CN103520092B - 农吉利碱凝胶剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

农吉利碱凝胶剂及其制备方法，属于农吉利碱制剂技术领域。其每一千克凝胶剂中含有：农吉利碱1.2g、卡波姆-940？5～10g、甘油50～150ml、氮酮10～50ml、无水乙醇200～300ml、尼泊金甲酯5～10g和蒸馏水余量，并用三乙醇胺调pH至中性。本发明将农吉利碱制备成凝胶剂，用于治疗鳞状细胞癌，可避免经口服或静注、肌内注射给药带来的全身毒副作用，达到局部治疗疾病，提高患者的生活质量的目的。另外，本发明通过单因素考察和正交设计，筛选了凝胶剂的辅料，使农吉利碱更加稳定，更能发挥其效果。

Description

农吉利碱凝胶剂及其制备方法

技术领域

本发明属于农吉利碱制剂技术领域，具体涉及农吉利碱凝胶剂及其制备方法。

背景技术

农吉利碱（Monocrotaline, Crotaline），又称农吉利甲素、野百合碱、猪屎豆碱、大叶猪屎豆碱、可洛他林，是临床常用、试验研究较多、研究较为透彻的抗癌中药成分，分子式为C₁₆H₂₃NO₆，在结构上与美国已进入Ⅱ期临床的主治急性淋巴白血病的N-O-去甲天荠菜碱（indicine-N-oxide, Ⅲ）相似，同为双稠吡咯环生物碱（pyrrolizidine alkloids, Pas），是一种活性的烷基化成分，能干扰细胞的有丝分裂而具有抗肿瘤作用。农吉利碱对多种实验性肿瘤有抑制作用，临床主要试用于SCC和BCC，疗效确切。据报道，农吉利碱能靠形成化学键的方式与癌细胞蛋白质或血清蛋白质形成大分子复合物。

农吉利碱来源广泛，易于获取。豆科猪屎豆属属植物农吉利（C. sessiliflora）、假地蓝（C. ferruginea Gran）、小猪屎豆（C. nana）、大叶猪屎青(C.assamica)等全草中均含有农吉利碱，并且含量相对较高，其中在农吉利全草中约0.02%，种子中约0.4%。中国药典77版收载了农吉利药材和盐酸农吉利碱注射液。药材用法用量为：15～30g，必要时可增至60g，外用鲜品捣烂或干品研细末醋调外敷；注射液采用肿瘤基底部注射或肌内注射，药材和注射液均用于治疗皮肤癌。

但是，农吉利碱属于吡咯里西啶类生物碱（PA），目前PA是已知的最重要的植物性肝毒成分，被称为肝毒吡咯里西啶生物碱，除可引起造血功能受抑、白细胞和血小板下降、骨髓抑制和胃肠道反应、泌尿系统刺激等症状外，最明显的毒性是肝脏毒，它对肝脏具有蓄积的、不可逆的，强烈的毒性作用，可引起肝细胞出血性坏死、肝巨细胞症及静脉闭塞症等。其肝功能损害与用药剂量有关，超过1000mg以上，即可出现肝大、腹水、黄疸等。显然，农吉利碱口服或静注、肌内注射给药副作用较大，因此77版药典以后未予收载农吉利碱及制剂。但事实上，农吉利碱原形药物毒性较弱，而是在经过肝脏转化成代谢产物后引起肝毒性。因此，在民间仍常用农吉利鲜草浆或干品粉末外敷用于治疗SCC和BCC，毒性小并且效果良好。

中草药外敷治疗皮肤肿瘤是一种常见的安全有效的治疗方式，具有很多优点，如：药物直达病所，奏效迅速；廉便效验，易于推广；可减缓药物毒性和不良反应；可弥补内治法疗效的不足。近几十年来，国内采用单纯中医中药治疗皮肤癌取得了很大进展。如用20%蟾酥膏外敷，用皮癌净（含砷制剂）外敷，用三品一条枪（含砷剂）外敷，用五妙水仙膏外敷等。以上中药单用即可有效治愈早、中期皮肤癌，为皮肤癌的治疗开辟了一条新的途径，也为中医中药的全面开发利用提供了新的证据。

根据疾病的特定需要与药物性质，利用现代制药技术研制和开发能将药物制成稳定性好、使用携带方便的中药抗皮肤癌新制剂，对皮肤癌的临床治疗具有重要的现实意义。

经皮给药系统( transdermal drug delivery system，TDDS)是指在完整的皮肤表面给药，使药物以恒定速度通过皮肤各层进入体循环，产生治疗作用，实现疾病治疗或预防的一类新型制剂。其优点是药物吸收可以避免胃肠道降解和肝脏的首过效应；可以产生恒定、可控的血药浓度；给药方便，提高了患者用药的顺应性，特别适合于儿童、老人或口服有困难的患者。美国医药界认为，今后10～15年内，有1/3的现用药将采用透皮吸收制剂。根据世界医药市场专家的预测，口服、注射和TDDS三大给药剂型将形成“三分天下”的市场态势，药品市场中将有1/3的药品采用TDDS。

临床中常用的经皮给药制剂有软膏剂、霜剂、洗剂、擦剂、凝胶剂等。软膏剂和霜剂易造成涂布不均，污染衣物；洗剂和擦剂易挥发、流散，因而临床应用受到一定限制。凝胶剂是常用的经皮给药剂型，具有吸收速度快、生物利用度高、良好的生物相容性、质地均匀、易于涂展和洗除、皮肤给药不妨碍皮肤正常功能的特点。它作为一种含有溶解状态药物的半固体制剂，具有溶胀性、脱水收缩性、透过性和粘合性，能在较长时间内与用药部位紧密粘附，使制剂在静止时保持一定形状，在外力作用下又可流动、变形。在局部外用制剂中，往往利用这些性质来控制药物的释放或其对皮肤的粘附性。目前研究较多的是亲水性凝胶，因其手感好，易洗脱，不污染衣物，广受患者欢迎。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供农吉利碱凝胶剂及其制备方法的技术方案。

