CN103501801A - 甲状旁腺激素类似物、其组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供甲状旁腺激素和/或甲状旁腺激素相关蛋白质类似物、其组合物和其方法。

Description

甲状旁腺激素类似物、其组合物和用途

相关申请案交叉参考

本申请案主张对2011年3月1日提出申请的美国临时申请案第61／448,064号的优先权，所述申请案是全文以引用方式并入本文中。

政府支持声明

本发明部分由国立卫生研究院(National Institutes of Health)的授权号Ca28824-33和NIDDK-11794支持。美国政府在本发明中有一定权益。

序列表

根据PCT规则5.2，呈文本文件格式的序列表(标题为“Sequence_Listing_ST25.txt”，于2012年2月28日创建且大小为17千字节)与本文一起提交且全文以引用方式并入本文中。

技术领域

背景技术

人类甲状旁腺激素(hPTH)是甲状旁腺分泌的作为含有84个氨基酸的肽的生物信使。hPTH是细胞外液中钙浓度和磷浓度的最重要的内分泌调节剂。如果细胞外液中的钙离子浓度(Ca²⁺)下降到低于正常值，那么hPTH可通过刺激骨质吸收、促进钙在肾和肠中的重吸收和／或抑制尿中的钙损失来将钙离子水平恢复到正常范围内。伴随钙浓度升高，血液中的磷酸盐离子浓度降低。即使在高血钙水平下也会分泌低水平的hPTH。

甲状旁腺的功能减弱引发甲状旁腺功能减退症和甲状旁腺激素水平降低。所引发的低钙血症产生诸如以下等症状：手指和脚趾发麻、肌肉痛性痉挛和痉挛，惊厥、疼痛和皮肤干燥。尽管甲状旁腺功能减退症导致骨密度增加，但其也与较高脆弱状态有关，人们相信这是由于不存在甲状旁腺激素活性时的骨重建缺陷所致。此外，尽管慢性分泌或连续输注甲状旁腺激素导致骨脱钙，且导致骨量减少，在某些情况下，用重组甲状旁腺激素治疗可实际上刺激骨量和骨强度增加。在以脉冲方式(例如通过每天注射一次)投与激素时发生这种表面上矛盾的效应，且所述治疗似乎是对诸如骨质疏松等疾病的有效疗法。

发明内容

本发明提供具有所需特征的新颖hPTH肽和／或类似物。在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物包括一个或一个以上非天然氨基酸残基。在某些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物包括一个或一个以上正亮氨酸和／或甲氧丁氨酸残基。在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物在实质上全长的hPTH中包括一个或一个以上正亮氨酸和／或甲氧丁氨酸残基。在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物在对应于SEQ IDNO：2中残基8和／或残基18的位置处包括一个或一个以上正亮氨酸和／或甲氧丁氨酸残基。

在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少80％总体序列一致性。

在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物经糖基化。在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物经O-糖基化。在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物经N-糖基化。在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物在对应于SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2中残基1和／或残基33的位置处经糖基化。在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物经一个或一个以上选自由常用于糖蛋白化学合成的碳水化合物的群组的聚糖糖基化。

本发明尤其涵盖以下认知：提高hPTH疗法的稳定性和半衰期有助于提高投与耐受性并增强患者的顺应性。在一些实施例中，本发明提供更稳定的hPTH治疗剂。在一些实施例中，所提供hPTH类似物的稳定性强于SEQ ID NO：1的hPTH(例如，在人类血清中的活体外肽稳定性分析中测量时)。

在一些实施例中，本发明还提供包含一种或一种以上所提供hPTH肽和／或类似物和至少一种医药上可接受的赋形剂的医药组合物。

在某些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物和／或含有其的组合物可用于医学中，例如用于治疗与甲状旁腺激素水平不足相关的疾病、病症或病况的方法中。本发明尤其提供包含向有需要的个体投与所提供组合物或hPTH肽和／或类似物的治疗方法。

本发明还涵盖不依赖半胱氨酸和／或甲硫氨酸残基的天然化学连接技术。在一些实施例中，本发明提供不包括可用半胱氨酸和／或甲硫氨酸残基的用于产生肽或肽类似物的天然化学连接技术。在一些实施例中，本发明提供不包括可用半胱氨酸和／或甲硫氨酸残基的用于产生一种或一种以上激素的天然化学连接技术。在一些实施例中，本发明提供用于产生hPTH肽和／或类似物的天然化学连接技术。

