分，后用正丁醇萃取，正丁醇萃取物充分回收溶剂后，残余物用水溶解后经聚酰胺柱色谱法富集，用水与低级醇(如甲醇，乙醇，下同)混合物为洗脱剂洗脱、回收溶剂后，浓缩液经SephadexLH-20凝胶色谱，以低级醇为洗脱剂洗脱、回收溶剂浓缩放冷、析出结晶，重结晶，得到纯度95％以上的马钱子苷白色结晶或无定型粉末。

2.权利要求1所述的马钱子苷结构符合下述结构式：

3.权利要求2所述化合物的提取工艺为：

3.1红腺忍冬(Loliseria hypoglauca Miq)花及花蕾或枝叶的粗粉，采用高浓度低级醇提取；

3.2提取液回收醇溶剂后，得醇提取残余液，加水相当于残余液的0.5到1倍体积，充分混悬；

3.3混悬液分别用乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂依次萃取，收集正丁醇部分，回收正丁醇溶剂得到正丁醇提取物；

3.4正丁醇提取物经聚酰胺柱层析、葡聚糖凝胶柱层析等操作制得马钱子苷；

3.5有关上述提取工艺的说明：

1)3.1所述用于提取的低级醇的浓度为70％到95％；

2)3.1所述提取方法可为：回流、浸渍、渗漉、超声、微波提取等多种方法；

3)3.3所述醇提取残余液相对密度为：1.05～1.35／60℃；

4)聚酰胺柱层析所用洗脱剂为：水-低级醇，梯度洗脱；葡聚糖凝胶柱层析所用洗脱剂为低级醇。

4.权利要求1所述的马钱子苷可作为标准品用于吴茱萸等药材或有关中成药的质量标准控制中。也可制成药物制剂应用在抗炎，抗菌、抗癌、镇咳，祛痰等方面。