所述的农吉利碱凝胶剂，其特征在于每一千克凝胶剂中含有：

农吉利碱1.2g、卡波姆-940  5～10g、甘油50～150ml、氮酮10～50ml、无水乙醇200～300ml、尼泊金甲酯5～10g和蒸馏水余量，并用三乙醇胺调pH至中性。

所述的农吉利碱凝胶剂，其特征在于每一千克凝胶剂中含有：农吉利碱1.2g、卡波姆-940  7～8g、甘油80～120ml、氮酮20～40ml、无水乙醇240～260ml、尼泊金甲酯7～9g和蒸馏水余量，并用三乙醇胺调pH至中性。

所述的农吉利碱凝胶剂，其特征在于每一千克凝胶剂中含有：农吉利碱1.2g、卡波姆-940  5g、甘油150ml、氮酮50ml、无水乙醇250ml、尼泊金甲酯5g和蒸馏水余量，并用三乙醇胺调pH至中性。

所述的农吉利碱凝胶剂的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）取配方量的卡波姆-940加蒸馏水浸泡，充分溶胀后得到卡波姆胶状物；

2）取配方量的甘油、氮酮、尼泊金甲酯在水浴上搅拌，与卡波姆胶状物混匀成为凝胶基质；

3）取配方量的农吉利碱，使其溶于配方量的无水乙醇中；

4）将步骤3）得到的药液缓缓加入步骤2）得到的凝胶基质中混匀；

5）采用三乙醇胺调节凝胶pH值至中性，边加蒸馏水边搅拌至足量，得到农吉利碱凝胶剂。

本发明将农吉利碱制备成凝胶剂，用于治疗鳞状细胞癌，可避免经口服或静注、肌内注射给药带来的全身毒副作用，达到局部治疗疾病，提高患者的生活质量的目的。另外，本发明通过单因素考察和正交设计，筛选了凝胶剂的辅料，使农吉利碱更加稳定，更能发挥其效果。

附图说明

图1-1为试验例1中农吉利碱的紫外吸收图谱；

图1-2为试验例1中农吉利碱标准曲线图；

图2-1为试验例2中农吉利碱对照品溶液色谱图；

图2-2为试验例2中供试品溶液色谱图；

图2-3为试验例2中空白溶液色谱图；

图2-4为试验例2中农吉利碱标准曲线图；

图2-5为试验例2中不同浓度的卡波姆释放量图；

图2-6为试验例2中不同浓度甘油释放量图；

图2-7为试验例2中不同浓度氮酮释放量图；

图2-8为试验例2中正交试验结果图；

图2-9为试验例2中验证实验结果图；

图3-1为试验例3中对照品溶液色谱图；

图3-2为试验例3中供试品溶液色谱图；

图3-3为试验例3中空白溶液色谱图；

图3-4为试验例3中农吉利碱标准曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：

1）取卡波姆-940 5g加蒸馏水浸泡，充分溶胀后得到卡波姆胶状物；

2）取甘油150ml、氮酮50ml、尼泊金甲酯5g在水浴上搅拌，与卡波姆胶状物混匀成为凝胶基质；

3）取农吉利碱1.2g，使其溶于无水乙醇250ml中；

4）将步骤3）得到的药液缓缓加入步骤2）得到的凝胶基质中混匀；

5）采用三乙醇胺调节凝胶pH值至中性，边加蒸馏水边搅拌至足量1000g，得到农吉利碱凝胶剂。

实施例2：

1）取卡波姆-940 10g加蒸馏水浸泡，充分溶胀后得到卡波姆胶状物；

2）取甘油100ml、氮酮25ml、尼泊金甲酯10g在水浴上搅拌，与卡波姆胶状物混匀成为凝胶基质；

3）取农吉利碱1.2g，使其溶于无水乙醇200ml中；

4）将步骤3）得到的药液缓缓加入步骤2）得到的凝胶基质中混匀；

5）采用三乙醇胺调节凝胶pH值至中性，边加蒸馏水边搅拌至足量1000g，得到农吉利碱凝胶剂。

实施例3：

1）取卡波姆-940 8g加蒸馏水浸泡，充分溶胀后得到卡波姆胶状物；

2）取甘油50ml、氮酮10ml、尼泊金甲酯8g在水浴上搅拌，与卡波姆胶状物混匀成为凝胶基质；

3）取农吉利碱1.2g，使其溶于无水乙醇300ml中；

4）将步骤3）得到的药液缓缓加入步骤2）得到的凝胶基质中混匀；

5）采用三乙醇胺调节凝胶pH值至中性，边加蒸馏水边搅拌至足量1000g，得到农吉利碱凝胶剂。

试验例1：农吉利碱凝胶剂的处方前研究

一、实验材料

（一）实验药品和试剂

农吉利碱原料药（纯度≥98%，批号：ZL120222YY，南京泽朗医药科技有限公司）

正辛醇（分析纯，批号：20120401，上海凌峰化学试剂有限公司）

甲醇（分析纯，批号：20100801，衢州巨化试剂有限公司）

蒸馏水（自制）

其他试剂为分析纯

（二）实验器材

UV759S紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）

QYC2102恒温培养摇床（上海福玛实验设备有限公司生产）

JA1003电子天平（上海精密科学仪器有限公司）

KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）

HH-4数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）

二、方法和结果

（一）紫外分光光度法方法学的建立

1.储备液的配置

精密称取48.8mg农吉利碱对照品至50mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配成0.976mg/mL的储备液，备用。

2.紫外吸收波长的确定

精密吸取上述储备液0.6mL至10mL容量瓶，甲醇定容至刻度，在200-500nm波长下扫描最大吸收波长，结果显示，其最大吸收波长位于216nm处，如图1-1所示。

