CN103502253A - 具有光致发光性质的新化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有光致发光性质的通式(I)的化合物。本发明还涉及诸如包含这类化合物的蛋白质成像工具的应用。

Description

具有光致发光性质的新化合物及其应用
技术领域
本发明一般地涉及具有光致发光性质的新化合物以及涉及这类化合物的应用。
背景
采用光物理报告探针对靶蛋白进行位点特异性标记允许许多蛋白质功能的体内研究。实现靶蛋白的位点特异性标记的一种方法是通过相关蛋白和荧光蛋白的基因融合，由此实现使用荧光显微镜在细胞或组织内观察到相关蛋白。尽管荧光蛋白的基因融合提供了关键优势，但其诸如大尺寸(例如，27kDa)或聚集的不利性质常限制融合蛋白的应用。
另外，小肽标签和相应的结合探针提供较少蛋白质标记的侵入性方式。这类蛋白质标记的开创性实例使用四半胱氨酸标签和荧光biarsenical探针(称为FIAsH)之间的亲合力。迄今，通常基于两个原则已经开发许多肽标签：i)通过开发探针和肽标签之间的固有亲合力，如在D4标签/Zn-探针或IQ-标签的实例中；和ii)通过在反作用酶(transacting enzyme)的帮助下使探针与肽标签联合使用，如在AviTag、LAP-标签或AcP/PCP标签的情况下。
然而，因为包含修饰酶的标记试剂的细胞不渗透性，除了FIAsH之外，上述系统的应用局限于膜蛋白的细胞外域。因此，尽管砷探针存在毒性，FIAsH仍是可在细胞内应用的最有代表性的基于肽的方法。
除了它们的毒性之外，FIAsH探针在它们的应用中也受限制。biarsenical探针通常基于荧光素荧光团并且在两个砷原子之间具有相等距离。所述相等距离使这些探针通常仅适于结合具有相同氨基酸序列(CysCysProGlyCysCys)的相同四半胱氨酸标签。
亟需提供不包含砷原子的标记探针，由此不表现已知与砷原子有关的细胞毒性。
亟需提供更灵活(flexible)的探针/标签系统，其可用于标记蛋白冷漠环境(indifferent environments)。
亟需提供用于克服或至少改进一个或多个上述缺点的成像系统的工具。
概述
根据第一方面，提供了式I的化合物或其盐
Figure BDA0000407067590000021
其中
各个R1和R2是具有至少一个吸电子基团部分的任意取代的烯烃；R3选自氢、任意取代的芳基、羟基、胺、磺酸和任意取代的脂肪族基团；R4和R5独立地选自卤素或脂肪族基团。
有利地，式I的化合物具有显示独特荧光性质的共轭体系。式I化合物的核心结构为二吡咯亚甲基硼(Bodipy)。选择Bodipy作为式I化合物的核心结构，因为它是发射具有高量子产率和尖锐激发/发射波长的强绿色荧光的荧光团。
有利地，通过在Bodipy核心结构上引入取代基R1和R2，取代基中存在的烯烃部分能够将共轭体系延长超出Bodipy核心并由此将Bodipy核心的激发和发射波长显著移至更长波长。因此，式I的化合物具有独特的荧光性质并且在可见光谱的橙色或红色区域发光，例如，与在绿色区域中发光的Bodipy核心相反。
有利地，在各个R1和R2中，至少一个吸电子基团部分的存在促进对于烯烃部分的亲核进攻，由此通过可在R1或R2的烯烃部分发生的加成反应而实现在式I的化合物和结合伴侣(binding partner)之间形成键。
在一个实施方案中，提供了式I-A的化合物
Figure BDA0000407067590000031
其中n为选自1至10、1至7、1至4的整数或n=1、n=2或n=3；R3独立地选自氢或任意取代的芳基；R6为氢或具有1至6个碳原子的低级烷基。
在一个实施方案中，提供了式I-B的化合物
Figure BDA0000407067590000032
其中R6为氢或具有1至6个碳原子的低级烷基。
在一个实施方案中，提供了式I-C的化合物
Figure BDA0000407067590000041
根据第二方面，提供了包含两个或多个能够结合所公开的化合物的半胱氨酸基团由此诱导化合物荧光性质的变化的肽段，所述肽段能够被连接至靶蛋白或整合在靶蛋白的序列内。
有利地，各个半胱氨酸基团包含亲核硫醇部分，其可经历加成反应并与所公开的化合物的取代基R1或R2的烯烃部分形成共价键。有利地，烯烃部分的加成反应可能破坏所公开的化合物的延长共轭体系中的共轭，由此使荧光变回至Bodipy核心的绿色。有利地，在与公开的肽段结合后所公开的化合物的荧光性质的变化可有助于靶蛋白的成像。
在一个实施方案中，肽段可包含两个半胱氨酸基团，各自与精氨酸配对。
根据第三方面，提供了包含与所公开的肽段共价连接的所公开的化合物的复合物。
根据第四方面，提供了公开所述化合物作为成像探针的用途，所述化合物与所公开的肽段联合使用。
根据第五方面，提供了在生物基质中成像靶蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供至少一个公开的肽段以为靶蛋白添加标签；
b)提供式I的化合物以使所述式I的化合物和所述至少一个肽段之间共价连接；以及
c)使所述生物基质中的所述结合的复合物成像。
有利地，公开的方法可用于在细胞内或细胞外环境中成像靶蛋白。
根据第六方面，提供了包含作为成像探针的公开的式I-A、I-B或I-C的化合物，以及至少一个包含两个各自与精氨酸配对的半胱氨酸基团的所公开的肽段的成像试剂盒。
有利地，所公开的化合物不包含诸如砷的有毒元素。因此，所公开的化合物可安全地用作成像探针。
有利地，由于公开的化合物为相对小的分子且公开的肽段为小肽段，因此它们可用作探针/肽标签组合以检测细胞外环境或细胞内环境中的蛋白质。
定义
下列为一些可能有助于理解本发明的描述的定义。这些意图作为一般性定义并且不应以任何方式将本发明的范围限制于单独定义的术语。提出定义用于更好地理解下列描述。
本领域技术人员还意识到本文描述的发明易受除了具体描述的那些之外的变型和改变影响。应当理解，本发明包括所有这样的变型和改变。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何且所有组合或任何两个或多个所述步骤或特征。
如本文使用的术语“吸电子基团”是指能将共价键中的或来自诸如烯烃的另一官能团中的电子吸引接近自己的官能团。
术语“脂肪族”被广泛解释为包括直链的、支链的或环状的烷基、烯基或炔基，其可包含氧、氮、氯或硫原子。因此，本文使用的术语“脂肪族”例如可指烷氧基。
如本文使用的术语“烷氧基”是指直链或支链烷氧基。实例包括甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基等。
如本文使用的术语“低级烷基”是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链饱和烃链。
如本文使用的术语“芳基”或变型诸如“芳香族基团”或“亚芳基”是指衍生自芳香族环的任何官能团或取代基。术语“芳基”还包括具有6至20个碳原子的芳香族烃的任何单环、共轭或稠合残基。示例性芳基基团包括但不限于苯基、甲苯基、萘基等。
如本文使用的术语“卤化物”或诸如“卤素”或“卤代”的变型是指氟、氯、溴和碘。
如本文使用的术语“胺”是指包含具有孤对电子的碱性氮原子的官能团，包括但不限于-NH2、-NH(烷基)和-N(烷基)2。
如本文使用术语“任意取代的”的是指该术语提及的基团可为未取代的，或可为被一个或多个独立地选自以下的基团取代：氢、氧、硫、烷基、烯基、炔基、硫代烷基、环烷基、环烯基、杂环烷基、卤代、羧基、卤代烷基、卤代炔基、羟基、烷氧基、硫代烷氧基、烯氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、硝基、氨基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基胺、炔基氨基、酰基、烯酰基(alkenoyl)、炔酰基(alkynoyl)、酰基氨基、二酰基氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷基亚磺酰基、烷基羰基氧基、烷基硫代、酰基硫代、诸如膦酰基和亚膦酰基的含磷基团、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、-C(O)NH(烷基)和-C(O)N(烷基)2。
如本文使用的术语“共轭”通常是指一个p-轨道与另一个的重叠。共轭p-轨道被σ键隔开。如本文使用的术语‘共轭体系’通常是指具有交替单键和双键的体系。共轭体系允许π电子的离域或移动通过所有相邻的p-轨道。因此，π电子不属于特定原子或特定原子对，而被整个共轭轨道共享。共轭通常导致体系具有较低的总能量且由此导致更稳定的包含共轭体系的化合物或分子。
如本文使用的术语“探针”是指设计以结合肽或核苷酸序列的化合物或分子。化合物或分子的‘探针’方面表示化合物或分子具有例如，荧光行为的变化的装置以报告探针化合物或探针分子与靶标肽或核苷酸序列的结合。
如本文使用的术语“荧光团”是指荧光发色团，其可为吸收特定波长的光能并在更长波长处再发射的化合物或分子，或者化合物或分子的一部分。吸收能量再发射之前的波长、量和时间取决于荧光团自身和与它相互作用的化学环境二者。荧光团的化学结构通常包含能实现电子的离域且有助于能量的吸收和再发射的高度共轭体系。荧光团通常用于染色或标记组织、细胞或其组分用于荧光成像和光谱学。
