CN103509022B - 黄嘌呤衍生物 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
- C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
- C07D473/04—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two oxygen atoms
Abstract
本发明公开了一种黄嘌呤衍生物及其药学上可接受的盐，通过体外DPP-IV活性抑制试验、正常小鼠糖耐量的影响试验及自发性糖尿病小鼠血糖的影响试验证实，该化合物及其药学上可接受的盐显示出显著的DPP-IV抑制活性，能够用于制备治疗与二肽基肽酶Ⅳ相关的疾病药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类黄嘌呤衍生物、其制备方法及其衍生物作为治疗药物特别是作为二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)抑制剂的用途。
背景技术
糖尿病是一种多病因的代谢疾病，其特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。糖尿病也是一种非常古老的疾病，是由于人体内胰岛素相对或绝对缺乏而引起的血中葡萄糖浓度升高，导致糖大量从尿中排出，并伴随多饮、多尿、多食、消瘦、头晕、乏力等症状。
在糖尿病治疗中，运动疗法和饮食疗法是两种必不可少的糖尿病治疗方法。当这两种疗法不足以控制病情时，可以使用胰岛素或者口服降糖药。但由于这些降糖药物存在很多副作用，开发出一种新型的、低副作用且能够有效治疗糖尿病的药物尤为重要。
二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)是一种丝氨酸蛋白酶，它可以在次末端含有一个脯氨酸残基的肽链里裂解N-末端二肽酶，尽管(DPP-Ⅳ)对哺乳动物的生理作用还没有得到完全的证实，但其在神经酶代谢，T-细胞激活，癌细胞转移入内皮以及HIV病毒进入淋巴样细胞过程中都起到非常重要的作用(WO98/19998)。
有研究表明(DPP-Ⅳ)可以阻止胰升糖素样肽(GLP)-1的分泌，裂解(GLP)-1中N-末端的组-丙二肽酶，使其从活性形式的(GLP)-1降解为无活性的(GLP)-1(7-36)酰胺降解为无活性的(GLP)-1(9-36)酰胺Endocrinology，1999，140：5356-5363)。在生理情况下，循环血中完整(GLP)-1的半衰期很短，DPP-Ⅳ降解为(GLP)-1后的无活性代谢物能与(GLP)-1受体结合拮抗活性(GLP)-1从而缩短了对(GLP)-1的生理反应，而(DPP-Ⅳ)抑制剂能完全保护内源性甚至外源性的(GLP)-1不被(DPP-Ⅳ)灭活，极大的提高(GLP)-1的生理活性(5-10倍)，由于(GLP)-1对胰腺胰岛素的分泌是一个重要的刺激器并能直接影响葡萄糖的分配，因此DPP-Ⅳ抑制剂对非胰岛素依赖型糖尿病例的治疗起到很好的作用(US6110949)。
发明内容
本发明涉及黄嘌呤取代衍生物及其制备方法和在医药上的应用，特别是通式(I)所示的黄嘌呤取代衍生物或其药学上可接受的盐或其所有的立体异构体，及其作为治疗剂特别是对于二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)的活性抑制作用。
本发明具体涉及下面通式(I)结构所示的化合物：
其中：R1和R2独立的选自(苯甲腈-2-基)甲基、(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基、(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基、(2-氰基-吡啶-3-基)甲基、(3-氰基-吡啶-2-基)甲基；
其中，R1和R2同时选自相同的取代基。
优选的本发明化合物是：
本发明中所述的药学上可接受的盐为本发明化合物与选自下列的酸形成的盐：盐酸、对甲苯磺酸、酒石酸、马来酸、乳酸、甲磺酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、乙酸或三氟乙酸；优选为盐酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸或酒石酸。
本发明通式（I）所述的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括以下步骤：
在室温（10~25℃）条件下，将起始原料a与1-溴-2-丁炔反应，生成的产物b进一步与溴代物经取代反应生成产物c，中间体c与(R)-3-叔丁氧羰基氨基哌啶反应生成d，中间体d与TFA反应完全后，游离成碱得到目标化合物I。目标化合物I与酸反应就能制备相应的盐。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
化合物的结构是通过质谱（MS）或核磁共振（1HNMR）来确定的；
核磁共振（1HNMR）位移（δ）以百万分之一（ppm）的单位给出；
核磁共振（1HNMR）的测定是用BrukerAVANCE-300核磁仪，测定溶剂为六氘代二甲基亚砜（DMSO-d6），内标为四甲基硅烷（TMS），化学位移是以10-6（ppm）作为单位给出；
质谱（MS）的测定用FINNIGAN LCQAd（ESI）质谱仪（生产商：Therm，型号：FinniganLCQ advantage MAX）；
IC50值的测定用envision（PerkinElmer公司）；
薄层硅胶使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板；
