CN103509864A - 一种区分鉴定大白菜、结球甘蓝FLCs基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种区分鉴定大白菜、结球甘蓝FLCs基因的方法。该方法包括（1）根据已公布的拟南芥、白菜和甘蓝FLCs基因序列，对白菜和甘蓝FLCs基因外显子4和外显子7区段设计引物，合成引物序列；（2）提取不同基因型大白菜和结球甘蓝的基因组DNA，以其为模板进行上述引物的PCR扩增；（3）扩增产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳分离检测；（4）筛选能够区分大白菜、结球甘蓝FLCs基因的引物；（5）利用FLCs基因的特异引物鉴定大白菜—结球甘蓝异源三倍体杂交种FLCs基因组成。本发明实现了对大白菜、结球甘蓝8个FLCs同源基因的全面、有效鉴定，为进一步研究不同FLCs基因对抽薹开花等的作用提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种区分鉴定大白菜、结球甘蓝FLCs基因的方法，属于分子遗传学理论应用与育种技术领域。
背景技术
结球甘蓝为绿体春化型，通常在7~9片叶或茎粗达到6mm时才能感受低温，接受6~8周持续低温才能完成春化诱导开花。大白菜为种子春化型，萌动的种子即可感受低温诱导开花，其春化温度一般也比结球甘蓝高。拟南芥研究结果显示，对春化需求的不同很大程度上取决于FLC（FLOWERING LOCUS C）基因，同时很多控制开花的基因功能也都是通过调节FLC来实现的，是植物开花研究中的热点。FLC在拟南芥中只有1个拷贝，即AtFLC，位于第5条染色体上。Schranz等（2002）在白菜中克隆到4个AtFLC同源基因：BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3和BrFLC5，在甘蓝中分离到3个AtFLC同源基因：BoFLC1、BoFLC2和BoFLC5。之后Lin等（2005）在甘蓝中分离得到BoFLC3-2和BoFLC4-1。根据www.ncbi.nlm.nih.gov和www.brassicadb.org/brad/上已公布的白菜和甘蓝FLCs基因序列，利用DNAMAN比对与MEGA5.0邻近结合法比较系统发育分析， 结果表明BoFLC2与BoFLC4-1的同源性非常高。Okazaki等（2007）在甘蓝中分离得到BoFLC2，其结果表明：BoFLC2与BoFLC4-1的同源性高达98%，推测二者的归类不同是由于Lin等参照了有限的氨基酸序列信息所致。因此本发明开展了大白菜、结球甘蓝 FLC1、FLC2、FLC3、FLC5的区分鉴定。
目前在白菜和甘蓝中分别开展FLCs基因的研究报道很多，但同时开展大白菜和结球甘蓝FLCs同源基因区分鉴定的研究还鲜有报道。仅姚远颋等（2009）以白菜型油菜、甘蓝为材料，利用基因中某碱基差异设计SNP引物对来自白菜型油菜和甘蓝的FLC1与FLC3基因进行了分型（即区分鉴定白菜型油菜和甘蓝的FLC），每一个基因的分型需要2对引物，没有涉及这一基因家族其他基因。将该SNP特异引物应用到本研究试验材料的FLCs鉴别，其中3对引物（FW1-RN2、F3-RC3、F3-RA3）未能得到扩增产物，1对引物（FN2-RW1）扩增得到3500bp左右的非目的扩增产物，即不能用于区分大白菜与结球甘蓝FLCs基因。
发明内容
本发明以我国广泛种植的不同类型大白菜和结球甘蓝为试材，利用FLCs外显子4的多态性区设计正向引物，在外显子7保守区设计反向引物，首次实现了对大白菜和结球甘蓝BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3、BrFLC5、BoFLC1、BoFLC2、BoFLC3和BoFLC5基因的全面、准确鉴定。为进一步探究大白菜（种子春化）与结球甘蓝（绿体春化）春化机制，深入研究每个FLC基因对抽薹开花的作用，以及大白菜与结球甘蓝FLCs同源基因的互作提供技术支撑，为近缘种属同源基因研究提供新思路。
本发明的基本原理是：利用白菜与甘蓝FLCs基因序列，在多态性和保守性区段分别设计正、反向引物，根据扩增产物的大小差异，达到区分鉴定大白菜、结球甘蓝FLCs基因的目的。