如本文使用的术语‘靶蛋白’是指相关的蛋白质。在给定时间下可能存在一种或多种靶蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白可为需要成像并且它在确定的细胞基质中存在的蛋白质。
如本文使用的术语“肽段”是指在任何地方包含4至30个通过肽键连接在一起的氨基酸单体的短聚合物链。在氨基酸单体之中，包括两个或多个被1至6个在它们之间的其它氨基酸间隔开的半胱氨酸基团。本发明的肽段可与靶蛋白连接或被并入靶蛋白的氨基酸序列内。
如本文使用的术语“标签”可能是指诸如本发明的肽段的生物或化学物质，其能被容易地连接并且具有用于靶蛋白的亲合力。肽段可称为‘肽标签’。如本文使用的术语‘以为靶蛋白添加标签’是指将肽段连接至靶蛋白序列或将肽段并入在靶蛋白序列内的操作或过程，由此识别蛋白质。连接可为直接连接或间接连接。
词语“基本上”不排除“完全地”，例如，“基本上没有”Y的组合物可能完全没有Y。必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。
除非另外规定，术语“包括(comprising)”和“包括(comprise)”及其语法变型意图代表“开放式的”或“包括式的”表达使得它们包括列举的元素而且允许包括另外未列举的元素。
在本公开中，可以范围形式公开一些实施方案。应当理解，范围形式的描述仅为了方便和简洁并且不应解释为对公开范围的不变限制。因此，范围的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及所述范围内的单个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应被认为具有诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的具体公开的子范围以及所述范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。该应用不管范围的宽度。
在本文还可广泛地和一般地描述一些实施方案。属于一般专利公开的各个狭义类别和较一般组别也形成本公开的部分。这包括实施方案的一般描述，而前提或否定限制是从所述上位类别中去除任何事物，而无论本文是否具体列举删除的材料。
实施方案的详细公开
公开的化合物
现在公开具有荧光性质的式I化合物的示例性、非限制性实施方案以及它们的应用。
本发明者已经合成公开的化合物并且发现这些化合物显示与Bodipy核心不同的独特的荧光性质。有利地，发明者发现包含诸如具有硫醇部分的半胱氨酸基团的亲核部分的氨基酸基团可结合式I的化合物并破坏所公开的化合物内的共轭。有利地，共轭的破坏能引起式I化合物的荧光性质的显著变化。因此，本文公开的化合物能用作成像探针以成像蛋白质结构或研究它们的功能。
公开的化合物或其盐可由式I表示
Figure BDA0000407067590000081
其中
各个R1和R2是具有至少一个吸电子基团部分的任意取代的烯烃；R3选自氢、任意取代的芳基、羟基、胺、磺酸和任意取代的脂肪族基团；R4和R5独立地选自卤素或脂肪族基团。
在一个实施方案中，R1为具有吸电子基团部分的未取代烯烃，而R2为具有至少一个吸电子基团部分的取代烯烃。
在一个实施方案中，R2为具有吸电子基团部分的未取代烯烃，而R1为具有至少一个吸电子基团部分的取代烯烃。
在一个实施方案中，R1和/或R2可为被一个或多个独立地选自羟基、烷基、烯基、炔基、硫代烷基、环烷基、环烯基、杂环烷基、卤代、羧基、卤代烷基、卤代炔基、羟基、烷氧基、硫代烷氧基、烯氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、硝基、氨基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基胺、炔基氨基、酰基、烯酰基、炔酰基、酰基氨基、二酰基氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷基亚磺酰基、烷基羰基氧基、烷基硫代、酰基硫代、诸如膦酰基和亚膦酰基的含磷基团、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、-C(O)NH(烷基)和-C(O)N(烷基)2的基团取代的烯烃。
在一个实施方案中，R1和R2相同。例如，R1和R2都可为具有吸电子基团部分的未取代烯烃。在另一实例中，R1和R2都可为具有吸电子基团部分的取代烯烃，例如烯烃被低级烷基基团取代。在另一实例中，R1和R2都可为具有两个或多个吸电子基团部分的取代烯烃。
在一个实施方案中，R1和R2的烯烃部分具有2至20个碳原子。例如，烯烃部分可包含2至4个碳、2至6个碳、2至8个碳、2至10个碳、2至12个碳、2至14个碳、2至16个碳、2至18个碳、2至20个碳、4至6个碳、4至8个碳、4至12个碳、4至14个碳、4至16个碳、4至18个碳、4至20个碳、6to20个碳、8至20个碳、10至20个碳、12至20个碳、14至20个碳、16至20个碳或18至20个碳。
在一个实施方案中，R1和R2的烯烃部分具有2个碳原子。
在一个实施方案中，R1和R2的烯烃部分具有4至20、4至12或4至6个碳原子。在该实施方案中，R1和R2可为分别具有吸电子基团部分的任意取代的共轭烯烃。
在一个实施方案中，具有2至20个碳原子的R1和R2为具有各自的吸电子基团部分的未取代烯烃。
在一个实施方案中，至少一个吸电子基团部分与各个R1和R2中的烯烃部分相邻。
在一个实施方案中，至少一个吸电子基团部分为R1和R2烯烃部分的双键上的取代基。
例如，在其中R1和R2为各自具有8个碳和吸电子基团的共轭烯烃的实施方案中，吸电子基团可为在各个R1和R2中共轭烯烃部分的端双键上的取代基。
在其中各个R1和R2具有2个碳原子和吸电子基团部分的实施方案中，吸电子基团部分可为R1或R2中存在的唯一双键上的直接取代基，并且可处于通过至Bodipy核心的双键的反式排列。
例如，在其中R1和R2为各自具有6个碳和至少一个吸电子基团的共轭烯烃的另一实施方案中，至少一个吸电子基团可为端双键上的取代基并且处于与Bodipy核心连接的R1或R2的剩余双键的反式排列。
有利地，当至少一个吸电子基团部分与R1或R2中的烯烃部分相邻时，吸电子基团能够从烯烃部分或至少从烯烃部分的双键中吸电子密度，由此使烯烃易于被诸如硫醇基团的硫原子的富电子亲核试剂亲核进攻。该类型的化学反应可称为亲核加成反应。
在一个实施方案中，至少一个吸电子基团部分选自卤素、醛、酮、酯、羧酸、羰基、酰基、酰氯、乙酰氯、三氟甲基、腈、磺酸、铵、酰胺、氨基、偶氮基、硝基、砜和膦酸酯部分。
在其中各个R1和R2为具有2个碳原子和吸电子基团部分的烯烃的实施方案中，R1和R2选自任意取代的丙烯酸酯、丙烯酸、丙烯酰、丙烯腈和丙烯酰胺部分。
在一个实施方案中，丙烯酸酯、丙烯酸、丙烯酰、丙烯腈和丙烯酰胺部分可被一个或多个独立地选自氰基、氰酸酯、烷氧基、羧基、卤代、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基和叔丁基的基团取代。
在一个实施方案中，R1和R2独立地为任意取代的丙烯酸酯部分。
在一个实施方案中，丙烯酸酯部分的酯基团具有1至6个碳原子，例如丙烯酸酯部分具有1、2、3、4、5或6个碳。
在一个实施方案中，丙烯酸酯部分的酯基团具有1个碳原子，因此丙烯酸酯部分为丙烯酸甲酯。
在一个实施方案中，R3选自氢、任意取代的芳基、羟基、胺、磺酸和任意取代的脂肪族基团。
在一个实施方案中，R3为具有1至10个碳原子的脂肪族基团。例如，R3可为具有1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至2、2至10、3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、8至10或9至10个碳的脂肪族基团。
在一个实施方案中，R3的脂肪族基团为烷基、优选为低级烷基。
在一个实施方案中，R3的脂肪族基团为包含至少一个不饱和烯基或炔基优选低级烯基或低级炔基的脂肪族基团。
在一个实施方案中，R3为被一个或多个杂原子基团取代的脂肪族基团。合适的杂原子基团包括但不限于氧(O)、硫(S)、氮(N)和磷(P)。
在一个实施方案中，R3为取代的芳基。
在一个实施方案中，R3为取代的萘基。
在一个实施方案中，R3为取代的甲苯基。
在一个实施方案中，R3为取代的苯基。
在一个实施方案中，R3为可为被一个或多个独立地选自羟基、烷基、烯基、炔基、硫代烷基、环烷基、环烯基、杂环烷基、卤代、羧基、卤代烷基、卤代炔基、羟基、烷氧基、硫代烷氧基、烯氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、硝基、氨基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基胺、炔基氨基、酰基、烯酰基、炔酰基、酰基氨基、二酰基氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷基亚磺酰基、烷基羰基氧基、烷基硫代、酰基硫代、诸如膦酰基和亚膦酰基的含磷基团、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、-C(O)NH(烷基)和-C(O)N(烷基)2的基团取代的苯基。
在一个实施方案中，R3为被杂环基团取代的苯基。
在一个实施方案中，苯基被杂芳基或杂脂肪族基团取代。