实施例中无特殊说明，反应均在氮气氛下进行；
氮气氛是指反应瓶连接一个1L容积的氮气气球；
实施例中无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液；
实施例中室温是指10至25摄氏度的环境温度。
实施例1
1-[(苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
第一步7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤的制备
采用公知的方法,将8-溴黄嘌呤（2.31g，10mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（20ml）中，加入N，N-二异丙基乙胺（1.42g，11mmol）、1-溴-2-丁炔（1.46g，11mmol），室温反应6h，薄层色谱跟踪反应，显示原料消耗完全。向搅拌的反应体系中缓慢加入200ml水，溶液中析出灰白固体颗粒，充分搅拌30min后过滤，水洗，干燥得化合物7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤1a（2.1g，黄色固体），收率：74.2%。
MS m/z(ESI):283，285[M+1]
第二步1-[(苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤1a（283mg，1mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（5ml），加入氢氧化钾（140mg，2.5mmol），搅拌中加入2-氰基溴苄（490mg，2.5mmol），室温反应过夜，薄层色谱跟踪反应，显示原料消耗完全，向搅拌中的反应液缓慢加入50ml水，有米黄色固体析出，充分搅拌30min后，过滤，水洗，干燥得化合物1-[(苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤1b（290mg，米黄色固体），收率：56.5%。
MS m/z(ESI):513，515[M+1]
第三步1-[(苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物1-[(苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤1b（257mg，0.5mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（4ml），加入碳酸钾（145mg，1.05mmol）搅拌中加入(R)-3-叔丁氧羰基氨基哌啶（120mg，0.6mmol），75℃反应2h，薄层色谱跟踪反应，显示原料消耗完全，向搅拌中的反应液缓慢加入40ml水，有浅土黄色固体析出，充分搅拌30min后，过滤，水洗，干燥得化合物1-[(苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤1c（285mg，浅土黄色固体），收率：89.9%。
MS m/z(ESI):633[M+1]
第四步1-[(苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物1-[(苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤1c（260mg，0.41mmol）溶于二氯甲烷（3ml），搅拌中缓慢加入三氟乙酸（1ml），室温搅拌2h后，TLC监测反应显示有新产物生成，且原料消耗完全。将反应溶液在30℃下用旋转蒸发仪浓缩并除去三氟乙酸。用二氯甲烷（5ml）溶解残留物后，用pH=10的碳酸钾水溶液调节其pH至7-8，二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩。残留物用薄层色谱(二氯甲烷:甲醇=10:1)分离纯化，得到产品化合物1-[(苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤1（165mg，白色固体粉末），收率：75.3%。
MS m/z(ESI):533[M+1]
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.90–7.80(t,2H),7.68–7.58(m,2H),7.55–7.45(m,2H),7.44–7.35(t,2H),5.31(s,2H),5.23(s,2H),5.15–4.85(m,2H),3.80–3.60(m,2H),3.50–3.35(m,2H),3.25–3.10(m,1H),2.05–1.86(m,2H),1.81(s,3H),1.72–1.65(m,2H)。
实施例2
1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
第一步同实施例1第一步
第二步1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤1a（283mg，1mmol）溶于N,N-甲基甲酰胺（5ml），加入氢氧化钾（140mg，2.5mmol）搅拌中加入2-氰基-5-氟溴苄（535mg，2.5mmol），室温反应过夜，薄层色谱跟踪反应，显示原料消耗完全，向搅拌中的反应液缓慢加入50ml水，有浅黄色固体析出，充分搅拌30min后，过滤，水洗，干燥得化合物1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤2b（320mg，浅黄色固体），收率：58.3%。
MS m/z(ESI):549，551[M+1]