本发明的特点是：（1）全面性。区分鉴定了大白菜与结球甘蓝8个同源基因，即BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3、BrFLC5、BoFLC1、BoFLC2、BoFLC3和BoFLC5；（2）简便性。利用一对引物即可以区分大白菜和结球甘蓝的相应FLC基因；（3）广谱性。本发明采用多个类型大白菜和多个类型结球甘蓝为材料，筛选出区分大白菜和结球甘蓝各FLC基因的特异引物，体现了广泛的适用性。
本发明通过以下步骤完成：
（1）根据已发表的的拟南芥、白菜和甘蓝FLCs基因序列，以外显子4的多态性区段（图1）设计正向引物，在外显子7的保守区段（图2）设计反向引物，并合成引物；
（2）改良CTAB法提取不同基因型大白菜和结球甘蓝的基因组DNA，以其为模板进行上述引物的PCR扩增，每个PCR反应体系为20μL。20μL PCR体系为：10×PCR Buffer（含Mg2+）2μL；dNTPs（10mmoL/L）1.6μL；Forward primer（50ng/μL）1μL；Reverse primer（50ng/μL）1μL；TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL；模板DNA（50ng/μL）2μL；ddH2O补足20μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，55~60 ℃复性45s，72℃延伸60~90s，35个循环；72℃延伸8 min，4℃保存；
（3）扩增产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳分离检测；
（4）筛选出能够区分大白菜、结球甘蓝FLCs基因的特异引物，其筛选标准如下：在大白菜和结球甘蓝中分别扩增出与目的基因片段大小一致的扩增产物，且该产物大小在大白菜和结球甘蓝中不同。将符合标准引物的扩增产物回收测序，与已公布的FLC基因比对，确定扩增产物为相应的目的基因片段。特异引物序列见表1。
本发明以我国广泛种植的大白菜和结球甘蓝为试材，开展抽薹开花关键基因FLCs的区分鉴定，其方法实用、步骤具体，适用基因型广泛，重复性好。较已公布的区分白菜型油菜和甘蓝的FLC1与FLC3基因方法简便，且能够区分FLCs全部同源基因，为进一步探究大白菜（种子春化）与结球甘蓝（绿体春化）春化机制，深入研究每个FLC基因对抽薹开花的作用，以及大白菜与结球甘蓝FLCs同源基因的互作等研究提供必要的技术支撑。
附图说明
图1为 FLCs外显子4部分序列比对结果。
图2为 FLCs外显子7部分序列比对结果。
图3为 FLC1特异引物在大白菜、结球甘蓝中的扩增结果。
图4为 FLC2特异引物在大白菜、结球甘蓝中的扩增结果。
图5为 FLC3特异引物在大白菜、结球甘蓝中的扩增结果。
图6为 FLC5特异引物在大白菜、结球甘蓝中的扩增结果。
图3-6中的标号含义是：M1：Marker DL5000；A1：多4；A2：新津绿75；A3：油绿3号；A4：秋珍白一号；C1：11-1；C2：8398；C3：蓝宝；C4：晚丰；M2：Marker DL2000。
图7为FLC1特异引物在大白菜—结球甘蓝异源三倍体杂交种及其亲本中的扩增结果。
图8为FLC2特异引物在大白菜—结球甘蓝异源三倍体杂交种及其亲本中的扩增结果。
图9为FLC3特异引物在大白菜—结球甘蓝异源三倍体杂交种及其亲本中的扩增结果。
图10为FLC5特异引物在大白菜—结球甘蓝异源三倍体杂交种及其亲本中的扩增结果。
图7-10中的标号含义是：A：多4；C： 11-1；H：大白菜—结球甘蓝异源三倍体杂交种；M：Marker DL2000。
具体实施方式
按照本发明的技术方案，具体实施步骤为：
（1）根据www.ncbi.nlm.nih.gov和www.brassicadb.org/brad/上已发表的拟南芥、白菜和甘蓝FLCs基因序列，筛选出具代表性的各个FLC基因：拟南芥AtFLC基因（AT5G10140）、白菜BrFLC1（AY115678），BrFLC2（AY115676），BrFLC3（AY115677），BrFLC5（AY115675）和甘蓝BoFLC1（AY115674），BoFLC2（DQ222849），BoFLC3（AY115673），BoFLC5（AY115672）。DNAman比对分析序列间的差异，并结合内含子和外显子的大小的结构差异分析，结果表明FLC1、FLC2、FLC3、FLC5基因的外显子4至外显子7具有最好的可区分性：首先，外显子4具有在各基因间存在稳定多态性的区段，外显子7具有在各基因间高度保守性的区段；其次，能够保证相应基因在白菜和甘蓝中扩增产物大小存在差异。利用Primer premer 5.0设计白菜和甘蓝的FLCs基因引物，以外显子4的多态性的区段设计正向引物，以外显子7保守区设计反向引物。引物序列由上海生工生物技术有限公司合成；