在一个实施方案中，杂脂肪族基团可包含由至少两种不同元素形成的3至8、4至8、5至8或6至8元环。
在一个实施方案中，杂脂肪族基团包含由三种不同元素形成的5至8元环。
在一个实施方案中，杂脂肪族基团包含由两种(2)不同元素形成的6元环。
在一个实施方案中，杂脂肪族基团包含由三种(3)不同元素形成的6元环。
在一个实施方案中，不同元素选自包含氮(N)、氧(O)、硫(S)和碳(C)的基团。
在其中5至8元杂环基团包含两种不同元素的实施方案中，元素为氧(O)和碳(C)，或氮(N)和碳(C)。
在其中5至8杂环基团包含三种不同元素的实施方案中，元素为氧(O)、硫(S)和碳(C)。
在其中5至8元杂环基团包含三种(3)不同元素的另一实施方案中，元素为氮(N)、氧(O)和碳(C)。
在其中5至8元杂环基团包含三种(3)不同元素的另一实施方案中，元素为氧(O)、硫(S)和碳(C)。
在一个实施方案中，杂脂肪族基团包括由一个氮(N)、一个氧(O)和四个碳(C)原子形成的6元环。
在一个实施方案中，杂环基团为吗啉基团。
在一个实施方案中，吗啉基团具有一个或多个选自羟基、卤代、烷基、烷氧基、酰胺基、羰基、羧基、碳酰氯、硫醇、磺酰基和膦酰基部分的取代基。
在一个实施方案中，杂环基团为吗啉碳酰基团。
在一个实施方案中，R3为被吗啉碳酰基团取代的苯基。
在一个实施方案中，R4和R5独立地选自卤素或脂肪族基团。
在一个实施方案中，R4和R5独立地为卤素部分。
在一个实施方案中，R4和R5独立地为氟原子。
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-A：
Figure BDA0000407067590000131
其中n为选自1至10、1至7、1至4的整数或n=1、n=2或n=3；R3独立地选自氢或任意取代的芳基；R6为氢或具有1至6个碳原子的低级烷基。
应当注意当R6为氢时，根据当溶解化合物I-A时的周围介质的pH条件，氢可能从化合物I-A中游离，因此在一个实施方案中R6可能仅为负电荷(即，“-”)；因此，该实施方案中的吸电子基团部分为羧基而不是羧酸基团部分。
此外，化合物I-A还可以盐的形式存在盐。因此，根据本发明，在化合物I-A的一个实施方案中R6可为阳离子(例如，Na+)。在该实施方案中，如果使化合物I-A为溶剂化物，则在盐的溶解，或阳离子(例如，Na+)的离解后R6可再次仅为负电荷。
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-B：
Figure BDA0000407067590000132
其中R6为氢或具有1至6个碳原子的低级烷基。作为低级烷基，例如R6可为甲基或乙基。
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-C：
Figure BDA0000407067590000141
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-D：
Figure BDA0000407067590000142
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-E：
Figure BDA0000407067590000151
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-F：
Figure BDA0000407067590000152
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-G：
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-H：
Figure BDA0000407067590000162
其中n为选自1至10、1至7、1至4的整数或n=1、n=2或n=3；
R6为H或具有1至6个碳原子的低级烷基。作为低级烷基，例如R6可为甲基或乙基。当R6为氢时，如同在化合物I-A的情况下，根据其中溶解化合物I-H的周围介质的pH条件，氢可从化合物I-H中离解，因此在一个实施方案中R6可仅为负电荷(即，“-”)；因此，在该实施方案中的吸电子基团部分为羧基而不是羧酸基团部分。
此外，化合物I-H还可以盐的形式存在。因此，根据本发明，在化合物I-H的一个实施方案中R6可为阳离子(例如，Na+)。在该实施方案中，如果化合物I-H为溶剂化物，则在盐的溶解或阳离子(例如，Na+)的离解后，R6可再次仅为负电荷。
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-I：
Figure BDA0000407067590000171
其中n为选自1至10、1至7、1至4的整数或n=1、n=2或n=3；R6为H或具有1至6个碳原子的低级烷基。作为低级烷基，例如R6可为甲基或乙基。
与实施方案I-A或I-H相似，R6也可为负电荷(-)或阳离子(例如，Na+)。
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-J：
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-K：
Figure BDA0000407067590000181
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-L，其中n=6：
Figure BDA0000407067590000182
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-M：
Figure BDA0000407067590000183
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-N：
Figure BDA0000407067590000191
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-O：
Figure BDA0000407067590000192
在一个实施方案中，公开的化合物具有式I-P：
Figure BDA0000407067590000193
除了具有一个或多个烯烃取代基之外，在一些实施方案中，公开的化合物可具有不对称碳中心。这些化合物能以外消旋体、非对映异构体或其混合物的形式存在。因此，本发明还包括所有这些异构体和它们的混合物。因此，应当理解式(I)的化合物及其衍生物在各个情况下适当时包括例如，化合物的E、Z、顺式、反式、(R)、(S)、(L)、(D)、(+)和/或(-)形式。
公开的化合物可以盐的形式存在。例如，可通过与稀释碱性溶液(例如，稀释氢氧化钠溶液)的水解反应形成盐。在另一实施方案中，可由矿物酸(例如，盐酸、硫酸、磷酸)或有机酸(例如，醋酸)形成盐。在另一实施方案中，例如盐可为碳酸盐的形式。
公开的化合物可以溶剂化物或非溶剂化物形式存在。
公开的化合物可以离解或未离解形式存在。
结合伴侣(partner)
公开的发明还提供了用于本发明化合物的结合伴侣。
结合伴侣可为一个或多个包含至少一个结合基序的肽段形式。
公开的肽段可包含至少一个半胱氨酸基团，但优选两个或多个能够结合公开的化合物的半胱氨酸基团由此诱导化合物荧光性质的变化，肽段能够被连接至靶蛋白或被整合在靶蛋白序列内。
有利地，半胱氨酸基团包含容易接近的亲核硫醇部分。
在一个实施方案中，肽段和所公开的化合物之间的结合包括至少一个加成反应，其中半胱氨酸基团的硫原子与化合物的R1或R2形成共价键，R1或R2为具有吸电子基团部分的烯烃。在该实施方案中，硫醇部分的亲核或富电子硫原子可进攻具有如在R1或R2中的吸电子基团部分的烯烃。
有利地，烯烃部分处的加成反应可能破坏所公开的化合物的延长共轭体系中的共轭并诱导化合物荧光性质的变化，例如移动荧光返回至Bodipy核心的绿色。
在一个实施方案中，肽段还包含与半胱氨酸基团相邻的精氨酸基团，形成半胱氨酸-精氨酸或精氨酸-半胱氨酸对。
有利地，精氨酸基团降低半胱氨酸基团中硫醇部分的pKa并在生理学pH范围内增加硫醇部分的亲核性。
在一个实施方案中，公开的肽段可包含2至5或2至4个半胱氨酸基团。
在一个实施方案中，公开的肽段可包含三个半胱氨酸基团。
在一个实施方案中，公开的肽段可包含两个半胱氨酸基团。
在一个实施方案中，公开的肽段具有两个被它们之间的1至10、2至8、2至6、2至5、2至4或2至3个氨基酸间隔开的半胱氨酸基团。
在一个实施方案中，两个半胱氨酸基团被它们之间的3至5或3至4个氨基酸间隔开。
在一个实施方案中，两个半胱氨酸基团被它们之间的3个氨基酸间隔开。
间隔两个半胱氨酸基团的氨基酸可选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一个实施方案中，各个两个半胱氨酸基团邻近精氨酸基团，由此在肽段中形成两个半胱氨酸-精氨酸或精氨酸-半胱氨酸对。
在一个实施方案中，两个半胱氨酸-精氨酸或精氨酸-半胱氨酸对被它们之间的1至10、2至8、2至6、2至5、2至4或2至3个氨基酸(除了精氨酸和半胱氨酸之外)间隔开。
在一个实施方案中，两个半胱氨酸-精氨酸或精氨酸-半胱氨酸对被它们之间的三个氨基酸(除了精氨酸和半胱氨酸之外)间隔开。
有利地，可选择两个半胱氨酸基团或半胱氨酸-精氨酸/精氨酸-半胱氨酸对之间的距离近似相应于分离取代基R1和R2中各个具有至少一个吸电子基团部分的烯烃的距离。这促进半胱氨酸基团的硫醇部分和R1和R2的烯烃部分之间的共价键的形成。
