CN103524435B - 一种乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹的半抗原和完全抗原及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹的半抗原和完全抗原及其制备方法，属于免疫学领域。本发明为解决目前有关乙酰甲喹的残留检测方法需要复杂昂贵的仪器，而且要经过繁琐的前处理，很难达到快速、简便的现场检测要求的难题，本发明基于抗原抗体反应的免疫学检测技术是小分子残留分析检测的一个新途径，通过化学合成法制备脱二氧乙酰甲喹及带有羧基基团的半抗原，用水溶性碳二亚胺盐酸盐为偶联剂，将半抗原与载体蛋白偶联，制备M1完全抗原。该完全抗原可用于制备抗乙酰甲喹残留标示物抗体，也可进一步用于建立乙酰甲喹代谢物残留免疫检测方法。

Description

一种乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹的半抗原和完全抗原及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫学领域，特别涉及一种乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹（M1）的半抗原和完全抗原及其制备方法。
背景技术
乙酰甲喹（Mequindox，MEQ）又称痢菌净，属喹噁啉类化合物，是我国自行研制的具有自主知识产权的一类新兽药。由于具有广谱抗菌活性，在我国兽医临床上应用广泛。但是，生产实践表明，乙酰甲喹毒性偏大，剂量高于治疗量的3～5倍或长时间连续使用时可引起中毒甚至死亡。临床毒理学研究也提示其可引起基因突变、染色体畸变，具有肝脏毒性、肾上腺毒性和两代繁殖毒性。研究表明，乙酰甲喹在体内代谢迅速，在动物体内的半衰期不过十几个小时，通常不大可能检测出原药残留。因此，检测乙酰甲喹残留应以其代谢物作为标示物进行参考。目前，初步绘制的乙酰甲喹代谢图谱表明其在体内共有13种代谢物，初定脱二氧乙酰甲喹M1（化学名：3-甲基-2-乙酰基喹噁啉）为残留标示物。
国内外有关乙酰甲喹的残留检测方法的早期文献报道中大多是检测原药化合物，对其代谢物的定量检测目前只有液质联用法。该方法需要复杂昂贵的仪器，而且要经过繁琐的前处理，很难达到快速、简便的现场检测要求。基于抗原抗体反应的免疫学检测技术是小分子残留分析检测的一个新途径，该技术研究的关键是半抗原分子的设计、合成和完全抗原及抗体的制备。脱二氧乙酰甲喹结构简单，分子量（186）小，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联制备出完全抗原，才能诱导动物产生抗体。因此，精心设计半抗原结构，选择合适的方法将半抗原偶联大分子载体，获得良好的完全抗原，就成为建立半抗原免疫检测的前提和关键。只有制备出高质量的完全抗原，才可能进一步制备检测所需抗体。目前，国内外有关乙酰甲喹残留标示物的免疫检测研究尚未见任何报道。
发明内容
为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹（M1）的半抗原。
本发明的另一目的在于提供上述乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹半抗原的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹（M1）的完全抗原。
本发明的再一目的在于提供上述乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹完全抗原的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹（M1）的半抗原，具有式I所示的结构式；式I所示的化合物为将脱二氧乙酰甲喹（M1）进行结构改造后得到的化合物，既最大程度的保留了M1的特征，又具有可以与载体蛋白偶联的活性基团，还提供了碳原子数为2～5个的连接臂；
式Ⅰ；
其中，R为碳链长度为C1～C4的亚甲基。 
本发明所述的乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹半抗原的制备方法的反应方程式如图1所示。
上述乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹半抗原的制备方法，包括如下步骤：
（1）在溶剂中，乙酰甲喹在催化剂作用下进行催化氢化反应，经萃取得3-甲基-2-乙酰基喹噁啉粗品；
（2）在溶剂中，用步骤（1）制备的3-甲基-2-乙酰基喹噁啉粗品与氢氧化钠和盐酸羟胺进行羰基的还原胺化反应，经萃取得1-[3-(甲基)-2-喹噁啉]-乙酮肟；
（3）在溶剂中，将步骤（2）制备的1-[3-(甲基)-2-喹噁啉]-乙酮肟在碱存在 下与卤代物发生烃化反应，经萃取得化合物a（如图1所示）；