（2）大白菜商品种：高桩直筒品种新津绿75，中熟筒形叠抱品种油绿3号，早熟矮桩叠抱品种秋珍白一号；结球甘蓝商品种：春季早熟品种8398，春夏季圆球型中熟品种蓝宝，秋季晚熟品种晚丰甘蓝；大白菜—结球甘蓝异源三倍体杂交种及其亲本大白菜自交系‘多4’，结球甘蓝自交系‘11-1’。采用改良CTAB法提取上述材料基因组DNA。以这些材料基因组DNA为模板，以设计的FLCs引物进行PCR扩增，每个PCR反应体系为20μL，10×PCR Buffer（含Mg2+）2μL；dNTPs（10mmoL/L）1.6μL；Forward primer（50ng/μL）1μL；Reverse primer（50ng/μL）1μL；Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL；模板DNA（50ng/μL）2μL；ddH2O补足20μL。PCR扩增程序为，94℃预变性3min；94℃变性45s，55~60℃复性45s，72℃延伸60~90 s，35个循环；72℃延伸8min，4℃保存；
（3）扩增产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳分离检测，并照相；
（4）将与目的基因片段大小一致的扩增产物分别回收测序，并与已发表的FLC基因资料比对，确定扩增产物为相应的目的基因片段，从而筛选出区分大白菜和结球甘蓝FLCs基因的合适引物。其筛选标准如下：在大白菜和结球甘蓝中分别扩增出与目的基因片段大小一致的扩增产物，且该产物大小在大白菜和结球甘蓝中不同，扩增产物回收测序，与已公布的FLC基因比对，确定扩增产物为相应的目的基因片段。FLCs基因的特异引物在结球甘蓝和大白菜中的扩增结果如图3。通过对相应的扩增产物测序，并结合DNAman与NCBI相应的基因比对分析的结果表明：FLC1特异性引物在结球甘蓝中扩增得到了760 bp和1000 bp左右的片段，其中760 bp左右的扩增产物的测序结果与NCBI中BoFLC1基因（登录号AY115674.1）序列基本一致，同源性达95.48%，1000 bp左右的扩增产物测序结果表明非BoFLC1；而大白菜中扩增得到1040 bp左右大小片段，测序结果经分析与NCBI中BrFLC1基因（登录号AY115678.1）序列基本一致，同源性达98.71%；FLC2特异性引物在结球甘蓝中扩增得到了1690 bp左右大小片段，测序结果经分析与NCBI BoFLC2基因（登录号DQ222849.1）序列基本一致，同源性达99.15%。而大白菜扩增出1360 bp左右大小片段，测序结果经分析与NCBI中BrFLC2基因（登录号AY115676）序列基本一致，同源性达99.60%；FLC3特异性引物在结球甘蓝中扩增得到了1090 bp左右大小片段，其序列与NCBI中BoFLC3基因（登录号AY115673.1）序列基本一致，同源性达96.78%。而大白菜扩增出980 bp左右大小片段，其序列与NCBI中BrFLC3基因（登录号AY115677.1）序列基本一致，同源性达96.60%；FLC5特异性引物在结球甘蓝中扩增得到了1390 bp左右大小片段，测序结果经分析与NCBI中BoFLC5基因（登录号AY115672.1）序列基本一致，同源性达96.45%。大白菜扩增出1580 bp左右大小片段，测序结果经分析与NCBI中BrFLC5基因（登录号AY115675.1）序列基本一致，同源性达95.52%；
（5）利用能够区分大白菜和结球甘蓝FLCs基因的特异引物，以异源三倍体杂交种及其亲本大白菜、结球甘蓝基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果表明异源三倍体杂交种同时扩增出亲本结球甘蓝和大白菜相应的FLC基因产物（图4）。
表1 FLCs特异引物序列
| 基因 | 正向引物序列 | 反向引物序列 |
| FLC1 | CTTGAGGAATCAAATGTCGATAA | TAATTAAGYAGYGGGAGAGTYAC |
| FLC2 | TAAGCTTGTGGAATCAAATTCTG | ATTTTATCAGCTTCGGCTC |
| FLC3 | GTGGAATCAAATGTCGGTGGT | TAATTAAGYAGYGGGAGAGTYAC |
| FLC5 | AATTGTCGATGTAAGCGTGG | TAATTAAGYAGYGGGAGAGTYAC |