3.方法学考察

3.1标准曲线绘制

分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL储备液至10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，于216nm波长下测定吸光度A，建立吸光度A与浓度C的标准曲线，得标准曲线为y=5.9968x+0.0084，r=0.9996。由此可见，农吉利碱在39.04～136.64μg/mL范围内，吸光度A与浓度C的线性关系良好，结果见图1-2。

3.2 精密度试验

精密移取0.4、0.8、1.6mL的储备液至10mL容量瓶，甲醇定容至刻度，在216nm处测定吸光度。分别于一天内连续测6次，根据标准曲线推算浓度，计算精密度，结果见表1-1。结果显示，精密度的RSD均小于1%，表明检测方法可靠，仪器精密度良好。

表1-1（n=6）

3.3回收率试验

精密移取0.4、0.8、1.6mL的储备液至10mL容量瓶，再分别精密移取0.1mL水饱和正辛醇，甲醇定容至刻度，在216nm出测定吸光度，计算实测浓度，每组平行测定6次。根据实测值与理论值的比值计算回收率，结果见表1-2。结果表明，该方法的平均回收率为100.41%，RSD为0.19%，说明该方法稳定，回收率高，可用于农吉利碱油水分配系数的测定。

表1-2（n=6）

（二）农吉利碱油水分配系数的测定

1.水饱和正辛醇和正辛醇饱和水的配制

用量筒量取50mL正辛醇与150mL蒸馏水于具塞三角瓶中，振荡24 h，使二者相互饱和，静止分层后，分液漏斗分离，保存备用。其中，上层为水饱和正辛醇，下层为正辛醇饱和的水。

2.样品的配制

精密称取农吉利碱对照品12.2mg，用水饱和的正辛醇溶解并定容至25mL，配制成含农吉利碱0.488mg/mL的水饱和正辛醇溶液。将上述含农吉利碱的水饱和正辛醇溶液和等体积的正辛醇饱和水混合，恒温振荡24h，4000r/min离心30 min，分离上下层。

3.样品的测定

分别精密吸取0.5mL上层和下层溶液于10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，于216nm处分别测得上层和下层溶液吸光度A1和A2，计算出上层和下层对应浓度C1和C2。其中C1为农吉利碱在水饱和正辛醇中的浓度，C2为农吉利碱在正辛醇饱和水中的浓度。结果见表1-3。按公式P=C1/C2计算P值，计算结果logP=0.575。

表1-3 （n=3）

（三）农吉利碱水饱和溶解度的测定

1.样品的处理

称取农吉利碱适量于5mL西林瓶中，加入蒸馏水2mL，使溶液中始终有固体药物的存在。将此溶液置于32℃恒温振荡器中，平衡24h后取样。

2.样品的测定

将样品迅速经微孔滤膜（0.45μm）保温过滤弃去初滤液，精密移取0.2mL续滤液3份，至于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，在波长216nm处测定吸光度，代入标准曲线方程计算农吉利碱在水中的溶解度。结果见表1-4。经测定，农吉利碱在水中的饱和溶解度为1.919mg/mL，属于水微溶型药物。

表1-4（n=3）

三、分析与讨论

1.本发明采用紫外分光光度法测点了农吉利碱的油水分配系数和水中的饱和溶解度，方法灵敏度高、专属性强、重现性好，且简便易行。

2.油水分配系数是用于表示化合物亲脂性和透过生物膜能力的重要参数。药物的制剂制备、经皮吸收、在体内的溶解、吸收、分布、转运等均与油水分配系数有关。一般将药物分为三类：logP＜-0.3的水溶性药物为第一类，logP介于-0.3～4.5的为第二类，logP＞4.5的脂溶性药物为第三类。本发明测得的农吉利碱的logP值为0.575，属于第二类药物，亲脂性较低，会影响农吉利碱的透皮，故将农吉利碱制成透皮制剂时需加入合适的透皮促进剂。

3.农吉利碱在水中的平衡溶解度结果表明，农吉利碱在水中具有一定的溶解度，但是属于水微溶型药物，脂溶性较低，故将农吉利碱制成经皮给药制剂需加入合适的透皮促进剂，与油水分配系数测定结论一致。

4.在油水体系选择中，许多有机溶剂都被用来模拟生物相，如氯仿、橄榄油和正辛醇等。由于正辛醇的极性和溶解性能比其他惰性溶剂好[25]，更能模拟药物在体内分配的过程，故目前多采用正辛醇-水体系来测定药物的油水分配系数。