如本文所述提供的天然化学连接技术包括(例如)通过化学连接制备药剂的方法、参与化学连接反应的试剂和／或在化学连接合成中产生和／或利用的中间体。

附图说明

图1绘示对hPTH(1-84)的逆合成分析。

图2绘示人类甲状旁腺激素的化学合成：(a)H-Trp-SPh、EDCI、HOOBt、DIEA、DMSO，3h;(b)TFA：TIS：H₂O(95：2.5：2.5)，45min；(c)Boc-Leu(SSMe)-OH、HATU、DIEA、DMSO，1h；(d)TFE：AcOH：CH₂C1₂(8：1：1)，2h；(e)H-Gly-SCH₂CH₂CO₂Et、EDCI、HOOBt、DIEA、DMSO，1h；(f)H-Leu-SPh、EDCI、HOOBt、DIEA、DMSO，2h；(g)Boc-Val(SSMe)-OH、HATU、DIEA、DMSO，1h；(h)6M Gn·HCl、100mM NaH₂PO₄和50mM TCEP，pH7.5，9h；(i)MeONH₂·HCl，pH4，2.5h；(j)6M Gn·HCl、300mMNaH₂PO₄、200mM MPAA和20mM TCEP，pH7.9；(k)VA-044、tBu-SH、TCEP、H₂O、MeCN，37℃，2h。

图3绘示[Nle^8,18]hPTH(1-34)的化学合成。

图4绘示O-糖基化[Nle^8,18]hPTH(1-34)的化学合成。

图5绘示N-糖基化[Nle^8,18]hPTH(1-34)的化学合成。

图6绘示N-糖基化[Nle^8,18]hPTH(1-34)的化学合成。

图7绘示[Nle^8,18]hPTH(1-84)的化学合成。

图8绘示O-糖基化[Nle^8,18]hPTH的化学合成。(1-84)。

图9绘示N-糖基化[Nle^8,18]hPTH(1-84)的化学合成。

图10绘示N-糖基化[Nle^8,18]hPTH(1-84)的化学合成。

图11绘示对hPTHrP(1-141)的逆合成分析。

图12绘示hPTHrP(1-141)的化学合成：(a)HCi·H₂N-Arg(Pbf)-O-(2-SSEt)-Ph、HOOBt、EDC、CHCl₃、TFE，rt；(b)混合剂B(10mL三氟醋酸[TFA]、200mg苯酚、0.66mL H2O和0.46mL三异丙基硅烷[TIS])，rt；(c)H₂N-Tyr(tBu)-S(CH₂)₂CO₂Et、HOOBt、EDC、CHCl₃、TFE，rt；(d)Boc-Leu(SSMe)-OH、HATU、DIEA、DMF，rt；(e)HOAc／TFE／DCM(1：1：8)，rt；(f)HC1·H₂N-Ser(tBu)-O-(2-SSEt)-Ph、HOOBt、EDC、CHCl₃、TFE，rt；(g)TCEP、pH7.2缓冲剂，rt；(h)TCEP、MPAA、pH7.2缓冲剂，rt；(i)TCEP、t-BuSH、VA-044，37℃。

图13呈现hPTH的圆二色谱。hPTH的未正规化圆二色谱。在208nm和222nm处的最低点是α-螺旋结构的特征。图例：(a)合成PTH与重组PTH在14μM浓度下的CD对比；(b)合成PTH在14μM和7μM下的CD谱。