最可能地，公开的肽段和公开的化合物之间的结合包括两个加成反应，分别在公开的肽段的两个半胱氨酸基团和公开的化合物的取代基R1和R2之间。
有利地，加成反应和随后形成的共价键能实现所公开的化合物和所公开的肽段之间形成稳定的复合物。
因此，根据本发明的第三方面，提供了包含与公开的肽段共价连接的公开的化合物的复合物。在一个实施方案中，可将肽段与靶蛋白连接。
有利地，公开的肽段与公开的化合物的结合破坏所公开的化合物的延长共轭体系中的共轭，由此移动荧光返回至Bodipy核心的绿色。有利地，在结合所公开的肽段后的所公开的化合物的荧光性质的变化可有助于成像或研究靶蛋白。
因此，根据本发明的其它方面，提供了所公开的化合物作为成像探针的用途，所述化合物与所公开的肽段联合使用以研究靶蛋白。
在其它方面中，提供了在生物基质中成像靶蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供至少一个公开的肽段以标记靶蛋白；
b)提供式I的化合物以使所述式I的化合物和所述至少一个肽段之间共价连接；以及
c)使所述生物基质中的所述结合的复合物成像。
在另一实施方案中，可将公开的肽段并入靶蛋白的氨基酸序列内。
在一个实施方案中，肽段与靶蛋白直接或间接连接。
在其中公开的肽段与靶蛋白间接连接的实施方案中，可将肽段与另一小肽标签连接，例如，myc标签，其可能已经被结合至靶蛋白。
在另一实施方案中，可将公开的肽段与具有两个或多个放置在公开的肽段和靶蛋白之间的小肽标签的靶蛋白间接连接。
在另一实施方案中，公开的肽段与靶蛋白直接连接。随后，可向生物基质提供式I的化合物以实现式I的化合物与所公开的肽段之间的共价结合。在形成复合物之后，其中式I的化合物、公开的肽段和靶蛋白彼此连接，可将结合复合物成像。
成像可在生物基质中发生。生物基质可为细胞外或细胞内基质。
在一个实施方案中，生物基质可为诸如细胞培养介质或营养物介质的生物可接受的介质。
有利地，公开的方法可用于成像活细胞内的蛋白质。因此，在一个实施方案中，生物基质为活细胞内的基质。
在一个实施方案中，选自I-A至I-I、I-C至I-H或I-C至I-E列表的化合物可用于成像活细胞内的靶蛋白的方法。
在另一实施方案中，I-C的化合物可用于成像活细胞内的靶蛋白。
在其它方面中，提供了成像试剂盒，其包含作为成像探针的式I-A、I-B或I-C的化合物，以及至少一个包含两个半胱氨酸-精氨酸或精氨酸-半胱氨酸对的肽段。
在一个实施方案中，成像试剂盒包含2至4或2至3个相同肽段。
在一个实施方案中，成像试剂盒包含三个相同肽段。
在一个实施方案中，成像试剂盒包含两个相同肽段。
在另一实施方案中，根据本发明，成像试剂盒可包含两个不同肽段。例如，第一肽段可包含三个半胱氨酸-精氨酸对同时第二肽段可包含两个半胱氨酸-精氨酸对。或者，第一肽段可仅包含两个半胱氨酸基团，同时第二肽段可包含两个半胱氨酸-精氨酸对。
附图简述
附图例示了公开的实施方案并且有助于解释公开实施方案的原理。然而，应当理解，设计附图仅用于说明的目的并且不作为限制本发明的定义。
图1显示所公开的化合物与所公开的肽段的结合，以及结合对所公开的化合物的荧光性质的影响。
图2显示未结合的形式的以及在与公开的肽段或与多种包含不同结合基序的对照样品结合后所公开的化合物的荧光反应。显示并比较在480nm下激发获得的不同荧光发射光谱。
图3a显示式I化合物的结构。
图3b显示与三个突变肽段相比的所公开的肽段；和被所公开的肽段标记的靶蛋白的表达。
图3c显示所公开的化合物与所公开的肽段的结合以及通过SDS-PAGE和免疫印迹(凝胶扫描Ex/Em=488/Sp526nm)验证结合。
图4显示在293A细胞中表达的重组蛋白质的荧光显微图像，其中蛋白质标记有含两个所公开的肽段的肽标签用于结合所公开的化合物(参考附图和实验部分化合物4b，但与式I-C的化合物相同)。
图5显示本发明的肽段P1、P2、P3、P6的LC-MS色谱图。LC条件a：(具有水的5%CAN至100%CAN梯度条件，包含0.1%TFA，运行时间：10min，柱：C18，4.6×50mm，5微米，在214nm通道下检测的)LC条件b：(15%CAN的水等度，包含0.1%TFA，运行时间：20min，柱：C18，4.6×15mm，5微米，在214nm模式下检测的)。
图6比较了称为4a和4b的化合物的光谱性质。化合物4a涉及其中R6为H的式I-B的化合物。图6(a)显示4a在50mMHEPES缓冲液(pH7.4)中的吸光度和发射光谱。使用在550nm下的激发获得荧光谱(吸收系数；=66,888，量子产率；=0.29在1,3,5,7-四甲基-8-苯基BODIPY上作为参照)。图6(b)显示4b在50mM HEPES缓冲液中的吸光度和发射光谱(pH7.4)。使用在520nm下的激发获得荧光谱(吸收系数；=55,989，量子产率；=0.21在1,3,5,7-四甲基-8-苯基BODIPY上作为参照)。
图7分别显示化合物4a和肽片段P1和P6之间的反应速率常数。10μM的4a和200μM的肽(P1或P6*)的含1%DMSO的20mM的HEPES缓冲溶液放置在96孔板中。每2min记录530nm下的荧光强度，伴随480nm下的激发直至在氙气闪光灯下饱和(没有精氨酸的对照肽。P6*：AcGGGGGGGGCGGGCGGG-NH2)。
图8显示肽片段P1的圆二色性(CD)光谱。使用1mM的P1的10mM PBS缓冲溶液测定CD。缓冲液读数值被减去。观察到典型螺旋209、220nm激发。
图9显示使用模型肽培养的化合物4a的时间取决于荧光反应。在50mM HEPES(pH7.4)中将4a(10μM)与P1、P2、P3(10μM)或NAC(100μM)混合并使用在480nm下的激发检测530nm下的荧光发射。
图10显示化合物4a与肽片段P1的共轭。图10(a)显示在使用4a培养后的模型肽P1的MALDI-TOF光谱：在50mM HEPES(pH7.0)中混合4a(10μM)和P1(20μM)，然后在通过C18ziptip脱盐后分析混合物。质谱显示P1-4a共轭产物的存在(2268.1，M+H)，在2228.9(M-38)下具有另一质谱峰。图10(b-d)显示在与P1和4a共轭后的LC-MS色谱位移。在500nm UV通道下原始P1肽(Rt=3.3min)移动至4.3。在移动峰处观察到多重带电质谱。
图11显示总蛋白质组中化合物4b与RC2标记的靶蛋白的特异性共轭。使用4b(1μM，30min，37℃)染色使用RC·myc cherry和RC2·myc·cherry或丙氨酸突变克隆转染的HEK293细胞并在SDS-PAGE上分析总裂解物。在荧光凝胶扫描(a)之后，使凝胶进行银染色(b)以显示凝胶上分解的总蛋白质组。
图12显示在活细胞中RC标签的二聚能实现通过4b的靶蛋白的有效标记。标记有RC、RC2或RC的丙氨酸突变体(m1、m2、m3)的表达载体编码cherry转染HEK293细胞并使用4b染色。通过FITC滤光器(F)采集的荧光显微图像显示由化合物的光谱变化产生的绿色荧光且通过Cy5滤光器(C)采集的图像证实标记的蛋白质(cherry)的表达。RC标记的cherry(RC·myc·cherry)中的箭头表示如(M)所示的具有最终重叠荧光信号(即，绿色和红色荧光的重叠)的示例性细胞。BF-明视野、F-FITC、C-Cy5.M-合并的(F和C)，比例尺-50μm。
图13显示在HEK293细胞中通过化合物4b标记的RC2标记细胞核蛋白质的荧光显微图像。使用pc-RC2·myc·cherry或pc-RC2·(NLS)·myc·cherry转染细胞并使用4b染色(1μM，15min，37℃)且随后赫斯特染色(10μM，30min，37℃)。在活细胞中采集图像。用于荧光成像的滤光器为BF-明视场、D-DAPI、F-FITC、C-Cy5、M-Merged。柱A显示合并的所有滤光器(BF+D+F+C)的图像。比例尺代表50μm。
图14显示在各个位置通过RC标签的靶蛋白的标记。制备质粒载体以表达具有结合其它小肽标签放置在不同位置的RC标签的单体cherry。使用4b(1μM，30min，37℃)染色使用表达载体转染的HEK293细胞并在SDS-PAGE上分析总裂解物。在凝胶的荧光扫描后，将蛋白质转移至PVDF膜并进行免疫印迹(α-myc)用于证实外源性蛋白质表达。M代表蛋白质尺寸标记且N代表没有转染。
实施例
通过参考特定的实施例来更详细地进一步描述本发明的非限制性实施例和对比实施例，其不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
原料和方法
在正压氮气下在烘干的玻璃器皿中进行所有反应。除非另外说明，起始原料和溶剂购自Aldrich和Acros有机物并且不需另外纯化而使用。用于制备肽的氨基酸、Rink酰胺MBHA树脂和偶联剂购自peptideinternational,Inc。在Merck60F254硅胶板(0.25mm层厚度)上进行分析TLC并使用UV灯进行可视化。在Merck60硅胶(230-400目)上进行柱层析。在Bruker Avance400NMR光谱仪上记录NMR光谱。化学位移报告为百万分之一的单位形式的δ(ppm)并且耦合常数报告为赫兹形式的J值(Hz)。通过具有电喷雾电离源的安捷伦技术公司的LC-MS测定所有化合物的质谱。在Bruker MicroTOFQ-II上记录高分辨质谱。通过Jasco J-810分光偏振计检测肽的CD光谱。使用GeminiXS荧光板读数仪进行所有荧光检验。在荧光计和UV/VIS仪器(bioteck公司的协同4)上进行光谱学检测。激发和发射二者的狭缝宽度为1nm。通过比较校正光谱下的面积获得相对量子效率。下列方程式用于计算量子产率