区分大白菜、结球甘蓝FLC1的引物序列为5'- CTTGAGGAATCAAATGTCGATAA-3'与5'-TAATTAAGYAGYGGGAGAGTYAC-3'。
区分大白菜、结球甘蓝FLC2的引物序列为5'-TAAGCTTGTGGAATCAAATTCTG-3'与5'-ATTTTATCAGCTTCGGCTC-3'。
区分大白菜、结球甘蓝FLC3的引物序列为5'-GTGGAATCAAATGTCGGTGGT-3'与5'- TAATTAAGYAGYGGGAGAGTYAC-3'。
区分大白菜、结球甘蓝FLC5的引物序列为5'- AATTGTCGATGTAAGCGTGG-3'与5'-TAATTAAGYAGYGGGAGAGTYAC-3'。
Claims (1)
1.一种区分鉴定大白菜、结球甘蓝FLCs基因的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）根据已公布的拟南芥、白菜和甘蓝FLCs基因序列，对白菜和甘蓝FLCs基因外显子4和外显子7区段设计引物，合成引物序列；
（2）提取不同基因型大白菜、结球甘蓝基因组DNA，以其为模板进行上述引物的PCR扩增；
（3）扩增产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳分离检测；
（4）筛选能够区分大白菜、结球甘蓝FLCs基因的引物，其筛选标准如下：在大白菜和结球甘蓝中分别扩增出与目的基因片段大小一致的扩增产物，且该产物大小在大白菜和结球甘蓝中不同；将符合标准引物的扩增产物回收测序，与已公布的FLC基因比对，验证扩增产物为相应的目的基因片段；
其中步骤（4）筛选到的用于区分大白菜、结球甘蓝FLC1的引物序列为5'- CTTGAGGAATCAAATGTCGATAA-3'与5'-TAATTAAGYAGYGGGAGAGTYAC-3'，用于区分大白菜、结球甘蓝FLC2的引物序列为5'-TAAGCTTGTGGAATCAAATTCTG-3'与5'-ATTTTATCAGCTTCGGCTC-3'，用于区分大白菜、结球甘蓝FLC3的引物序列为5'-GTGGAATCAAATGTCGGTGGT-3'与5'- TAATTAAGYAGYGGGAGAGTYAC-3'，用于区分大白菜、结球甘蓝FLC5的引物序列为5'- AATTGTCGATGTAAGCGTGG-3'与5'-TAATTAAGYAGYGGGAGAGTYAC-3'。
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| WO2008155599A1 (en) * | 2007-06-20 | 2008-12-24 | Taag-Genetics Sa | Nested multiplex amplification method for identification of multiple biological entities |
| CN102102127A (zh) * | 2010-12-07 | 2011-06-22 | 华中农业大学 | 一种适用于转人α-乳清蛋白基因牛的快速简便检测方法 |
-
2013
- 2013-09-17 CN CN201310423234.2A patent/CN103509864B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008155599A1 (en) * | 2007-06-20 | 2008-12-24 | Taag-Genetics Sa | Nested multiplex amplification method for identification of multiple biological entities |
| CN102102127A (zh) * | 2010-12-07 | 2011-06-22 | 华中农业大学 | 一种适用于转人α-乳清蛋白基因牛的快速简便检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 原玉香等: "芸薹种作物抽薹相关基因BrFLC1的CAPS标记", 《园艺学报》 * |
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| Publication number | Publication date |
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