图14呈现hPTH(1-84)片段I的HPLC和LC／MS谱。

图15呈现hPTH(1-84)片段II的HPLC和LC／MS谱。

图16呈现hPTH(1-84)片段III的HPLC和LC／MS谱。

图17呈现hPTH(1-84)片段IV的HPLC和LC／MS谱。

图18呈现hPTH(1-84)片段V的HPLC和LC／MS谱。

图19呈现hPTH(1-84)片段VII的HPLC和LC／MS谱。

图20呈现hPTH(1-84)片段VIII的HPLC和LC／MS谱。

图21呈现hPTH(1-84)的HPLC和LC／MS谱。

图22呈现[N1e^8，18]hPTH(1-84)片段IX的HPLC和LC／MS谱。

图23呈现[N1e^8，18]hPTH(1-84)片段X的HPLC和LC／MS谱。

图24呈现[N1e^8，18]hPTH(1-84)片段XI的HPLC和LC／MS谱。

图25呈现[N1e^8，18]hPTH(1-84)片段XIII的HPLC和LC／MS谱。

图26呈现[N1e^8，18]hPTH(1-37)片段XIV的HPLC和LC／MS谱。

图27呈现[N1e^8，18]hPTH(1-37)片段XV的HPLC和LC／MS谱。

图28呈现[N1e^8，18]hPTH(1-37)的HPLC和LC／MS谱。

图29绘示hPTH(1-39)的三维图示。

图30呈现hPTHrP(1-141)片段XXX的HPLC和LC／MS谱。

图31呈现hPTHrP(1-141)片段XXXI的HPLC和LC／MS谱。

图32呈现hPTHrP(1-141)片段XXXII的HPLC和LC／MS谱。

图33呈现hPTHrP(1-141)片段XXXIII的HPLC和LC／MS谱。

图34呈现hPTHrP(1-141)片段XXXIV的HPLC和LC／MS谱。

图35呈现hPTHrP(1-141)片段XXXV的HPLC和LC／MS谱。

图36呈现hPTHrP(1-141)片段XXXVI的HPLC和LC／MS谱。

图37呈现hPTHrP(1-141)片段XXXVII的HPLC和LC／MS谱。

图38绘示hPTH(1-84)在储存七(7)天后的稳定性。

图39绘示[Nle^8，１８]hPTH(1-84)在储存七(7)天后的稳定性。

图40绘示hPTH(1-37)在储存七(7)天后的稳定性。

图41绘示[Nle^8,18]hPTH(1-37)在储存七(7)天后的稳定性。

图42绘示hPTH类似物的活体外活性。在使用从经转染以表达呈R⁰(A)或RG(B)构象的人类PTHR1的COS-7细胞制备的膜执行的竞争分析中评价PTH类似物的结合，如材料和方法中所述。在经瞬时转染以表达hPTHR1的HEK-293细胞中执行cAMP分析；在配体刺激后通过放射性免疫分析测量细胞内cAMP(C)。还在经在含有cAMP反应单元(cAMP-response element)的启动子的转录控制下编码荧光素酶基因的报道子质粒(CRE-Luc)共转染的细胞中评价cAMP信号传导，并响应PTH类似物的不同浓度测量发光(D)。数据是三次实验的平均值(±s.em.)，每次实验以一式两份执行。分析参数报告于表1中。

图43绘示hPTH类似物的活体内活性。在小鼠中PTH类似物对血液Ca⁺⁺水平的效应。向9周龄雄性C57BL／6小鼠(总计32到35只)皮下注射媒剂或PTH类似物(20nmol／kg)，且其后在指示时间采集尾静脉血(t=0指示在即将注射前采集的血液，在注射后1、2、4或6小时)并评价血液离子化Ca⁺⁺的浓度。

具体实施方式

定义

生物活性.本文所用词组“生物活性”是指在生物系统中、特别是在生物体中具有活性的药剂的特征。例如，在投与生物体时对所述生物体具有生物效应的药剂视为具有生物活性。在具体实施例中，如果蛋白质或多肽是生物活性的，那么所述蛋白质或多肽中共享所述蛋白质或多肽的至少一种生物活性的部分通常称作“生物活性”部分。

载剂.术语“载剂”是指可纳入含有活性剂(例如，本发明的肽和／或类似物)的组合物中并且不显著干扰所述药剂的稳定性和／或活性(例如，不显著干扰所述药剂的生物活性)的任何化学实体。在某些实施例中，术语“载剂”是指医药上可接受的载剂。本文中的实例性载剂是水。

组合.本文所用术语“组合”、“组合的”和相关术语是指个体同时暴露于两种或两种以上本发明治疗剂中。例如，本发明化合物可与另一治疗剂在单独的单位剂型中或在单一单位剂型中一起同时或依序投与。因此，本发明尤其提供给药方案，其涉及至少投与本发明的肽、另一治疗剂和医药上可接受的载剂、佐剂或媒剂(通常与所述肽和所述另一治疗剂结合的医药上可接受的载剂、佐剂或媒剂)。

对应于.本文所用术语“对应于”通常用于指定甲状旁腺激素肽中氨基酸残基的位置／身份。所属领域技术人员将了解，出于简化目的，本文中采用规范的编号系统(基于野生型hPTH-例如，SEQ ID NO：1)，从而使得(例如)“对应于”位置19处残基的氨基酸不需要实际上是具体氨基酸链中的第19个氨基酸，而是对应于在野生型hPTH位置19处发现的残基；所属领域技术人员可易于了解如何鉴别对应氨基酸。

调配物.术语“调配物”是指用于投与患者的包括至少一种活性剂(例如，本发明的肽和／或类似物)以及一种或一种以上载剂、赋形剂或其它医药添加剂的组合物。一般来说，具体载剂、赋形剂和／或其它医药添加剂是根据业内知识来选择以获得活性剂的所需稳定性、释放、分配和／或活性且其适用于具体投与途径。

分离的本文所用术语“分离的”是指如下药剂或实体：(i)己与至少一些在最初产生时(在自然界中或在实验环境中)与其结合的组份分离；或(ii)是人工产生的。分离的药剂或实体可与至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或90％以上的最初与其结合的其它组份分离。在一些实施例中，分离药剂的纯度超过90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

非天然氨基酸.词组“非天然氨基酸”是指具有氨基酸的化学结构(即：

且因此能参与至少两个肽键，但R基与在天然氨基酸中发现的R基不同的实体。在一些实施例中，非天然氨基酸还可具有不为氢的另一R基，和／或可在氨基部分和／或羧酸部分上具有一个或一个以上其它取代。非天然氨基酸的非限制性实例包括正亮氨酸(N1e)、甲氧丁氨酸(Mox)、羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸或2-氨基-异丁酸。