（4）在溶剂中，步骤（3）制备的化合物a在催化剂作用下发生水解反应生成化合物b（如图1所示），经萃取纯化后获得脱二氧乙酰甲喹半抗原。
步骤（1）中所述溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺（DMF）；
步骤（1）中所述催化剂为钯碳，所述乙酰甲喹和钯碳的质量比为(20:3)-(8:1)，优选14:1；
步骤（1）中所述反应采用气球充氢气加压，室温下搅拌反应，反应时间为5～36h；
步骤（1）中所述的萃取优选直接萃取，过滤钯碳后再萃取会造成损失，所述萃取所用的溶剂为乙酸乙酯，具体萃取操作步骤为：在步骤（1）的反应体系中加入水，用乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，水洗两次，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥后过滤得滤液，旋蒸除去有机溶剂得到3-甲基-2-乙酰基喹噁啉粗品；
步骤（2）中所述溶剂为体积分数75%乙醇、无水乙醇或甲醇中至少一种；
步骤（2）中所述盐酸羟胺、氢氧化钠和3-甲基-2乙酰基喹噁啉粗品的摩尔比优选为2:3:1；
步骤（2）中所述还原胺化反应的温度优选为60℃；
步骤（2）中所述还原胺化反应时间优选为1h；
步骤（2）中所述的萃取的溶剂采用乙酸乙酯，操作同步骤（1）中萃取；
步骤（3）中所述溶剂为DMF（N,N-二甲基甲酰胺）、DMSO（二甲基亚砜）、四氢呋喃或乙醚中至少一种，优选极性非质子溶剂DMF和DMSO；
步骤（3）中所述卤代物为溴乙酸乙酯、4-溴丁酸乙酯或5-溴戊酸乙酯中的至少一种，可根据预期制备的完全抗原连接臂长短进行选择，卤代物与1-[3-(甲基)-2-喹噁啉]-乙酮肟的摩尔比优选为2:1；
步骤（3）中所述碱为碳酸钾、氢氧化钾或氢氧化钠中至少一种，所述碱与1-[3-(甲基)-2-喹噁啉]-乙酮肟的摩尔比优选为3:1；
步骤（3）中所述烃化反应的温度优选为60℃；
步骤（3）中所述烃化反应的时间优选为3h；
步骤（3）中萃取的溶剂采用乙酸乙酯，操作同步骤（1）中所述；
步骤（4）中所述溶剂为50%（v/v）乙醇水溶液；
步骤（4）中所述催化剂为氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙中至少一种，化合物a与催化剂的摩尔比为（1:1.5）-（1:3）；
步骤（4）中萃取纯化的具体操作步骤为：在反应体系中加水，用乙酸乙酯萃取两次，保留水层，冰浴下用稀盐酸调节pH值至3-4，有大量白色固体析出，用乙酸乙酯萃取两次，饱和氯化钠洗三次，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去有机溶剂得粗品，粗品过硅胶柱，用乙酸乙酯和石油醚混合溶剂梯度洗脱可得化合物b纯品，即脱二氧乙酰甲喹半抗原。
一种乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹的完全抗原，是将式I所示化合物与载体蛋白偶联得到的偶联物；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）或卵清白蛋白（OVA）。
上述的乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹完全抗原的制备方法，具体步骤如下：将上述脱二氧乙酰甲喹半抗原溶于DMF中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCL）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），15-25℃搅拌反应6-10h，将上述溶液滴加到蛋白储备液中，15-25℃避光偶联反应12-16h，4℃透析2-3天，每天换3次透析液，离心收集上清液，获得脱二氧乙酰甲喹完全抗原，分装后-20℃保存。
所述脱二氧乙酰甲喹半抗原、EDC·HCL、NHS的摩尔比优选为1:2:（1.5-2）。
所述蛋白储备液是将BSA或OVA溶于pH6.0的磷酸盐缓冲液（PBS），4℃放置制得；
所述透析中所用透析液优选为0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲液；透析中所用透析袋优选为截留分子量为8000-14000MW的透析袋；
所述的离心条件优选为8000rmp离心20min。
所述的乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹完全抗原在制备抗脱二氧乙酰甲喹抗体或在乙酰甲喹代谢物免疫检测中作为包被原进行应用。