四、小结

本发明首次采用紫外分光光度法测定了农吉利碱的油水分配系数和水饱和溶解度，方法操作简单，测定准确可靠，为其制剂研究提供了一定的理论依据。

试验例2：农吉利碱凝胶剂处方筛选和制备工艺的研究

一、实验材料

（一）实验药品和试剂

农吉利碱原料药（纯度≥98%，批号：ZL120222YY，南京泽朗医药科技有限公司）

甲醇（色谱纯，批号：021120613，上海星可生化（高纯溶剂）有限公司

三乙胺（分析纯，批号：20111015，天津市永大化学试剂有限公司）

磷酸（分析纯，批号：20120129，上海凌峰化学试剂有限公司 ）

卡波姆-934（分析纯，批号：20120817，青岛天力源生物科技有限公司）

卡波姆-940（分析纯，批号：20120821，青岛天力源生物科技有限公司）

卡波姆-980（分析纯，批号：20120810，青岛天力源生物科技有限公司）

三乙醇胺（分析纯，批号：20061229，无锡海硕生物有限公司）

丙三醇（分析纯，批号：20110901，江苏强盛功能化学股份有限公司）

月桂氮卓酮（分析纯，批号：111001，天门科捷制药有限公司）

无水乙醇（分析纯，批号：20121113，上海凌峰化学试剂有限公司）

尼泊金甲酯（分析纯，批号：20120502，上海化学试剂采购供应五联化工厂）

生理盐水（批号：110713-1，浙江莎普爱思药业股份有限公司）

蒸馏水（自制）

其他试剂为分析纯

（二）实验器材

雷磁pH–S 3C pH计（上海精密科学仪器有限公司）

HPLC工作站（德国LUMTECH制备型高效液相色谱仪系统，LUMTECH化学工作站，K501泵，K2501紫外检测器）

JA1003电子天平（上海精密科学仪器有限公司）

KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）

YB-P6智能透皮仪试验仪（天津药典标准仪器厂制造）

HH-4数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）

（三）实验动物

大鼠（SD，200g左右，浙江中医药大学实验动物中心提供）

二、方法和结果

（一）剂型选择

农吉利碱是临床常用且研究较多的治疗皮肤癌的药物，疗效确切。因其注射或口服会产生较大的肝毒性等副作用，较大了限制了其的临床应用。然而民间仍采用其原药材直接外敷来治疗皮肤癌，毒性小且效果良好。鉴于这些特点，本发明拟将农吉利碱开发成一种方便有效的外用制剂，治疗皮肤癌。

临床中常用的外用制剂有软膏剂、霜剂、洗剂、擦剂、凝胶剂等。软膏剂和霜剂易造成涂布不均，污染衣物；洗剂和擦剂易挥发、流散，因而临床应用受到一定限制。凝胶剂作为目前常用的外用制剂，具有吸收速度快、生物利用度高、质地均匀、易于涂展和洗除、不污染衣物、不妨碍皮肤正常功能的特点。它能在较长时间内与用药部位紧密粘附，使制剂在静止时保持一定形状，在外力作用下又可流动、变形。在局部外用制剂中，往往利用这些性质来控制药物的释放或其对皮肤的粘附性。因此，本发明将农吉利碱制成凝胶剂，以期为皮肤癌的临床研究提供科学依据。

（二）农吉利碱凝胶剂体外透皮试验含量测定方法学的建立

1.色谱条件

色谱柱：Ultimate TM C18 (4.6mm×250 mm,5μm)

流动相：甲醇-0.5 %三乙胺水溶液 (pH 7.0) (30:70)

检测波长：216nm

柱温：室温

流速：0.8 mL·min?1

进样量：20μl

2.专属性考察

2.1对照品溶液的配置

精密称取农吉利碱13.6mg，置于50mL容量瓶中，加适量透皮接收液，超声，使溶解，并用透皮接收液定容至刻度，摇匀，作为农吉利碱对照品储备液，备用。精密移取0.3mL置于5mL容量瓶中，加透皮接收液定容至刻度，摇匀，作为农吉利碱对照品溶液。

2.2供试品溶液的配置

取农吉利碱凝胶剂透皮24h的透皮接收液3mL，用0.45μm的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。

2.3空白溶液的配置

取适量透皮接收液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得空白溶液。

取上述农吉利碱对照品溶液，供试品溶液和空白溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液分别按照上述色谱条件进样，记录色谱图。如下图2-1、图2-2、图2-3所示。

结果表明，农吉利碱的色谱峰与相邻的色谱峰能很好的分离，空白透皮接收液在相应的保留时间下无色谱峰，不干扰药物的测定，该方法可行。

3.方法学考察

3.1标准曲线绘制

分别移取不同体积的上述储备液配制成浓度为5.44、10.88、21.76、43.52、87.04、174.08μg·mL-1的系列标准溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，按上述色谱条件分别进样，记录色谱图峰面积A。

以农吉利碱标准溶液浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，其回归方程为：y=6.1773x-24.077，r=0.9997，结果表明，农吉利碱在5.44～174.08μg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系。标准曲线如下图2-4所示。

3.2精密度试验

精密移取0.4mL上述储备液置于5mL容量瓶中，用透皮接收液定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液按上述色谱条件，连续测定6次，记录色谱图峰面积，计算日内精密度。连续五日每日同法测定一次，记录色谱图峰面积A，计算日间精密度。结果见表2-1，2-2，日内精密度、日间精密度的RSD均小于2%，表明检测方法可靠，仪器精密度良好。

表2-1 (n=6)

表2-2 (n=5)

3.3稳定性试验

精密移取农吉利碱凝胶剂透皮24h的透皮接收液0.3mL，置于5mL容量瓶中，用透皮接收液定容至刻度，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液按照上述色谱条件进样，于取样后24h内测定6次，记录色谱图峰面积A，计算RSD。结果见表2-3所示，稳定性RSD=0.78%，24h内样品稳定。

表2-3 (n=6)

3.4 重复性试验

精密移取6份农吉利碱凝胶剂24h的透皮接受液，各0.3mL，置于5mL容量瓶中，用透皮接收液定容至刻度，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液按照上述色谱条件进样，记录色谱图峰面积A，计算RSD。结果见表2-4所示，重复性RSD=1.60%，该方法重现性好。

表2-4(n=6)

3.5加样回收率试验

精密移取已知含量的农吉利碱凝胶剂24h时的透皮接受液0.3mL，平行移取6份，置于5mL容量瓶中；另分别各加入上述对照品储备液0.4mL，加适量透皮接收液，定容至刻度，备用。

分别取适量上述溶液，共6份，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液按上述色谱条件分别进样，记录色谱图峰面积A。平行测定六次，根据回归方程计算出相应浓度和含量，并计算回收率、平均回收率及RSD。结果见表2-5所示，平均回收率为101.84%，RSD为1.37%，该方法回收率高，可用于体外透皮的含量测定。

表2-5(n=6)