Φx＝Φst(Ix/Ist)(Ast/Ax)(ηx 2/ηst 2)
其中st为标准的报告量子产率，I为积分发射光谱，A为激发波长下的吸光度且η.为所使用溶剂的折射率。下标x表示未知的且st表示标准。1,3,5,7-四甲基-8-苯基Bodipy用作标准。
细胞培养和转染
HEK293细胞，原代人胚胎肾细胞的永生化系购自英杰公司(Invitrogen)并在DMEM(10%胎牛血清(FBS)、1%抗生素-抗真菌剂)中保持。用于细胞培养的物质购自英杰公司(Invitrogen)。为了瞬时转染，在12孔板中以2×105细胞/孔的密度将细胞制板并使用脂质体2000(Invitrogen)转染500ng的通过Midi-prep试剂盒(Qiagen)纯化的质粒DNA。在2天培养后，将转染的细胞进行诸如活细胞染色或(SDS-PAGE/免疫印迹)的下列实验。
SDS-PAGE、凝胶扫描、免疫印迹和银染色
通过使用CelLyticMTM细胞裂解液(Sigma)提取总蛋白。通常，将10μg的蛋白质/孔装在SDS-PAGE凝胶中用于凝胶扫描。NuPAGE硫双对氯酚Bis-Tris凝胶(Invitrogen)用于PAGE并使用Typhoon9410凝胶扫描仪(GE Healthcare)扫描凝胶。凝胶在染色的488nm下激发并通过526SP发射滤光器被扫描。在凝胶扫描后，将蛋白质转移至PVDF膜上并使其进行下列免疫印迹。通过用抗体染色的膜的荧光扫描生成免疫印迹数据。使用小鼠单克隆α-myc(Santa Cruz，sc-40)抗体和标记有Cy5(Invitrogen,A10524)的山羊α-小鼠IgG。膜在633nm下激发并通过670BP发射滤光器扫描。当使凝胶进行银染色时，将凝胶在固定液(50%EtOH，10%冰醋酸)中固定10min。使用水将凝胶冲洗1hr，然后在0.02%Na2S2O3中敏化2min。在用水短暂冲洗后，在0.1%AgNO3中将凝胶染色30min。在用水冲洗后，用2%Na2CO3、37%(v/v)甲醛将凝胶显色并使用1%CH3COOH停止反应。
活细胞中的化合物染色和成像
在DMSO中重组(reconstitute)化合物达到1mM溶液，并在-20℃下储存。在染色前立即将孔中的培养基排干并将在预热的生长培养基中稀释的化合物直接加入在细胞上。在培养(30min，37℃)后，使用生长培养基洗涤细胞并在细胞培养器中进一步培养1小时。再次更换培养基，并使细胞进行活细胞成像。通过荧光显微镜ECLIPSE Ti-E(Nikon Instrument Inc.)获得明场成像和荧光成像。使用的发射滤光器为Hoechst的DAPI滤光器(Ex340-380nm，Em435-485nm)，4b所用的是FITC滤光器(Ex465-495nm，Em515-555nm)和cherry所用的为Cy5滤光器(Ex590-650nm，Em663-738nm)。
实施例1
bodipy-二丙烯酸酯衍生物的合成
参考下列方案1，其显示通过5-苯基联吡咯甲烷的Vilsmeier公式在步骤a中制备二醛。使用三苯基膦试剂通过联吡咯甲烷的Wittig反应在步骤b中制备二丙烯酸酯化合物。通过1H-NMR测定，二丙烯酸酯化合物特征为对称E异构体(J=16.0Hz)。在步骤c中，通过与BF3·OEt2络合的DDQ(2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌)来氧化苯基联吡咯甲烷丙烯酸酯产生bodipy二丙烯酸酯的深紫色固体。所述过程可被描述成如下：
方案1
Figure BDA0000407067590000281
(a)加入POCl1，DMF(二甲基甲酰胺)然后NH4OAc水溶液；
(b)PPh3=C(O)OR2，DCM(二氯甲烷)；
(c)DDQ，DCM然后DIEA(N,N-二异丙基乙基胺)，BF3OEt2。
如方案1所示，进行多个反应产生化合物4a，其中R6=R7=H和4b，其中R7=CO(N(CH2)2O且R6=CH3。在化合物4a中，根据使化合物4a成为溶剂化物的溶液的pH，H可从羧酸基团中离解。
已经发现化合物4a不是足够膜可渗透的，因此包含化合物4a的成像探针最好用于研究细胞外环境中的靶蛋白。
有利地，已经发现对于细胞渗透性和较低的细胞背景，发射化合物4b是最佳的探针。
起始原料5-苯基联吡咯甲烷(称为1a)的合成
使用本领域已知的方法合成5-苯基联吡咯甲烷。1H-NMR(300MHz.CDCl3)δ7.87(bs,2H,2-NH),7.25(m,5H,Ph),6.67(dd,J=2.4,4.0,2H,2-CH),6.15(dd,J=2.8,6.0,2H,2-CH),5.90(bs,2H,2-CH),5.45(s,1H,-CH)；13C-NMR(CDCl3)δ142.10,132.52,128.67,128.43,127.01,117.24,108.46,107.26,44.01。ESI-MS m/z(M+H)计算值：223.1，实测值223.1。
1,9-二甲酰基-苯基二吡咯甲烷(为2a的中间体称)的合成
向DMF(10mL)缓慢加入POCl3(1.5mL,16.4mmol)，并将混合物在0℃下搅拌5min。将该Vilsmeir试剂(7.5mL,10.7mmol)缓慢加入至2a(1.0g,4.5mmol)的DMF(15mL)溶液，并在0℃下搅拌1.5hr。加入饱和醋酸钠溶液(50mL)并在室温下搅拌过夜。在通过TLC检测反应完成后，使用EtOAc稀释反应混合物，并用水和盐水洗涤。在硫酸钠上干燥有机层。浓缩滤液并通过硅胶柱色谱(DCM:EtOAc=9:1)纯化以产生绿黄色固体(1.07g,85%)。1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ10.59(bs,2H,2-NH),9.20(s,2H,2-CHO),7.31(m,5H,-Ph),6.86(dd,J=2.4,4.0,2H,2-CH),6.06(dd,J=2.4,3.2,2H,2-CH),5.59(s,1H,-CH)；13C-NMR(CDCl3)δ179.02,141.64,139.16,132.67,129.00,128.47,127.72,122.31,111.63,44.46；ESI-MS m/z(M+H)计算值：279.1，实测值279.1。
1,9-二甲酰基-苯基二吡咯甲烷(称为3a的另外的中间体)的合成
在0℃下向2a(500mg,1.80mmol)的DCM(20mL)溶液加入(叔丁氧基羰基亚甲基)-三苯基膦(2.03g,5.40mmol)，并将混合物在室温下搅拌过夜。使用DCM稀释反应混合物并使用盐水洗涤。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，浓缩并通过硅胶柱色谱(EtOAc:DCM=1:40)纯化以产生绿黄色固体3a(375mg,44%)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(bs,2H,2-CH),7.32(d,J=16.0,2-CH),7.26(m,5H,-Ph),6.42(app t,J=2.8,2H,2-CH),5.94(app t,J=2.8,2H,2-CH),5.77(d,J=16.0,2H,2-CH),5.45(s,1H,-CH)；13C-NMR(CDCl3)；166.91,140.24,136.36,132.95,129.02,128.52,128.32,127.63,114.68,113.00,110.38,80.12,44.33,28.25；ESI-MS m/z(M+H)计算值：475.2，实测值475.2
最终产物Bodipy二丙烯酸(上文称为4a)的合成
向3a(200mg,0.421mmol)的DCM(35mL)溶液加入DDQ(144mg,0.636mmol)。在室温下搅拌15min后，将混合物冷却至0℃。向该混合物加入DIEA(2mL,11.6mmol)和BF3OEt2(1.4mL,11.1mmol)并缓慢升温至室温同时搅拌2hrs。使用DCM稀释反应混合物，并用NaHCO3水溶液和盐水洗涤。在硫酸钠上干燥有机层并将滤液浓缩并通过硅胶层析纯化。为了水解叔丁酯，在0℃下将BF3OEt2(0.3mL)加入至酯的DCM(70mL)溶液。在搅拌1hr后，使用DCM稀释反应混合物并使用HCl水溶液酸化至pH3。使用5%iPrOH/DCM将水层萃取五次。在硫酸钠上干燥有机层。将滤液浓缩并通过硅胶层析(MeOH:DCM:H2O=10:50:1)纯化以产生4a(60mg,80%)1H-NMR(400MHz,CDCl3+CD3OD)δ8.11(d,J=16.0,2H),7.58(m,5H,Ph),7.04(d,J=4.0,2H),6.96(d,J=4.0,2H),6.66(d,J=16.0,2H)；13C-NMR(CDCl3+CD3OD)167.88,131.98,131.62,131.41,130.80,130.17,128.47,128.29,128.11,127.35,126.01,125.35；ESI-HRMS m/z(M+Na)+计算值：431.0985，实测值431.0990。