本发明基于抗原抗体反应的免疫学检测技术是小分子残留分析检测的一个新途径，通过化学合成法制备脱二氧乙酰甲喹及带有羧基基团的半抗原，用水溶性碳二亚胺盐酸盐为偶联剂，将半抗原与载体蛋白偶联，制备M1完全抗原。该完全抗原可用于制备抗乙酰甲喹残留标示物抗体，也可进一步用于建立乙酰甲喹代谢物残留免疫检测方法。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明为解决目前有关乙酰甲喹的残留检测方法需要复杂昂贵的仪器，而且要经过繁琐的前处理，很难达到快速、简便的现场检测要求的难题，本发明所述的脱二氧乙酰甲喹半抗原制备方法操作简单，不需要特殊的仪器设备，设计路线的副反应少，后处理简单。
2.本发明所述脱二氧乙酰甲喹完全抗原可以作为免疫原制备抗M1抗体，也可作为包被原用于建立乙酰甲喹代谢物免疫检测方法。
附图说明
图1为脱二氧乙酰甲喹半抗原制备方法的合成路线图。
图2为实施例一例（1）所得脱二氧乙酰甲喹的质谱图。
图3为实施例二所得脱二氧乙酰甲喹半抗原的质谱图。
图4为实施例四（1）中M1-BSA的紫外分光光度法鉴定图。
图5为实施例四（2）中M1-OVA的紫外分光光度法鉴定图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一、脱二氧乙酰甲喹的制备：
例（1）
将8g乙酰甲喹溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF），加热至60℃助溶，乙酰甲喹溶解完全后停止加热，系统稳定后称取1g（12.5wt%）钯碳缓慢加入，套上氢气球，室温搅拌反应。采用薄层色谱法跟踪监测反应，36h反应完全，加水终止反应，用乙酸乙酯萃取反应液，重复两次，水洗三次后收集有机相，饱和硫酸钠干燥，旋干后得3-甲基-2-乙酰基喹噁啉（脱二氧乙酰甲喹）粗品约5.8g。
所得的脱二氧乙酰甲喹的质谱图如图2所示。
例（2）
将5g乙酰甲喹溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF），加热至60℃助溶，乙酰甲喹溶解完全后停止加热，系统稳定后称取700mg（14wt%）钯碳缓慢加入，套上氢气球，室温搅拌反应。采用薄层色谱法跟踪监测反应，28h反应完全，加水终止反应，用乙酸乙酯萃取反应液，重复两次，水洗两次，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥，旋干后得3-甲基-2-乙酰基喹噁啉粗品约4g。
例（3）
将1g乙酰甲喹溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF），加热至60℃助溶，乙酰甲喹溶解完全后停止加热，系统稳定后称取150mg（15wt%）钯碳缓慢加入，套上氢气球，室温搅拌反应。采用薄层色谱法跟踪监测反应，5h反应完全，加 水终止反应，漏斗过滤除去钯碳后用乙酸乙酯萃取滤液，重复两次，水洗两次，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥旋干后得3-甲基-2-乙酰基喹噁啉粗品约615mg。
实施例二、脱二氧乙酰甲喹半抗原的制备：
（1）将实施例一中例（1）制备的3-甲基-2-乙酰基喹噁啉粗品800mg（4.3mmoL）溶于8mL乙醇，称取598mg（8.6mmoL）盐酸羟胺加入，将516mg（12.9mmoL）氢氧化钠溶于2mL水中，逐滴加入，60℃反应1h。反应体系中出现大量固体，薄层色谱法监测反应完全后，停止加热，加水终止反应，用乙酸乙酯萃取两次，水洗后饱和硫酸钠干燥，旋蒸后得1-[3-(甲基)-2-喹噁啉]-乙酮肟粗品820mg。
（2）将步骤（1）中的产物溶于8ml DMF，称取K2CO31.659g加入，移液器吸取溴乙酸乙酯902μL加入，60℃反应3h。反应完全后，直接加水，用乙酸乙酯萃取两次，饱和氯化钠洗三次，无水硫酸钠干燥后旋转蒸发得[1-(3-甲基喹喔啉-2-基)亚乙基氨基氧基]乙酸乙酯粗品1.06g。
（3）将步骤（2）制备的粗品溶于5mL无水乙醇，加入5mL的水，称取465mg一水合氢氧化锂缓慢加入，室温下搅拌过夜。TCL监测反应完全后，加水终止反应，用乙酸乙酯萃取两次，保留水相，冰浴下用稀盐酸调节PH至3-4左右，有大量白色固体析出，用乙酸乙酯萃取两次，水洗后饱和硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂得粗品，粗品过硅胶柱后得[1-(3-甲基喹喔啉-2-基)亚乙基氨基氧基]乙酸M1（脱二氧乙酰甲喹半抗原）656mg。
所得的脱二氧乙酰甲喹半抗原的质谱图如图3所示。
实施例三、脱二氧乙酰甲喹完全抗原的制备：
1、脱二氧乙酰甲喹免疫原的制备
（1）将10mg实施例二制备得到的[1-(3-甲基喹喔啉-2-基)亚乙基氨基氧基]乙酸溶于200μL DMF中，加入15mg EDC·HCL和3.4mg NHS，室温下磁力搅拌7h，得到溶液A；
（2）称取130mg BSA，加入6mL pH6.0的PBS，充分溶解，4℃放置1h，即为溶液B；