注：加样回收率（%）=（测得的总量-样品中的量）/加入的量*100%

（三）农吉利碱凝胶剂体外透皮试验方法的建立

1.透皮接收液

为了模拟皮肤的内环境，在体外透皮渗透实验中，一般采用生理盐水作为接受液。本实验亦采用生理盐水作为其体外释放介质。

2.体外透皮装置

在透皮制剂研究中主要利用透皮扩散池模拟药物在体透皮过程，用来测定药物的释药性质并筛选处方。扩散池主要由供给室（donor cell）和接收室（receptor cell）两部分组成，皮肤样品夹持在两室之间，在供给室内装入制剂，在接收室内放入体外释放介质。试验装置采用药物透皮扩散试验仪，立式Franz扩散池。接受室体积为17mL，透皮有效扩散面积为1.54cm2。

3.离体鼠皮的制备

取200g左右雄性大鼠，用剪刀仔细剪去腹部皮肤上的毛，尾静脉注射空气处死，并将腹部皮肤剥离，用镊子仔细去除皮下脂肪及筋膜后洗净，置于生理盐水中，在-20℃条件下保存，于1周内用完。实验前需仔细检查鼠皮的完整性，实验过程中，不得使用有破损的皮肤。

4.体外透皮试验

影响药物透皮吸收的因素有两个：一、生理因素：包括皮肤的水合作用、角质层的厚度、皮肤的完整性等；二、药物及剂型因素：包括药物剂量、药物理化性质、辅料组成和剂型的影响。

处理好的大鼠皮肤，角质层向上，固定在透皮仪的Franz扩散池上，在角质层一面均匀涂上按实验方案制备的农吉利碱外用凝胶约2g（需排除气泡），有效扩散面积为1.54cm2，在接受池中加入生理盐水17mL，做接收液。将扩散池置32℃恒温水浴中，搅拌速度300r/min，分别在 1、2、4、8、12、24h 取样3mL，并补充同温度同体积生理盐水。所取样品用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按照本部分体外释放含量测定方法，测定透皮接收液中农吉利碱的含量。

5.数据处理方法

按下式计算出一定时间单位面积的累计透过量。

Qs：第n次取样时单位面积累积渗透量

Cn：第n次取样时接受液中的浓度

Ci：第i次取样时接受液中的浓度

V0：扩散池体积

V：取样体积

S：扩散面积。

本实验中有效扩散面积S=1.54cm2；扩散池体积V0=17mL；取样体积V=3mL；第n次取样时接受液中的浓度Cn和第i次取样时接受液中的浓度Ci均由液相测得。

（四）农吉利碱凝胶剂的处方筛选

1.主药的加入量

根据临床所用农吉利碱外敷粉剂的剂量，通过剂量转换，确定将农吉利碱制成1.2mg/g的凝胶剂。

2.凝胶基质的选择

水性凝胶基质易于涂布和洗除，无油腻感，能吸收组织渗出液，不妨碍皮肤正常生理机能，药物释放快。目前常用的凝胶基质有卡波姆、CMC-Na、PVP、PVA等，其中以卡波姆最为常见。

卡波姆(Carbomer)，又名卡波普(Carbopol)，系丙烯酸与丙烯基蔗糖交联的高分子聚合物，为白色、疏松、吸湿性强和具特殊臭味的粉末，能溶于水、乙醇、甘油。因其具有无毒无刺激性，与皮肤有良好粘附性的特点，目前多采用卡波姆作为水凝胶的基质。同时，用卡波姆制备的凝胶剂具有外观透明、细腻、粘附力强、滞留时间长、涂布后皮肤舒适、干燥快、易洗除、不污染衣物和皮肤、对皮肤和粘膜无刺激性等优点，适用于皮肤局部的外用。目前外用的规格有卡波姆910、934、940、941、954、980、981等，最常用的有卡波姆934、940和980。

本实验选择了卡波姆934、940和980进行考察，浓度为0.5%、0.75%和1.0%。

3.保湿剂的选择

凝胶剂在存放过程中易出现湿水而导致涂布性变差，故需要在制备过程中加入保湿剂。同时，加入保湿剂后，不仅有利于皮肤保湿，而且能够保持凝胶剂的含水量，维持剂型稳定。目前最常用的保湿剂主要有甘油、丙二醇、丁二醇、聚乙二醇等多元醇类。

本实验选择了最常用的甘油作为保湿剂进行考察，浓度范围为5%、10%和15%。

4.pH调节剂的选择

卡波姆在水中溶胀后，其胶体溶液为酸性溶液，故需加如碱液，便于使卡波姆基质形成透明、稠厚的基质。目前常用的pH调节剂主要为NaOH及三乙醇胺，在预实验过程中，发现使用NaOH会使凝胶黏度下降，不利于涂布；三乙醇胺是温和pH调节剂，除中和作用外，还有增稠、增粘、乳化等作用，可保持卡波姆的粘稠度和药物稳定性，因此优选三乙醇胺作为pH调节剂。

皮肤可耐受的pH为4～9，同时pH值对凝胶剂的黏度有比较大的影响，综合考虑凝胶黏度和皮肤的因素，将pH选定为6.5±1.0。

5．透皮促进剂的选择

促进药物透皮的方法有药剂学方法、物理学方法、化学方法和生物学方法。其中透皮促进剂是目前应用最广的药剂学方法，它是一种能可逆地改变皮肤角质层屏障功能，且不损害皮肤细胞的化学物质，能提高皮肤角质层的水合作用，增加药物分子在皮肤中的穿透力；也可以通过膨胀和软化角质层，增大表皮汗腺和毛囊的开口，促进药物分子的通过。常用的透皮促进剂主要分为以下几类：1.有机溶剂类:乙醇、丙二醇等；2.脂肪酸类：油酸、亚油酸等；3.氮酮及其类似物；4.表面活性剂:阳离子型、阴离子型、非离子型等；5.角质保湿与软化剂：尿素、水杨酸等；6.萜烯类：薄荷醇、樟脑等。