中间体(4-(二(1H)-吡咯基-2-基)甲基)苯基)(吗啉代)甲酮(称为1b)的合成
向4-(吗啉-4-羰基)苯甲醛(220mg,1.0mmol)的DCM(10ml)溶液加入吡咯(2.2mmol)。将混合物在氮气下吹风10min。加入TFA(0.1mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4hrs。使用0.2N NaOH水溶液(20ml)淬灭反应并用EtOAc萃取。用盐水洗涤有机层并在硫酸钠上干燥。将滤液浓缩并通过硅胶层析(DCM:EtOAc=8:1)纯化以产生1b(108mg,32%)。1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.06(bs,2H,2-NH),7.35(d,J=8.4,2H,2-CH),7.26(d,J=8.4,2H,2-CH),6.70(dd,J=1.8,4.2,2H,2-CH),6.16(dd,J=3.0,6.0,2H,2-CH),5.90(bs,2H,2-CH),5.49(s,1H,-CH),3.71(bt,8H,4-CH2-)；13C-NMR(CDCl3)δ170.2,144.20,131.70,128.53,127.63,127.41,117.42,108.44,107.32,66.83,43.78,38.66.ESI-MS m/z(M+H)+计算值：336.2，实测值336.1。
另外的中间体(5,5’-((4-(吗啉-4-羰基)苯基)亚甲基)双(1H-吡咯-2甲醛)(称为2b)的合成
向DMF(1mL)缓慢加入POCl3(150μL,1.60mmol)，并将混合物在0℃下搅拌5min。将该Vilsmeier试剂(750mL,1.10mmol)缓慢加入至1b(150mg,0.45mmol)的DMF(1.50mL)溶液，并在0℃下搅拌1.5hr。加入饱和醋酸钠溶液(5mL)并在室温下搅拌过夜。在通过TLC检测反应完成后，使用EtOAc稀释反应混合物，并用水和盐水洗涤。在硫酸钠上干燥有机层。将滤液浓缩并通过硅胶柱层析(DCM:EtOAc=5:1)纯化以产生绿黄色固体(142g,81%)。1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ10.67(bs,2H,2-NH),9.32(s,2H,2-CHO),7.34(d,J=8.4,2H,2-CH),7.24(d,J=8.4,2H,2-CH),6.90(dd,J=1.8,4.2,2H,2-CH),6.09(dd,J=2.4,3.2,2H,2-CH),5.60(s,1H,-CH),3.72(bt,8H,4-CH2-)；13C-NMR(CDCl3)δ176.09,163.61,146.38,137.67,131.53,130.60129.22,128.36,128.33,123.08,111.92,67.45,54.09,39.24；ESI-MSm/z(M+H)+计算值：391.2，实测值391.1。
最终产物(上文称为4b)的合成
在0℃下，向2b(40mg,0.10mmol)的DCM(1mL)溶液加入甲氧基羰基亚甲基三苯基膦(100mg,0.30mmol)。在室温下搅拌过夜后，使用DCM稀释反应混合物并用盐水洗涤。在硫酸钠上干燥有机层。将滤液浓缩并通过硅胶柱层析(DCM:EtOAc=8:1)纯化以产生绿黄色固体(36mg,71%)；将该黄色固体(36mg,0.07mmol)溶于DCM(7mL)。向该溶液加入DDQ(24mg,0.11mmol)。在室温下搅拌15min后，将反应混合物冷却至0℃。向该溶液加入DIEA(295μL,1.75mmol)和BF3OEt2(225μL,1.75mmol)并缓慢升温至室温同时搅拌2hrs。使用DCM稀释反应混合物，并用饱和NaHCO3和盐水洗涤。在硫酸钠上干燥有机层。将滤液浓缩并通过硅胶层析(DCM:EtOAc=10:1)纯化以产生4b(24mg,62%)1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ8.14(d,J=15.9,2H,2-CH),7.55(m,4H,-Ph),6.91(d,J=4.5,2H,2-CH),6.87(d,J=4.5,2H,2-CH),6.60(d,J=15.9,2H,2-CH),3.87(s,6H,2-CH3),3.84(bt,4H,2-CH2-),3.80(bt,4H,2-CH2-)；13C-NMR(CDCl3)169.14,166.14,132.95,132.15,132.02,131.99,131.57,130.67,128.60,128.44,127.39,125.53,66.86,58.19,29.70；ESI-HRMS m/z(M+Na)+计算值：572.1780，实测值572.1786。
实施例2
肽段(P1-P6)的制备
使用标准Fmoc-保护的氨基酸/HBTU偶联步骤在Rink酰胺MBHA树脂上合成肽，随后哌啶脱保护[偶联步骤条件：树脂(100mg,0.48mmol/g)，0.5M HBTU的DMF(0.6mL)，0.5MFmoc-氨基酸的NMP(0.6mL)和2.0M DIEA的NMP(0.42mL)时间为3.5小时；脱保护条件：20%哌啶的NMP(1.5mL)时间为1小时]。通过乙酰化(0.3M的Ac2O和0.27M的HOBt的DCM时间为2小时)将最终的N-端覆盖。将肽脱保护并使用试剂K溶液(TFA:H2O:茴香硫醚:苯酚:EDT=10mL:0.5mL:0.5mL:0.75g:0.25mL)从树脂中裂解。将各个裂解溶液排出至冷冻的乙醚(20mL)以沉淀肽。将肽溶液保持在-20℃过夜用于最大沉淀。将沉淀物过滤并干燥。通过C18制备柱上的反相HPLC纯化肽，线性梯度为含0.1%TFA的0%～50%乙腈的H2O。将收集的肽溶液冻干并将肽固体保持在-20℃。通过LC-MS测定纯度，使用两个不同条件柱C18，4.6×50mm和C184.6×150mm，在214nm的波长下使用不同的洗脱液组成。肽P1、P2、P3和P6的LC-MS色谱图在图5中示出。
实施例3
测定染料和肽之间的反应速率常数的计算方法
由于肽大大过量，因此认为在与染料的反应过程中肽浓度为常数。染料和肽之间的反应被认为是准一级反应。
r=k[染料][肽]=k’[染料]=-d[染料]/dt
d[染料]/[染料]=-k’dt
ln[染料]=-k’t+ln[染料]0
ln([染料]0/[染料])=k’t
因为[染料]0/[染料]=[产物]∞/([产物]∞-[产物])=F∞/(F∞-Ft)
因此如果我们绘制ln(F∞/(F∞-Ft))随时间t的图，则斜率值为k’，其为准一级反应速率常数。
[染料]：随时间t的染料浓度
[染料]0：染料初始浓度
[产物]：时间t的产物浓度
[产物]∞：产物最终浓度
F∞：饱和时产物(530nm)的荧光强度
Ft：时间t时产物(530nm)的荧光强度
实施例4
表达载体的构建
Pc-RC·myc：合成编码RC标签(P1肽段)的寡核苷酸(RC·myc)连同Myc-标签(GGGGC标签CCCACCATGGAAGCTGCCGCACGTGAAGCGAGATGTCGTGAGCGCTGCGCGAGAGAAGCTTGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGGGATCCCC，下划线为插入用于克隆的限制酶位点)。绿色标出的核苷酸编码RC标签且蓝色标出的核苷酸编码myc标签。插入Myc标签以用作免疫印迹中的表位用于确认重组蛋白质表达。使用“RC·myc”作为模板，使用两个短引物进行PCR(GGGGC标签CCCACCATGGAA+GGGGGATCCCAGATCCTCTTC)。使用NheI/BamHI消化生成的PCR产物并将其亚克隆入pcDNA3.1(+)(Invitrogen)的NheI/BamHI位点内。该克隆被命名为pc-RC·myc并且用于进一步的亚克隆。
pc-RC·myc·cherry：使用引物(GCTGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGACAACATG+GGGCTCGAGTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGCCGGTGGA)扩增红色荧光蛋白质(mcherry)的开放读码框(ORF)，使用pc-m cherry(Clontech)作为模板并插入至pc-RC·myc的BamHI/XhoI位点。产生的质粒(pc-RC·myc·cherry)表达标记有P1肽和myc-标签的单体cherry。
RC标记突变的克隆(m1，m2，m3)：通过定点诱变PCR制备与三个突变标签融合的载体表达mcherry。编码半胱氨酸位置中的精氨酸的寡核苷酸组被设计为下列。
m1_S：GCACGTGAAGCGAGAGCTCGTGAGCGCTGCGCG
m1_AS：CGCGCAGCGCTCACGAGCTCTCGCTTCACGTGC
m2_S：AGATGTCGTGAGCGCGCCGCGAGAGCTAAG
m2_AS：CT标签CTCTCGCGGCGCGCTCACGACATCT
m3_S：AGAGCTCGTGAGCGCGCCGCGAGAGCTAAg
m3_AS：CT标签CTCTCGCGGCGCGCTCACGAGCTCT