第三步1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤2b（275mg，0.5mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（4ml），加入碳酸钾（145mg，1.05mmol）搅拌中加入(R)-3-叔丁氧羰基氨基哌啶（120mg，0.6mmol），75℃反应2h，薄层色谱跟踪反应，显示原料消耗完全，向搅拌中的反应液缓慢加入40ml水，有浅黄色固体析出，充分搅拌30min后，过滤，水洗，干燥得化合物1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤2c（310mg，浅黄色固体），收率：92.6%。
MS m/z(ESI):669[M+1]
第四步1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤2c（310mg，0.46mmol）溶于二氯甲烷（3ml）,搅拌中缓慢加入三氟乙酸(1ml)，室温搅拌2h后，TLC监测反应显示有新产物生成，且原料消耗完全。将反应溶液在30℃下用旋转蒸发仪浓缩并除去三氟乙酸。用二氯甲烷（5ml）溶解残留物后，用pH=10的碳酸钾水溶液调节其pH至7-8，二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩。残留物用薄层色谱(二氯甲烷:甲醇=10:1)分离纯化，得到产品化合物1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤2（180mg，白色固体粉末），收率：68.2%。
MS m/z(ESI):569[M+1]
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.06–7.90(m,2H),7.45–7.28(m,3H),7.27–7.18(m,1H),5.30(s,2H),5.21(s,2H),4.93(s,2H),3.68–3.48(m,2H),3.12–2.98(m,2H),2.92–2.80(m,1H),1.94–1.75(m,5H),1.68–1.54(m,1H),1.44–1.32(m,1H)。
实施例3
1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
第一步同实施例1第一步
第二步1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤1a（283mg，1mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（5ml），加入氢氧化钾（140mg，2.5mmol）搅拌中加入2-溴甲基-3-氟苯甲氰（535mg，2.5mmol），室温反应过夜，薄层色谱跟踪反应，显示原料消耗完全，向搅拌中的反应液缓慢加入50ml水，有浅黄色固体析出，充分搅拌30min后，过滤，水洗，干燥得化合物1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤3b（295mg，浅黄色固体），收率：53.7%。
MS m/z(ESI):549，551[M+1]
第三步1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤3b（275mg，0.5mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（4ml），加入碳酸钾（145mg，1.05mmol）搅拌中加入(R)-3-叔丁氧羰基氨基哌啶（120mg，0.6mmol），75℃反应2h，薄层色谱跟踪反应，显示原料消耗完全，向搅拌中的反应液缓慢加入40ml水，有浅黄色固体析出，充分搅拌30min后，过滤，水洗，干燥得化合物1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤3c（290mg，浅黄色固体），收率：86.6%。
MS m/z(ESI):669[M+1]
第四步1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤3c（290mg，0.43mmol）溶于二氯甲烷（3ml）,搅拌中缓慢加入三氟乙酸(1ml)，室温搅拌2h后，TLC监测反应显示有新产物生成，且原料消耗完全。将反应溶液在30℃下用旋转蒸发仪浓缩并除去三氟乙酸。用二氯甲烷（5ml）溶解残留物后，用pH=10的碳酸钾水溶液调节其pH至7-8，二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩。残留物用薄层色谱(二氯甲烷:甲醇=10:1)分离纯化，得到产品化合物1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤3（150mg，白色固体粉末），收率：61.2%。
MS m/z(ESI):569[M+1]
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.83–7.67(m,2H),7.60–7.38(m,4H),5.31(s,2H),5.25(s,2H),4.86(s,2H),3.68–3.51(m,2H),3.04–2.89(m,1H),2.82–2.65(m,2H),1.90–1.67(m,5H),1.43–1.62(m,1H),1.32–1.14(m,1H)。
实施例4
1-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-3-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