目前使用最多的透皮促进剂为氮酮(Azone)，它对亲脂性和亲水性药物都具有显著的促渗作用，其透皮作用机理主要是影响了皮肤角质层中扁平角化细胞的有序叠集结构，主要是作用于其中类脂双分子层，使之完全流化，让药物通过。氮酮在低浓度就能极大增强药物的透皮作用，高浓度时作用反而减弱。

本实验选择了1%，3%，5%三个不同浓度的氮酮浓度进行透皮效果的考察。

6.防腐剂的选择

凝胶剂因其含水量高，容易被细菌或霉菌等微生物污染而发生变质，故需要加入防腐剂。本实验选择了尼泊金甲酯作为防腐剂，选择其浓度为0.5%。

（五）农吉利碱凝胶剂的制备工艺研究

1.不同型号的卡波姆的考察

分别取卡波姆934、940和980，分次均匀撒在水面上，密闭，静置过夜，使其充分溶胀，搅拌下缓慢滴加三乙醇胺溶液，调节pH至7.0，形成凝胶基质。三种规格的卡波姆分别制成0.5%、0.75%和1.0%三个浓度的基质。将这些凝胶基质进行皮肤涂布实验，根据凝胶在重力作用下的自然流动性情况，粗略地将其按粘性分为四个等级，见表2-6。以凝胶基质的外观和粘性为指标，考察上述9种凝胶基质，结果见表2-7。

表2-6

表2-7

结果表明，三种规格的卡波姆在浓度为0.5%、0.75%和1.0%时，均可形成透明的凝胶状基质。卡波姆-940制成的凝胶具有更大的粘性，能更好地满足皮肤局部治疗的要求。因此，选择了卡波姆-940为农吉利碱凝胶剂基质。

2.卡波姆浓度的考察

为找出合适的卡波姆浓度，制备了不同浓度卡波姆-940的凝胶，其余辅料按照处方量称取，按凝胶剂体外释放实验项下进行体外释放实验，以24h单位面积累积释放量为指标筛选最佳的卡波姆浓度，结果如下图2-5所示，卡波姆浓度对于农吉利碱凝胶剂的透皮量影响较大，0.75%浓度的卡波姆累积释放量最大。

3.保湿剂的考察

为考察保湿剂对透皮效果的影响，固定卡波姆浓度为0.75%，其余辅料按照处方量称取，制备不同浓度甘油的凝胶，按凝胶剂体外释放实验项下进行体外释放实验，以24h单位面积累积释放量为指标筛选最佳的甘油浓度，结果如下图2-6所示，10%的丙三醇浓度下药物透过量最高。

4.渗透促进剂的考察

为考察渗透促进剂对透皮效果的影响，固定卡波姆浓度为0.75%，丙三醇浓度为10%，制备三种不同浓度氮酮的凝胶，按凝胶剂体外释放实验项下进行体外释放实验，以24h单位面积累积释放量为指标筛选最佳的氮酮浓度，结果如下图2-7所示，农吉利碱的透过量随着氮酮浓度的增加而增加，5%浓度下透过量最高。

5.正交设计优选处方

在处方初步设计和单因素考察的基础上，采用正交设计法优选处方。设置3个主要影响透皮效果的因素，A为卡波姆-940浓度，B为甘油浓度，C为氮酮浓度。每个因素设置3个水平，因素水平表见表2-8。

表2-8

采用三因素三水平正交表，安排9个处方分别制成凝胶剂，以24h单位面积累积透过量为指标筛选最佳处方。结果见表2-9和图2-8。

表2-9

方差分析结果如下表2-10。

表2-10

方差分析及直观分析结果相同，结果表明，对农吉利碱凝胶剂体外经皮渗透性能影响的大小顺序为C>A＞B，即氮酮浓度对农吉利碱凝胶剂体外经皮渗透性能影响最大，其次为卡波姆浓度，影响最小的是甘油浓度。最佳组合为A1B3C3，即农吉利碱凝胶剂制剂工艺为卡波姆-940浓度0.5%，甘油浓度15%，氮酮浓度5%。由该处方制得的凝胶剂易于涂布，黏度适宜，可用于皮肤给药。

6.验证试验

按照卡波姆浓度0.5%，甘油浓度15%，氮酮浓度5%制备农吉利碱凝胶剂，按凝胶剂体外释放实验项下进行体外释放实验，计算24h单位面积累积释放量。验证试验结果见下表2-11和图2-9。

表2-11 (n=6)

（六）农吉利碱凝胶剂的制备

1．最佳处方

农吉利碱         1.2g

卡波姆-940       5.0g

甘油             150mL

氮酮             50mL

无水乙醇         250mL

尼泊金甲酯       5.0g

三乙醇胺         适量

蒸馏水加至       1000g

2．制备方法

取卡波姆-940加适量蒸馏水浸泡，充分溶胀后得到卡波姆胶状物后；另取处方量甘油、氮酮、尼泊金甲酯等在水浴上搅拌，与卡波姆溶液混匀成为凝胶基质；另取处方量农吉利碱，使其溶于乙醇中；将上述药液缓缓加入凝胶基质中混匀，采用三乙醇胺调节凝胶pH值至中性，边加蒸馏水边搅拌至足量，得到农吉利碱凝胶剂。

三、分析与讨论

1.卡波姆-940作为常用的水凝胶基质，具有易于涂布，无刺激性，表观均匀等优点。本发明采用卡波姆-940制得的农吉利碱凝胶剂方法可行，操作简单，适合作为皮肤给药制剂的基质。

2.因卡波姆具有很好的溶胀特性，需将其在水中静置12h以上，保证其充分溶胀。其水溶液呈酸性，若不对其中和，会对皮肤带来一定的刺激性，故需用碱溶液对其中和，本发明以三乙醇胺作为pH调节剂，将凝胶剂调至中性。