（3）将溶液A缓慢加入溶液B中，边搅拌边滴加，室温避光反应16h，将反应液转移到截留分子量为8000-14000MW的透析袋中，以0.01M的pH7.4的PBS为透析液透析3天，每天换水3次，然后于4℃条件下，8000rmp离心20min，取上清，即得脱二氧乙酰甲喹免疫原溶液，分装于1mL离心管中，-20℃保存， 脱二氧乙酰甲喹免疫原简称M1-BSA。
（4）将M1-BSA溶液用PBS缓冲液稀释后，用BCA试剂盒测其浓度，具体步骤按试剂盒的说明书进行。测得M1-BSA溶液中M1-BSA的浓度为11.8mg/mL。
2、脱二氧乙酰甲喹包被原的制备
用卵清白蛋白（OVA）代替BSA，理论摩尔比设计为10:1，即1个OVA分子上连接10个半抗原分子，其他步骤同实施例三1中脱二氧乙酰甲喹免疫原的制备步骤。
脱二氧乙酰甲喹包被原简称M1-OVA。
M1-OVA溶液中的M1-OVA浓度为7.44mg/mL。
实施例四、脱二氧乙酰甲喹完全抗原的鉴定
1、紫外分光光度法
（1）脱二氧乙酰甲喹免疫原表征
将M1-BSA溶液、M1半抗原、BSA用PBS缓冲液稀释后，用紫外分光光度法扫描其在200-400nm处的吸收光谱。其紫外吸收光谱如图4所示。试验结果显示，BSA在278nm波长处有最大吸收峰，M1半抗原在200-400nm有两个吸收峰，分别在327.2nm处和240.8nm处，而M1-BSA溶液在325.3nm处有明显的吸收峰，在280.7nm处有较小的峰，在242.2nm处也有出峰的趋势。因此，根据吸收度的加和性原理判断半抗原成功连接在载体蛋白上。
（2）脱二氧乙酰甲喹包被原表征
用M1-OVA溶液代替M1-BSA溶液，用OVA代替BSA，其他步骤同实施例四1（1）中脱二氧乙酰甲喹免疫原表征的步骤。其紫外扫描图谱如图5所示，半抗原也成功偶联在载体蛋白上，但是由于完全抗原上偶联的小分子越多，其紫外光谱越接近半抗原的光谱。M1-OVA设定的理论偶联比较低，导致其光谱在327.2nm处的紫外吸收峰也较低。
2、免疫动物试验
将上述M1-BSA溶液用生理盐水稀释成1mg/mL溶液备用。
取健康6周龄健康雌性Balb/c小鼠3只进行免疫。首免将完全抗原与等量弗式完全佐剂（CFA，Complete Freund’s Adjuvant）通过注射器对推法混合成油包水的乳浊液，按50ug/只的量进行腹背皮下多点注射，每间隔两周进行一次加强免疫，加强免疫操作与首免相同，只是将弗式完全佐剂换成弗式不完全佐剂（IFA，Incomplete Freund’s Adjuvant）。第四次免疫一周后眼眶采血，采用间接ELISA法，以M1-OVA为包被原检测小鼠血清效价；选择效价高的小鼠，以间接竞争 ELISA法检测其特异性，试验考察了该多抗对乙酰甲喹及其8种代谢物的特异性，分别是M1、M2、M4、M5、M6、M7、M8、M9。试验结果表明，本发明的完全抗原免疫小鼠所得抗血清效价可达10000以上，对代谢物M1和M5具有良好的特异性，对M8和M9也有一定的特异性，对乙酰甲喹和其他代谢物几乎或完全没有抑制。所以，本发明成功制备了脱二氧乙酰甲喹完全抗原，该抗原可用于制备抗脱二氧乙酰甲喹特异性抗体，从而进一步用于建立快捷可靠的乙酰甲喹残留检测免疫分析方法。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹的半抗原，其特征在于具有式I所示的结构式；
其中，R为—CH2—。
2.权利要求1所述乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹半抗原的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)在溶剂中，乙酰甲喹在催化剂作用下进行催化氢化反应，经萃取得3-甲基-2-乙酰基喹噁啉粗品；
(2)在溶剂中，用步骤(1)制备的3-甲基-2-乙酰基喹噁啉粗品与氢氧化钠和盐酸羟胺进行羰基的还原胺化反应，经萃取得1-[3-(甲基)-2-喹噁啉]-乙酮肟；
(3)在溶剂中，将步骤(2)制备的1-[3-(甲基)-2-喹噁啉]-乙酮肟在碱存在下与卤代物发生烃化反应，经萃取得化合物a；
(4)在溶剂中，步骤(3)制备的化合物a在催化剂作用下发生水解反应，经萃取纯化后获得脱二氧乙酰甲喹半抗原。
3.根据权利要求2所述乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹半抗原的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；
步骤(1)中所述催化剂为钯碳，所述乙酰甲喹和钯碳的质量比为(20:3)～(8:1)；
步骤(1)中所述反应采用气球充氢气加压，室温下搅拌反应，反应时间为5～36h；