25ng的pc-RC·myc·cherry用作突变用的模板并使用pfu DNA聚合酶进行PCR-反应，循环属性为95℃30sec，(95℃30sec，55℃60sec，68℃10min)×16圈。使用DpnI将反应产物消化1小时并转化为大肠杆菌菌株(E.coli strain)DH5。通过核苷酸序列确认获得的突变克隆并分别指定为pc-(m1)RC·myc·cherry、pc-(m2)RC·myc·cherry、pc-(m3)RC·myc·cherry。
pc-RC 2 ·myc·cherry：合成使用Myc标签但不使用Kozak或初始蛋氨酸密码子(ATG)的编码RC标签的寡核苷酸(RC2·myc：CAAGCTTGAAGCTGCCGCACGTGAAGCGAGATGTCGTGAGCGCTGCGCGAGAGCTGAATTCGCCGATATCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGGGATCCC)。使用“RC2·myc”作为PCR模板，使用引物
(CCCAAGCTTGAAGCTGCCGCA+GGGGGATCCCAGATCCTCTTC)扩增“RC2·myc”。使用HindIII/BamHI消化产生的PCR产物并插入至pc-pc-RC·myc·cherry的HindIII/BamHI位点。获得的克隆具有二聚的RC标签和与cherry融合的myc表位。通过产生的RC2编码的氨基酸序列在下面示出。
RC：MEAAAREARCRERCARA
RC2：MEAAAREARCRERCARAKLEAAAREARCRERCARA
pc-RC 2 ·(NLS)·myc·cherry：如下合成编码SV40大T抗原[S2]的核定位信号的三重复制品的寡核苷酸。通过煮沸在Tris-缓冲液(100mMNaCl，50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，pH7.9)中杂交寡核苷酸并缓慢冷却至室温并使用EcoRI/EcoRV消化。将消化的双链DNA片段插入至pc-RC2·myc·cherry的EcoRI/EcoRV位点并将产生的克隆命名为pc-RC2·(NLS)·myc·cherry。
3×NLS(S)：CCCGAATTCGATCCCAAAAAGAAACGCAAGGTGGATGATCCCAAAAAGAAACGCAAGGTGGATGATCCCAAAAAGAAACGCAAGGTGGATATCGGG
3×NLS(AS)：CCCGATATCCACCTTGCGTTTCTTTTTGGGATCATCCACCTTGCGTTTCTTTTTGGGATCATCCACCTTGCGTTTCTTTTTGGGATCGAATTCGGG
pc-RC 2 ·myc·H2B：使用正常人成纤维细胞的cDNA PCR扩增人组蛋白H2B的ORF。引物使用的扩增为(GGGGGATCCATGCCTGAACCGGCAAAATC+GGGCTCGAGTCACTTGGAGCTGGTGTACT)并使用BamHI/XhoI消化产生的PCR产物并亚克隆入pc-RC2·myc·cherry的BamHI/XhoI位点以使用H2B的ORF交换cherry的ORF。
pc-RC 2 ·myc·H2B·cherry：使用引物(GGGGAATTCATGCCTGAACCGGGCAAAATC+GGGGATATCCTTGGAGCTGGTGTACTTGG)PCR-扩增人H2B的ORF并使用EcoRI/EcoRV消化PCR产物。将消化的DNA插入pc-RC2·(NLS)·myc·cherry的EcoRI/EcoRV位点以使用H2B ORF交换NLS。
pc-RC·cherry：使用引物(GGGAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG+GGGCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGCCGGTGGA)扩增cherry的ORF并使用HindIII/XhoI消化产生的PCR产物并引入至pc-RC·myc·cherry的HindIII/XhoI位点以产生pc-RC·cherry。
pc-6×His·myc·RC·cherry：引物GGGC标签CCACCATGCATCATCATCATCACCACGAATTCGAACAAAAACTCACTCAGAA+CCCAAGCT标签CTCTCGCGCAGCGCTCACG)用于扩增“6×His标签和RC标签”的表达盒。使用Nhe1/HindIII消化产生的PCR产物并插入在pc-RC·myc·cherry的NheI/HindIII位点内。pc-cherry·myc·RC：引物(GGGAATTCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGGATATCGAAGCTGCCGCACGTGAA+CCCCTCGAGTCAAGCTCTCGCGCAGCGCTC)用于扩增“myc标签-RC标签”盒并使用EcoR1/Xho1消化产生的PCR产物并克隆入pcDNA3.1(+)内，产生pc-myc·RC。cherry的ORF为使用(GGGGC标签 CCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG+GGGGAATTCCTTGTACAGCTCTCCATGCCGCCGGTGGA)扩增的PCR并将获得的PCR产物克隆入pc-myc·RC的NheI/EcoRI位点内，产生pc-cherry·myc·RC。
实施例5
参考图1，示出公开的化合物，其中R1和R2都是处于其离解形式的丙烯酸基团。示出离解的化合物以与偶联至靶蛋白的公开的肽段形成复合物。公开的肽段包含两个半胱氨酸基团，各自与精氨酸配对，由此形成如图1所示的两个精氨酸-半胱氨酸对。公开的化合物通过两个半胱氨酸基团各自的硫醇部分与公开的肽段结合。在各个实例中，结合由于加成反应而发生，在此过程中半胱氨酸基团的亲核硫醇部分进攻相邻R1或R2中的吸电子羧基的烯烃部分。因此，半胱氨酸基团的硫醇部分充当亲核试剂，同时相邻R1或R2中的羧基的烯烃部分充当亲电试剂。该加成反应导致半胱氨酸基团的硫原子和R1或R2中的β-碳原子之间的共价键的形成。
有利地，相邻半胱氨酸基团的精氨酸基团的存在降低硫醇部分的pKa并在生理学pH中增加半胱氨酸基团的亲核性。
在图1中示出的实施方案中，分隔R1和R2中的两个烯烃部分的距离近似相应于分隔两个硫醇部分或半胱氨酸基团的距离。有利地，这样的排列促进两个加成反应发生以能够实现两个半胱氨酸基团的硫原子和R1和R2的烯烃部分之间的两个共价键的形成。各个加成反应使烯烃部分转化为链烷部分，由此破坏由公开的化合物4a中的烯烃部分R1和R2提供的延长共轭。
能够看出，化合物4a最初发射橙色荧光(由于取代基R1和R2提供的延长共轭，各自成为丙烯酸部分)。公开的肽段与化合物4a的结合，其破坏公开的化合物中的延长共轭，导致发射绿色荧光的结合复合物，即恢复至化合物4a的Bodipy核心的荧光行为。
对比实施例1
参考图6，比较了在各个浓度下化合物4a和4b的光谱性质。能够看出，在接近610nm下化合物4a和4b二者都具有荧光发射峰。
对比实施例2
参考图2，示出单独的化合物4a和在50mN HEPES(pH7.4)中使用下列培养的化合物4a的荧光反应：
P1：如由CD光谱法证实的，10μM的在i和i+4位置具有两个半胱氨酸的模型肽，AcEAAAREARCRERCARA形成α-螺旋；
P2：具有一对Arg-Cys的对照肽，AcEAAAREAAARERCARA；
P3：没有Arg-Cys对，AcEAAAREAAAREAARA；
NAC：10-倍过量的N-乙酰基半胱氨酸。
由图2能够看出P1的加成诱导立即的光谱变化。这导致大的发射的蓝光移动至绿色荧光(530nm)。Arg残基似乎有助于迅速反应，因为没有它们的对照肽(P3)诱导较慢的反应。相比之下，P2产生轻微的光谱变化，在565nm的新发射峰，可能由于与Arg-Cys对的单一共轭，并且P3(对照)显示没有。显著地，10-倍过量的N-乙酰基半胱氨酸(NAC)在565nm下诱导小的峰。
在附加的动力学研究中(参考图7)，发现化合物4a和肽段P1具有k=0.1484s-1的反应速率常数。在没有精氨酸的情况下，如从k=0.0882s-1的反应速率显而易见的是在化合物4a和肽段P6(没有精氨酸)之间发生较慢的反应。
如从图2c能够看出模型肽P1在i和i+4位置具有两个半胱氨酸基团。从另一研究中，通过CD光谱法P1被证实形成α-螺旋(参见图8)。
在另一附加的研究中(参考图9)，测定了使用上述列举的模型肽培养的4a的时间依赖性荧光反应。
在另一附加的研究中(参考图10)，确认了化合物4a和肽段P1之间的共轭。
确认在公开的化合物4a和公开的肽段P1之间的形成的复合物之后，设计了包含公开的模型肽段P1的氨基酸序列的称为“RC”标签的肽标签。
对比实施例3
参考图3a，示出所公开的化合物4b的结构，其中R3为被吗啉代羰基部分取代的苯基，且R1和R2独立地为丙烯酸甲酯部分。有利地，化合物4b显示良好的细胞渗透性和低的细胞背景。
参考图3b，如在对比实施例2中提及的示出基于公开的肽段P1的肽标签“RC”。肽标签“RC”与模型蛋白质(单体cherry，红色荧光蛋白质)融合。在凝胶电泳(SDS-PAGE)中分析化合物4b与RC-标记的cherry偶联。
转染细胞的蛋白质提取物在预期的分子量(34kDa)下显示由于化合物4b与RC-标记的cherry的共价结合产生的明显绿色荧光带。应当注意仅当如实提供两个半胱氨酸残基时获得该光谱变化，这是因为如图3b和图11所示，RC标签中一个或两个半胱氨酸上的突变完全禁止光谱变化。