3.对24小时取样的透皮样品测定时，无法测出第1小时，第2小时样品的透皮量，可能是因为HPLC检测灵敏度不够导致无法测出，故在计算24h单位面积累积透过量时，会产生一定的误差。

4.每次实验采用的鼠皮来源于同一只大鼠，减少皮肤个体差异带来测量的影响；皮肤不可剪破，且应与扩散池中的透皮接收液充分接触，防止气泡产生，否则影响经皮渗透。

四、小结

本发明建立的农吉利碱体外透皮的含量测定方法，其方法准确可靠，精密度高，可行性好；以24h单位面积累积释放量为考察指标，更能表征药物的皮肤透过性能；通过单因素考察和正交设计，筛选了凝胶剂的辅料，确定其最佳处方最终确定农吉利碱外用凝胶的最佳处方为：0.5%卡波姆-940+15%甘油+5%氮酮+25%无水乙醇及少量尼泊金甲酯，用三乙醇胺调pH至中性。凝胶剂的制剂工艺操作简单，研究方法科学、稳定、可行。

试验例3：农吉利碱凝胶剂的质量评价

一、实验材料

（一）实验药品和试剂

农吉利碱原料药（纯度≥98%，批号：ZL120222YY，南京泽朗医药科技有限公司）

甲醇（色谱纯，批号：021120613，上海星可生化（高纯溶剂）有限公司

三乙胺（分析纯，批号：20111015，天津市永大化学试剂有限公司）

磷酸（分析纯，批号：20120129，上海凌峰化学试剂有限公司）

卡波姆-934（分析纯，批号：20120817，青岛天力源生物科技有限公司）

卡波姆-940（分析纯，批号：20120821，青岛天力源生物科技有限公司）

卡波姆-980（分析纯，批号：20120810，青岛天力源生物科技有限公司）

三乙醇胺（分析纯，批号：20061229，无锡海硕生物有限公司）

丙三醇（分析纯，批号：20110901，江苏强盛功能化学股份有限公司）

月桂氮卓酮（分析纯，批号：111001，天门科捷制药有限公司）

无水乙醇（分析纯，批号：20121113，上海凌峰化学试剂有限公司）

尼泊金甲酯（分析纯，批号：20120502，上海化学试剂采购供应五联化工厂）

生理盐水（批号：110713-1，浙江莎普爱思药业股份有限公司）    

蒸馏水（自制）

其他试剂为分析纯

（二）实验器材

雷磁pH–S 3C pH计（上海精密科学仪器有限公司）

HPLC工作站（德国LUMTECH制备型高效液相色谱仪系统，LUMTECH化学工作站，K501泵，K2501紫外检测器）

JA1003电子天平（上海精密科学仪器有限公司）

KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）

YB-P6智能透皮仪试验仪（天津药典标准仪器厂制造）

HH-4数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）

YXJ-2型高速离心机（常州金壇电讯电器厂）

NDJ-1旋转黏度计（上海天平仪器厂）

（三）实验动物

大鼠（SD，200g左右，浙江中医药大学实验动物中心提供）

二、实验方法和结果

（一）农吉利碱凝胶剂含量测定方法的建立

1．色谱条件

色谱柱：Ultimate TM C18 (4.6mm×250 mm,5μm)

流动相：甲醇-0.5 %三乙胺水溶液 (pH 7.0) (30∶70)

检测波长：216nm

柱温：室温

流速：0.8 mL·min?1

进样量：20μl

2．专属性考察

2.1对照品溶液的配置

精密称取农吉利碱8.0mg，置于50mL容量瓶中，加适量流动相，超声，使溶解，加流动相定容至刻度，摇匀，作为农吉利碱储备液，备用。精密移取1.6mL置于5mL容量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，作为农吉利碱对照品溶液。

2.2供试品溶液的配置

取农吉利碱凝胶剂（实施例1制得）0.1g，精密称定，置于5mL容量瓶中，加适量甲醇，超声，使溶解，加流动相定容至刻度，摇匀，作为农吉利碱凝胶剂溶液。

2.3空白溶液的配置

取空白凝胶剂0.1g，精密称定，置于5mL容量瓶中，加适量甲醇，超声，使溶解，加流动相定容至刻度，摇匀，作为空白凝胶溶液。

取上述对照品溶液，供试品溶液和空白溶液，分别用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液分别按照上述色谱条件进样，记录色谱图。见图3-1，图3-2，图3-3。

结果表明，农吉利碱的色谱峰与相邻的色谱峰能很好的分离，空白凝胶溶液在相应的保留时间下无色谱峰，凝胶剂中的各辅料不干扰药物的测定，该方法可行。

3．方法学考察

3.1标准曲线绘制

分别移取不同体积的上述储备液配制成浓度为1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2、102.4μg·mL-1的系列标准溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液， 取续滤液，按上述色谱条件分别进样，记录色谱图峰面积A。

以农吉利碱标准溶液浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，其回归方程为：y=6.4059x+4.7605，r=0.9998，结果表明，农吉利碱在1.6～102.4μg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系，标准曲线如下图3-4所示。

3.2精密度试验

精密移取1.6mL上述母液置于5mL容量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液按上述色谱条件，连续测定6次，记录色谱图峰面积，计算日内精密度。每日同法测定一次，记录色谱图峰面积A，计算日间精密度。结果见表3-1，3-2所示，日内精密度、日间精密度的RSD均小于1%，表明检测方法可靠，仪器精密度良好。

表3-1 (n=6)

表3-2(n=5)

3.3稳定性试验

称取农吉利碱凝胶剂约1g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加适量流动相，超声使溶解并定容至刻度，摇匀。取0.5mL凝胶剂溶液于5mL容量瓶中，流动相定容至刻度，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液按上述色谱条件进样，于配制后24h内测定6次，记录色谱图峰面积A，计算RSD。结果见表3-3，稳定性RSD=1.25%，24h内样品稳定。