第一步同实施例1第一步
第二步1-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-3-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤1a（283mg，1mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（5ml），加入氢氧化钾（140mg，2.5mmol）搅拌中加入2-氰基-3-溴甲基吡啶（535mg，2.5mmol），室温反应过夜，薄层色谱跟踪反应，显示原料消耗完全，向搅拌中的反应液缓慢加入50ml水，有浅黄色固体析出，充分搅拌30min后，过滤，水洗，干燥得化合物1-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-3-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤4b（245mg，暗黄色固体），收率：44.6%。
MS m/z(ESI):515，517[M+1]
第三步1-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-3-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物1-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-3-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤4b（245mg，0.47mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（4ml），加入碳酸钾（136mg，0.99mmol）搅拌中加入(R)-3-叔丁氧羰基氨基哌啶（113mg，0.56mmol），75℃反应2h，薄层色谱跟踪反应，显示原料消耗完全，向搅拌中的反应液缓慢加入40ml水，有浅黄色固体析出，充分搅拌30min后，过滤，水洗，干燥后薄层色谱提纯的得化合物1-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-3-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤4c（50mg，黄色固体），收率：16.8%。
MS m/z(ESI):635[M+1]
第四步1-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-3-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物1-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-3-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤4c（50mg，0.08mmol）溶于二氯甲烷（2ml），搅拌中缓慢加入三氟乙酸（0.5mL），室温搅拌2h后，TLC监测反应显示有新产物生成，且原料消耗完全。将反应溶液在30℃下用旋转蒸发仪浓缩并除去三氟乙酸。用二氯甲烷（5ml）溶解残留物后，用pH=10的碳酸钾水溶液调节其pH至7-8，二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩。残留物用薄层色谱(二氯甲烷:甲醇=10:1)分离纯化，得到产品化合物1-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-3-[(2-氰基-吡啶-3-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤4（20mg，浅黄色固体粉末），收率：47.6%。
MS m/z(ESI):535[M+1]
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.75–8.58(m,2H),7.96(d,2H),7.82(d,2H),5.33(s,2H),5.24(s,2H),5.16–4.86(m,2H),3.76–3.62(m,1H),3.48–3.31(m,2H),3.26–3.18(m,2H),2.08–1.86(m,2H),1.81(s,3H),1.75–1.54(m,2H)。
实施例5
1-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-3-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
第一步同实施例1第一步
第二步1-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-3-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤1a（283mg，1mmol）溶于N,N-甲基甲酰胺（5ml），加入氢氧化钾（140mg，2.5mmol）搅拌中加入2-溴甲基-3-氰基吡啶（535mg，2.5mmol），室温反应过夜，薄层色谱跟踪反应，显示原料消耗完全，向搅拌中的反应液缓慢加入50ml水，有浅黄色固体析出，充分搅拌30min后，过滤，水洗，干燥得化合物1-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-3-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤5b（220mg，暗黄色固体），收率：42.7%。