然而，当在细胞中表达RC-标记的cherry时，通过使用4b染色提供的绿色荧光信号略强以被用于清楚的光学成像(参见图12，其显示在RC·myc·cherry柱中比RC2·myc·cherry列更小或较小强度的信号)。因此，提议将RC标签二聚，由此加倍标签(RC2)中的结合基序(-RCXXRC)。
对比实施例4
参考图4，示出在293A细胞中表达的RC2标记的重组蛋白质上标记的化合物4b的荧光显微图像。用化合物4b(1μM，15min，37℃)染色使用各个表达载体(a～e)转染的细胞并在活细胞中采集图像。用于荧光成像的滤光器为BF-明场、D-DAPI、F-FITC、C-Cy5、M-融合、比例尺-50μm，HA-血细胞凝集素标签。
有利地，RC2标签在凝胶中产生比RC更强的荧光带(参见图3c)。
有利地，在结合化合物4b与RC2标签中，通过预期的光谱变化细胞图像显示比与RC标签结合更强的绿色荧光并且从细胞内部的cherry中绿色荧光与红色信号明显重叠(参见图4a和图12)。当RC2标记的cherry的表达限制于细胞核时，通过向表达盒引入核定位信号(NLS)，根据能被观察到的cherry的荧光，来自化合物的荧光信号也被严格局限于转染细胞中的细胞核(参见图13)。明显地，如图12所示，来自二聚RC标记的蛋白质(RC2·myc·cherry)的信号显著强于单体RC标记的蛋白质(RC·myc·cherry)。
使用组蛋白H2B作为实际的细胞蛋白质测试化合物4b和RC2标签标记系统(tag labeling system)的性能。在该实施方案中，将‘RC2.myc’盒与人H2B的N-端连接，然后将cherry与人H2B的C-端融合作为标记以检验表达。
有利地，在活细胞中探针4b成功染色标记的H2B表明转染细胞中明显的细胞核染色(参见图4b)。
在没有cherry的H2B的平行实验中，探针4b和RC2标签向标记的H2B提供可靠的标记，其在没有跟踪标记(cherry)的帮助下是足够特异性的而被识别(参见图4c)。此外，RC2与其它肽标签相容。因此，与诸如HA标签、myc标签或六组氨酸标签的其它小肽标签的结合是可能的，并且所述结合几乎不影响标记效率(参见图4d)且C-端标记也是有效的(参见图14)。
应用
公开的化合物显示作为用于相关的蛋白质的光学成像的分子或成像探针的前景。
有利地，公开的化合物不包含诸如砷原子的有毒元素且因此具有可以忽略的毒性。
有利地，公开的化合物尺寸相对小并且可穿过细胞膜。
有利地，用于结合所公开的化合物的所公开的肽段尺寸也相对小并且可穿过细胞膜。
有利地，在一个实施方案中，可排列分隔所公开的化合物的‘结合臂’的烯烃部分的距离近似相应于分隔肽段的半胱氨酸基团的距离以促进公开的化合物和所公开的肽段之间的结合。
有利地，在结合后公开的化合物和肽段形成稳定的复合物。
有利地，公开的肽段与公开的化合物的结合可产生立即和显著的光谱变化，或所公开的化合物的荧光性质的显著变化。
有利地，可以安全和有效的方式使用公开的化合物和肽段以成像或研究细胞外环境中或活细胞内部的靶蛋白。
显然在不违背本发明实质和范围下，在阅读前述公开内容后本发明各种其它修改和变型对本领域技术人员而言显而易见并且意图使所有这样的修改和变型在附加的权利要求的范围内。

Claims (41)

1.式I的化合物或其盐
Figure FDA0000407067580000011
其中
各个R1和R2是具有至少一个吸电子基团部分的任意取代的烯烃；
R3选自氢、任意取代的芳基、羟基、胺、磺酸和任意取代的脂肪族基团；
R4和R5独立地选自卤素或脂肪族基团。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R1和R2相同。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述R1和R2的烯烃部分具有2至20个碳原子。
4.如权利要求3所述的化合物，其中所述R1和R2的烯烃部分具有2个碳原子。
5.如权利要求3所述的化合物，其中所述R1和R2的烯烃部分具有4至20、4至12或4至6个碳原子。
6.如权利要求5所述的化合物，其中R1和R2为分别具有吸电子基团部分的共轭烯烃。
7.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中所述至少一个吸电子基团部分与所述烯烃部分相邻。
8.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中所述至少一个吸电子基团部分选自卤素、醛、酮、酯、羧酸、酰氯、三氟甲基、腈、磺酸、铵、酰胺、氨基、偶氮基、硝基、砜和膦酸酯部分。
9.如权利要求4、7和8所述的化合物，其中R1和R2选自任意取代的丙烯酸酯、丙烯酸、丙烯酰、丙烯腈和丙烯酰胺部分。
10.如权利要求9所述的化合物，其中R1和R2独立地为任意取代的丙烯酸酯部分。
11.如权利要求10所述的化合物，其中所述丙烯酸酯部分的酯基团具有1至4、1至3或1至2个碳原子。
12.如权利要求11所述的化合物，其中所述丙烯酸酯部分的酯基团具有1个碳原子，从而R1和R2独立地为丙烯酸甲酯。
13.如权利要求1-13中任一权利要求所述的化合物，其中R3为取代的芳基。
14.如权利要求14所述的化合物，其中R3为取代的苯基。
15.如权利要求15所述的化合物，其中所述苯基被杂环基团取代。
16.如权利要求16所述的化合物，其中所述杂环基团为吗啉基团。
17.如权利要求17所述的化合物，其中所述杂环基团为吗啉碳酰基团。
18.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R4和R5独立地为氟原子。
19.式I-A的化合物
其中
n为选自1至10、1至7、1至4的整数或n=1、n=2或n=3；
R3独立地选自氢或任意取代的芳基；
R6为氢或具有1至6个碳原子的低级烷基。
20.式I-B的化合物
其中R6为氢或具有1至6个碳原子的低级烷基。
21.式I-C的化合物
Figure FDA0000407067580000041
22.肽段，包含两个或多个能够与权利要求1-21中任一权利要求所述的化合物结合的半胱氨酸基团以由此诱导所述化合物的荧光性质的变化，所述肽段能够被连接至靶蛋白或被整合在靶蛋白序列内部。
23.如权利要求22所述的肽段，其包含两个半胱氨酸基团。
24.如权利要求23所述的肽段，其中所述肽段和权利要求1-21中任一权利要求所述的化合物之间的结合包括各个半胱氨酸基团的硫原子与权利要求1-21中任一权利要求所述的化合物的各个R1和R2的烯烃碳原子形成共价键。
25.如权利要求23-24所述的肽段，其中所述肽段具有两个半胱氨酸基团，其被被它们之间的1至10或2至5个氨基酸间隔开。
26.如权利要求25所述的肽段，其中所述两个半胱氨酸基团被它们之间的3个氨基酸间隔开。
27.如权利要求23或26中任一权利要求所述的肽段，其中所述肽段还包含与各个半胱氨酸基团相邻的精氨酸基团，由此形成两个半胱氨酸-精氨酸或精氨酸-半胱氨酸对。
28.如权利要求26和27所述的肽段，其中两个半胱氨酸-精氨酸或精氨酸-半胱氨酸对被它们之间的3个氨基酸间隔开。
29.如权利要求23-28中任一权利要求所述的肽段，其用于与权利要求1-21中任一权利要求所述的化合物结合，其中所述两个半胱氨酸基团或半胱氨酸-精氨酸对或精氨酸-半胱氨酸对之间的距离大约与各个R1和R2的烯烃部分之间的距离相当。
30.复合物，其包含与权利要求23-29中任一权利要求所述的肽段共价结合的权利要求1-21中任一权利要求所述的化合物。
31.如权利要求30所述的复合物，其中所述肽段与靶蛋白连接。
32.权利要求1-21中任一权利要求所述的化合物作为成像探针的用途，所述化合物与权利要求22-29中任一权利要求所述的肽段联合使用。
33.在生物基质中成像靶蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
d)提供至少一个权利要求22-29中任一权利要求所述的肽段以为靶蛋白添加标签；
e)提供式I的化合物以使所述式I的化合物和所述至少一个肽段之间共价连接；以及
f)使所述生物基质中的所述结合的复合物成像。
34.如权利要求33所述的方法，其中在步骤a)中所述肽段与所述靶蛋白直接或间接连接。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述生物基质是细胞内基质或细胞外基质。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述生物基质在活细胞内部产生。
37.如权利要求36所述的方法，其中步骤b)提供了其中R1和R2各自为丙烯酸酯的式I的化合物。
38.如权利要求37所述的方法，其中步骤b)提供了其中R1和R2各自为丙烯酸甲酯且R3为被吗啉碳酰基团取代的苯基的式I的化合物。
39.如权利要求33-38中任一权利要求所述的方法，其中步骤a)包括提供两个权利要求23至31中任一权利要求所述的肽段以为靶蛋白添加标签。
40.成像试剂盒，其包含作为成像探针的权利要求19-21中任一权利要求所述的化合物，以及至少一个权利要求23-29中任一权利要求所述的肽段。
41.如权利要求39所述的成像试剂盒，其包含两个权利要求23-29中任一权利要求所述的肽段。
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