表3-3 (n=6)

3.4重复性试验

称定农吉利碱凝胶剂约1g，平行称取6份，均置于25mL容量瓶中，加适量流动相，超声使溶解，用流动相定容至刻度，摇匀。分别各移取0.5mL凝胶剂溶液于5mL容量瓶中，流动相定容至刻度，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液按上述色谱条件进样，记录色谱图峰面积A，计算RSD。结果见表3-4，重复性RSD=1.60%，该方法重现性好。

表3-4 (n=6)

3.5加样回收率试验

称定已知含量的农吉利碱凝胶剂约1g，平行称取6份，均置于25mL容量瓶中，加适量流动相，超声使溶解，用流动相定容至刻度，分别各移取0.5mL凝胶剂溶液于6个5mL容量瓶中，再分别加入0.5mL储备液，用流动相定容至刻度。用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液按上述色谱条件分别进样，记录色谱图峰面积A。平行测定六次，根据回归方程计算出相应浓度和含量，并计算回收率、平均回收率及RSD。结果见表3-5，平均回收率为100.75%，RSD为0.82%，该方法回收率高，可作为农吉利碱凝胶剂的含量测定方法。

表3-5(n=6)

注：加样回收率（%）=（测得的总量-样品中的量）/加入的量*100%

对实施例2和3制得的农吉利碱凝胶剂进行如试验例3相同的试验，其最后也能达到与实施例1相同的技术效果。

试验例4：药效试验

1.试验设计

在皮肤鳞癌的动物模型建立中常用的动物如裸鼠、VX2白兔、小鼠等，常用的诱癌物质有DMBA、紫外线。本试验以昆明小鼠为实验动物，以7，12-二甲基苯并蒽（DMBA）为致癌剂，巴豆油为致癌诱导剂，采用此经典的小鼠二阶段致癌模型，观察和评价农吉利碱治疗鳞状细胞癌的疗效。

2.小鼠鳞状细胞癌动物模型的造模

根据文献所述，实验动物为昆明种小鼠，16～18g，雌雄各半，共96只，分成6组，每组16只。试验始发阶段，各组均给相同剂量的DMBA，即在第1天，第7天和第14天，分别将DMBA-丙酮液（150μg/200μl）涂抹于小鼠背部脱去毛发暴露的皮肤处（脱毛于涂药前1d进行），共3次；促癌阶段各组均给同剂量的巴豆油，即第3周起，在相同部位涂抹巴豆油丙酮液（0.25%），每次200μl/只，每周二、五涂布巴豆油丙酮液，周六记录每鼠肿瘤数，直至实验结束。第六周开始给药，连续给药两周。

3.动物给药方案

给药于第六周开始，给药持续两周，每组给药方案如下：模型组（全程背部涂抹致癌剂以及致癌诱导剂，不给药），阳性组（环磷酰胺2.5mg/kg，0.1mL/10g体重，腹腔注射），阴性组（空白凝胶剂，0.1g/10g体重，背部涂抹），高剂量组（1.2mg/g的凝胶剂，0.1g/10g体重，背部涂抹），中剂量组（0.6mg/g的凝胶剂，0.1g/10g体重，背部涂抹），低剂量组（0.3mg/g的凝胶剂，0.1g/10g体重，背部涂抹）。本试验中的凝胶剂由实施例1制得。

4.疗效评价

根据鳞状细胞癌的相关文献所述，采用如下评价指标。荷瘤鼠数：每组发生乳头状瘤的小鼠数目；平均荷瘤数：每组小鼠发生乳头状瘤的总和，本组小鼠总数*100％；抑瘤率： (各组平均荷瘤数-对照组平均荷瘤数)/对照组平均荷瘤数*100％。

5.试验结果

实验第5周起，各组小鼠背部陆续发现乳头状瘤，以后肿瘤诱发率和每鼠荷瘤数逐渐增加。实验结束时，各组肿瘤诱发率均达到80%以上。

模型组小鼠和阴性组小鼠每鼠平均荷瘤数最高，分别为5.19个/只和6.07个/只。阳性组和高、中、低剂量组小鼠与对照组小鼠相比，每鼠平均荷瘤数明显降低。抑瘤率结果表明，农吉利碱凝胶剂对小鼠鳞状细胞癌具有一定的抑制作用，且抑瘤率与剂量呈正相关性。其中阳性组、高剂量组与对照组相比，具有显著性差异（P＜0.05）。见表4-1。

表4-1  农吉利碱凝胶剂药效结果

注：与模型组相比* p＜0.05

初步药效学研究表明，农吉利碱凝胶剂对小鼠鳞状细胞癌具有一定的抑制效果，给药组荷瘤数明显降低，且抑瘤率随着给药剂量的增加而增强，对鳞状细胞癌具有一定的治疗效果。同时，凝胶剂给药方便，操作简单，这些都为农吉利碱的临床开发应用提供了科学依据。

Claims (2)

1.农吉利碱凝胶剂，其特征在于每一千克凝胶剂中含有：

农吉利碱1.2g、卡波姆-940  5g、甘油150ml、氮酮50ml、无水乙醇250ml、尼泊金甲酯5g和蒸馏水余量，并用三乙醇胺调pH至中性。

2.如权利要求1所述的农吉利碱凝胶剂的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）取配方量的卡波姆-940加蒸馏水浸泡，充分溶胀后得到卡波姆胶状物；

2）取配方量的甘油、氮酮、尼泊金甲酯在水浴上搅拌，与卡波姆胶状物混匀成为凝胶基质；

3）取配方量的农吉利碱，使其溶于配方量的无水乙醇中；

4）将步骤3）得到的药液缓缓加入步骤2）得到的凝胶基质中混匀；

5）采用三乙醇胺调节凝胶pH值至中性，边加蒸馏水边搅拌至足量，得到农吉利碱凝胶剂。