MS m/z(ESI):515，517[M+1]
第三步1-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-3-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物1-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-3-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-溴-黄嘌呤5b（220mg，0.43mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（4ml），加入碳酸钾（119mg，0.86mmol）搅拌中加入(R)-3-叔丁氧羰基氨基哌啶（104mg，0.52mmol），75℃反应2h，薄层色谱跟踪反应，显示原料消耗完全，向搅拌中的反应液缓慢加入40ml水，有浅黄色固体析出，充分搅拌30min后，过滤，水洗，干燥后薄层色谱提纯的得化合物1-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-3-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤5c（65mg，淡黄色固体），收率：23.8%。
MS m/z(ESI):635[M+1]
第四步1-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-3-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的制备
采用公知的方法，将化合物1-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-3-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-叔丁氧羰基氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤5c（65mg，0.1mmol）溶于二氯甲烷（2ml），搅拌中缓慢加入三氟乙酸（0.5ml），室温搅拌2h后，TLC监测反应显示有新产物生成，且原料消耗完全。将反应溶液在30℃下用旋转蒸发仪浓缩并除去三氟乙酸。用二氯甲烷（5ml）溶解残留物后，用pH=10的碳酸钾水溶液调节其pH至7-8，二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩。残留物用薄层色谱(二氯甲烷:甲醇=10:1)分离纯化，得到产品化合物1-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-3-[(3-氰基-吡啶-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤5（30mg，浅黄色固体粉末），收率：56.1%。
MS m/z(ESI):535[M+1]
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.82–8.62(m,2H),8.42–8.23(t,2H),7.55–7.45(m,2H),5.40(s,2H),5.32(s,2H),5.18–4.83(m,2H),3.74–3.55(m,1H),3.50–3.37(m,2H),3.24–3.06(m,2H),2.06–1.87(m,2H),1.86–1.76(s,3H),1.74–1.55(m,2H)。
实施例6
1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的盐酸盐的制备
第一步同实施例1第一步
第二步同实施例2第二步
第三步同实施例2第三步
第四步同实施例2第四步
第五步1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的盐酸盐的制备
将化合物1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤2（80mg，0.141mmol）溶于二氯甲烷（3ml）中，接着添加0.16ml氯化氢的二氯甲烷溶液（1mol/L）。搅拌10分钟后，蒸馏出溶剂，残留物用乙酸乙酯洗涤干燥、干燥得到目标化合物1-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的盐酸盐6（68mg，白色固体），收率：80%。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.33(s,3H),7.97(dd,J=13.8,8.2Hz,2H),7.44-7.29(m,3H),7.25(d,J=9.6Hz,1H),5.30(s,2H),5.22(s,2H),4.99(dd,J=36.6,17.4Hz,2H),3.64(d,J=11.0Hz,1H),3.51–3.28(m,2H),3.28–3.08(m,2H),2.05–1.86(m,2H),1.81(s,3H),1.73–1.61(m,2H)。
实施例7
1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的盐酸盐的制备
第一步同实施例1第一步
第二步同实施例3第二步
第三步同实施例3第三步
第四步同实施例3第四步
第五步1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的盐酸盐的制备