步骤(1)中所述的萃取为直接萃取，萃取所用的溶剂为乙酸乙酯，具体萃取操作步骤为：在步骤(1)的反应体系中加入水，用乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，水洗两次，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥后过滤得滤液，旋蒸除去有机溶剂得到3-甲基-2-乙酰基喹噁啉粗品。
4.根据权利要求2所述乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹半抗原的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述溶剂为体积分数75％乙醇、无水乙醇或甲醇中至少一种；
步骤(2)中所述盐酸羟胺、氢氧化钠和3-甲基-2-乙酰基喹噁啉粗品的摩尔比为2:3:1；
步骤(2)中所述还原胺化反应的温度为60℃；
步骤(2)中所述还原胺化反应的时间为1h；
步骤(2)中所述的萃取的溶剂采用乙酸乙酯。
5.根据权利要求2所述乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹半抗原的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述溶剂为DMF、DMSO、四氢呋喃或乙醚中至少一种；
步骤(3)中所述卤代物为溴乙酸乙酯、4-溴丁酸乙酯或5-溴戊酸乙酯中的至少一种，卤代物与1-[3-(甲基)-2-喹噁啉]-乙酮肟的摩尔比为2:1；
步骤(3)中所述碱为碳酸钾、氢氧化钾或氢氧化钠中至少一种，所述碱与1-[3-(甲基)-2-喹噁啉]-乙酮肟的摩尔比为3:1；
步骤(3)中所述烃化反应的温度为60℃；
步骤(3)中所述烃化反应的时间为3h；
步骤(3)中萃取的溶剂采用乙酸乙酯。
6.根据权利要求2所述乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹半抗原的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述溶剂为体积分数为50％的乙醇水溶液；
步骤(4)中所述催化剂为氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙中至少一种，化合物a与催化剂的摩尔比为(1:1.5)-(1:3)；
步骤(4)中萃取纯化的具体操作步骤为：在反应体系中加水，用乙酸乙酯萃取两次，保留水层，冰浴下用稀盐酸调节pH值至3-4，有大量白色固体析出，用乙酸乙酯萃取两次，饱和氯化钠洗三次，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去有机溶剂得粗品，粗品过硅胶柱，用乙酸乙酯和石油醚混合溶剂梯度洗脱得脱二氧乙酰甲喹半抗原。
7.一种乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹的完全抗原，其特征在于由权利要求1所述的乙酰甲喹残留标示物的半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。
8.根据权利要求7所述的乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹的完全抗原，其特征在于：所述的载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。
9.权利要求7或8所述乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹完全抗原的制备方法，其特征在于具体步骤如下：将权利要求1所述的脱二氧乙酰甲喹半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，15-25℃搅拌反应6-10h，将上述溶液滴加到蛋白储备液中，15-25℃避光偶联反应12-16h，4℃透析2-3天，每天换3次透析液，离心收集上清液，获得脱二氧乙酰甲喹完全抗原；
所述脱二氧乙酰甲喹半抗原、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:2:(1.5-2)；
所述蛋白储备液是将牛血清白蛋白或卵清白蛋白溶于pH6.0的磷酸盐缓冲液，4℃放置制得；
所述透析中所用透析液为0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲液；透析中所用透析袋为截留分子量为8000-14000MW的透析袋；
所述的离心条件为8000rmp离心20min。
10.权利要求7或8所述的乙酰甲喹残留标示物脱二氧乙酰甲喹完全抗原在制备抗脱二氧乙酰甲喹抗体或在乙酰甲喹代谢物免疫检测中作为包被原进行应用。
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