将化合物1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤3（80mg，0.141mmol）溶于二氯甲烷（3ml）中，接着添加0.16ml氯化氢的二氯甲烷溶液（1mol/L）。搅拌10分钟后，蒸馏出溶剂，残留物用乙酸乙酯洗涤干燥、干燥得到目标化合物1-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-3-[(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基]-7-(2-丁炔-1-基)-8-[(R)-3-氨基-哌啶-1-基]-黄嘌呤的盐酸盐7（65mg，白色固体），收率：76%。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.33(s,3H),7.73–7.61(m,2H),7.60–7.42(m,4H),5.32(s,2H),5.25(s,2H),5.07–4.82(m,2H),3.62(d,J=11.5Hz,1H),3.53–3.28(m,2H),3.23–3.05(m,2H),2.05–1.85(m,2H),1.79(s,3H),1.72–1.57(m,2H)。
试验例1：体外DPP-IV活性抑制试验
1、实验目的：
观察样品对二肽基肽酶IV（DPP-IV）酶的活性抑制，以评价样品的抑制效果。
2、实验材料：
2.1、二肽基肽酶IV（DPP-IV）：SIGMA产品，货号D4943-1VL。
2.2、底物：Gly-Pro-7-amido-4-methylcoumarin溶液：SIGMA产品，货号G2761-25mg,FW=41.03。
2.3、DPP-IV Buffer：含25mM Hepes、140mM NaCl、1%BSA、80mM MgCl2，调pH为8.0。
2.4、阳性药（Linagliptin）：利拉列汀，由上海赢瑞化学科技有限公司提供，规格2g，CAT：YRY0687，LCT#：YR111130分子量472.54，DMSO溶解为10mM储液，工作液用蒸馏水稀释为10uM，终浓度为1uM。
2.5、检测仪器：envision（PerkinElmer公司）
3、实验原理：
二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)在室温下可水解Gly-Pro-7-amido-4-methylcoumarinhydrobromide,生成7-amido-4-methyl coumarin（7-氨基-4-甲基香豆素），该物质在355nm激发波长下，可发射出460nm波长的荧光，通过检测产物量变化反映酶的活性。
4、实验方法：
200μL反应体系中含DPP-IV（Sigma）、25mM HEPES缓冲液（含140mM NaCl,1%BSA,80mM MgCl2）和待测样品，同时设立空白对照（不含酶和样品）和阴性对照（不含样品），室温反应10min，加入二肽基肽酶Ⅳ底物GLY-PRO-GLY-GLY，室温反应30min，测定荧光强度F，激发波长355nm，发射波长460nm。根据荧光强度F值计算抑制率，抑制率=[1-（F样品-F空白）/（F阴性-F空白）]×100。初筛时每个样品单浓度设双复孔，抑制率大于70%的样品进行假阳性排除实验，确证为阳性的测定IC50值，测定时每个样品梯度稀释六个浓度，每个浓度设双复孔。根据抑制率，应用Xlfit软件中的4Parameter LogisticModel计算IC50。
5、实验结果：本发明化合物IC50测定数据如下：
根据上述实施例化合物对DPP-IV酶抑制活性的体外试验数据可知，和阳性药（Linagliptin）比较，本发明实施例化合物对DPP-IV酶抑制活性显著提高。
试验例2：对正常小鼠糖耐量的影响
1、试验材料：
1.1、药品：
工具药：葡萄糖，GC≧99.5%，由sigma公司提供，批号101021941，规格100g/瓶，
受试药：实施例2化合物，由成都苑东药业公司合成研究室提供，黄色粉末，批号：20120408；
受试药：实施例4化合物，由成都苑东药业公司合成研究室提供，黄色粉末，批号：20120415；
受试药：实施例5化合物，由成都苑东药业公司合成研究室提供，黄色粉末，批号：20120421；
受试药：实施例6化合物，由成都苑东药业公司合成研究室提供，黄色粉末，批号：20120502；
阳性对照药：利拉列汀，由上海赢瑞化学科技有限公司提供，规格2g，CAT：YRY0687，LCT#：YR111130；
1.2、试验器材：
FA2204B电子天平，由上海精密仪器科学仪器有限公司提供；
METTLER-toledo分析天平，XS-105型，由瑞士梅特勒-托利多公司提供；
血糖试纸：罗康全活力型血糖试纸，规格：50条装，批号23435532，由罗氏诊断产品（上海）有限公司提供；
手术剪、注射器等。
1.3、试验动物：KM小鼠，体重18～22g，雌雄各半，60只，由成都达硕生物科技有限公司提供，生产设施许可证:SCXK(川)2008-24。动物购回后饲养于动物房，适应性观察至少3天，检疫合格后用于实验。
2、试验方法：
2.1、试验开始前禁食至少12小时；
2.2、分组：对禁食后的小鼠测定其空腹血糖值，根据表1随机分组，组间无统计学差异；
表1试验分组及给药方案
2.3、血糖值测定：按照表1分别对各组灌胃给予相应受试药，给药后30min灌胃给予葡萄糖（8g/kg），分别测定给予葡萄糖后30min、60min、120min的血糖值。
3、统计学方法：
采用Excel进行统计，实验数据采用（x±SD）表示，多组之间比较采用双侧T检验方法进行统计学比较。
4、试验结果
表2对正常小鼠糖耐量的影响（x±SD）
注：与空白组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；
与阳性组相比，；▲P＜0.05。
5、结论
（1）从表2中可以看出，与空白组相比，糖负荷30min、60min及120min后各给药组的血糖值极显著性降低（＊＊P＜0.01），说明实施例2化合物、实施例4化合物、实施例5化合物及实施例6化合物和阳性药（利拉列汀）均能极显著降低血糖值；
（2）与阳性药（利拉列汀）相比，糖负荷30min、60min及120min，实施例2组、实施例4组、实施例5组及实施例6组化合物血糖值显著降低（▲P＜0.01），说明本发明实施例化合物降糖效果明显。
试验例3：对自发性糖尿病小鼠血糖的影响
1、试验材料：
1.1、药品：
工具药：葡萄糖，GC≧99.5%，由sigma公司提供，批号101021941，规格100g/瓶，
受试药：实施例2化合物，由成都苑东药业公司合成研究室提供，黄色粉末，批号：20120408；
受试药：实施例4化合物，由成都苑东药业公司合成研究室提供，黄色粉末，批号：20120415；
受试药：实施例5化合物，由成都苑东药业公司合成研究室提供，黄色粉末，批号：20120421；
受试药：实施例6化合物，由成都苑东药业公司合成研究室提供，黄色粉末，批号：20120502；
阳性对照药：利拉列汀，由上海赢瑞化学科技有限公司提供，规格2g，CAT：YRY0687，LCT#：YR111130；
1.2、试验器材：
FA2204B电子天平，由上海精密仪器科学仪器有限公司提供；
METTLER-toledo分析天平，XS-105型，由瑞士梅特勒-托利多公司生产；
血糖试纸：罗康全活力型血糖试纸，规格：50条装，批号23435532，由罗氏诊断产品（上海）有限公司提供；手术剪、注射器等。
1.3、实验动物：自发性Ⅱ型糖尿病小鼠，体重25～30g，雌雄各半，60只，动物购回后饲养于动物房，适应性观察至少3天，检疫合格后用于实验。
2、试验方法：
2.1、试验开始前禁食至少12小时；
2.2、利用罗康全活力型血糖试纸测定空腹血糖值，根据结果按表3随机分组，另选用C57BL/6J小鼠作为空白对照组；
表3试验分组及给药情况
2.3、血糖值测定：按照表3分别对各组灌胃给予相应受试药，给药后30min灌胃给予葡萄糖（8g/kg），然后分别测定给予葡萄糖后30min、60min、120min的血糖值；
3、统计学方法：
采用Excel进行统计，实验数据采用（x±SD）表示，多组之间比较采用双侧T检验方法进行统计学比较。
4、试验结果
表4对自发性小鼠糖耐量的影响（x±SD）
注：与空白组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；
与模型组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；
与阳性组相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。
5、结论
（1）从表4中可以看出，与空白组相比，模型组的空腹血糖值及糖负荷后血糖值显著升高（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01），说明该自发性糖尿病小鼠模型稳定；
（2）与模型组相比，糖负荷30min、60min及120min后各给药组的血糖值极显著性降低（▲▲P＜0.01），说明各实施例化合物和阳性药（利拉列汀）均能极显著降低血糖；
（3）与阳性药（利拉列汀）相比，糖负荷30min、60min，实施例2组、实施例4组、实施例5组及实施例6组血糖值显著降低（★P＜0.05），说明本发明化合物降糖效果显著。
根据上述结果表明本发明实施例化合物显示出显著的DPP-IV抑制活性及降糖作用，对于本领域的普通技术人员而言明显的是在不偏离本发明的精神或者范围，可对本发明化合物、组合物以及方法进行的多种修饰和变化，因此，本发明包含对本发明的修饰和变化，只要在权利要求和其等同的范围内。
Claims (8)
1.通式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1和R2独立的选自(苯甲腈-2-基)甲基、(4-氟-苯甲腈-2-基)甲基、(3-氟-苯甲腈-2-基)甲基、(2-氰基-吡啶-3-基)甲基、(3-氰基-吡啶-2-基)甲基。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R1和R2同时选自相同的取代基。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物选自：
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物选自：
5.根据权利要求1～4任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述的盐为通式(I)化合物与选自下列的酸形成的盐：盐酸、对甲苯磺酸、酒石酸、马来酸、乳酸、甲磺酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、乙酸或三氟乙酸。
6.根据权利要求5所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述的酸为对甲苯磺酸、盐酸、酒石酸或三氟乙酸。
7.根据权利要求1～6任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗与二肽基肽酶Ⅳ相关疾病药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗Ⅱ型糖尿病或葡萄糖耐量异常疾病药物中的用途。
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