甲状旁腺激素类似物：如本文所述，甲状旁腺激素类似物是氨基酸序列与野生型人类甲状旁腺激素相比包括至少一个点突变的甲状旁腺激素肽。在一些实施例中，甲状旁腺激素类似物包括至少一个如本文所述的非天然氨基酸残基。

甲状旁腺激素肽:一般来说，本文所用术语“甲状旁腺激素肽”是指长至少约3个到85个氨基酸且显示与野生型甲状旁腺激素具有至少80％总体序列一致性的多肽或其部分。在一些实施例中，与野生型甲状旁腺激素的总体序列一致性≥81％、≥82％、≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％。在本文中的多个实施例中，野生型甲状旁腺激素是例如如SEQ ID NO：1中所示的野生型人类甲状旁腺激素。在一些实施例中，除了这种总体序列一致性以外，所提供甲状旁腺激素肽包括一个或一个以上例如如本文所述的具体序列单元(sequence element)。在一些实施例中，所述具体序列单元是在一般甲状旁腺激素或某些甲状旁腺激素亚组中特有的和／或保守的单元。下文中更详细地阐述甲状旁腺激素肽的具体实施例。

非经肠.本文所用术语“非经肠”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，经口、腹膜内或静脉内投与组合物。本发明组合物的无菌可注射形式可为水性或油性悬浮液。这些悬浮液可根据业内己知技术使用适宜的分散或润湿剂和悬浮剂进行调配。无菌可注射制剂也可为存于无毒非经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如存于1，3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒剂和溶剂包括水、林格氏溶液(Ringer′solution)和等渗氯化钠溶液。另外，常规采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。

患者.本文所用术语“患者”意指向其投与调配物或包含调配物的组合物的哺乳动物，且在一些实施例中包括人类。

医药上可接受的载剂、佐剂或媒剂.术语“医药上可接受的载剂、佐剂或媒剂”是指不破坏与其一起调配的化合物的药理活性的无毒载剂、佐剂或媒剂。可用于本发明组合物中的医药上可接受的载剂、佐剂或媒剂包括(但不限于)离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质(例如人类血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

多肽.一般来说，“多肽”是一串至少两个通过肽键彼此附接的氨基酸。在一些实施例中，多肽可包括至少3-5个氨基酸，每一氨基酸藉助至少一个肽键附接到其它氨基酸。所属领域技术人员将了解，多肽有时包括“非天然”氨基酸或其它仍能整合到多肽链中的实体。

纯净.如果本文所用药剂或实体实质上不含其它组份，那么其是“纯净的”。例如，含有超过约90％的具体药剂或实体的制剂通常视为纯净制剂。在一些实施例中，药剂或实体是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯净。

治疗剂.本文所用词组“治疗剂”是指在投与生物体时诱发所需生物或药理效应的任何药剂。

治疗有效量和有效量除非另外说明，否则本文所用术语药剂的“治疗有效量”和“有效量”是指在疾病、病症或病况的治疗、预防和／或管控中提供治疗益处(例如，延迟一种或一种以上与待治疗疾病、病症或病况有关的症状或使其降到最低(例如，降低发生率和或强度))的量。在一些实施例中，如果组合物含有在治疗方案内以单一剂量投与时有效的量，那么可称组合物含有“治疗有效量”的药剂。在一些实施例中，治疗有效量是在作为给药方案的一部分投与时在统计学上可能使疾病、病症或病况的一个或一个以上症状或副作用延迟发作或使其降到最低(降低发生率和／或强度)的量。在一些实施例中，“治疗有效量”是增强与组合物组合投与的另一药剂的治疗效力的量。在一些实施例中，用于投与人类的治疗有效量对应于根据人类体表面相比于动物模型的体表面积加以调节的参考量(例如，在诸如小鼠模型等动物模型中的治疗有效量)，如业内己知(例如，参见里根-肖(Reagan-Shaw)等人，“再论从动物研究到人类研究的剂量变化(Dosetranslation from animal to human studies revisited)”，美国实验生物学学会联合会杂志(The FASEB Journal)22：659-661(2007)，其全文以引用方式并入本文中)。在一些实施例中，参考治疗有效量是在(例如)如本文所述小鼠模型中治疗有效的量。在一些实施例中，参考治疗有效量在约0.0001mg／kg到约500mg／kg范围内。在一些实施例中，参考治疗有效量在约0.0001mg／kg到约0.001mg／kg范围内。在一些实施例中，参考治疗有效量在约0.001mg／kg到约0.01mg／kg范围内。在一些实施例中，参考治疗有效量在约0.01mg／kg到约0.1mg／kg范围内。在一些实施例中，参考治疗有效量在约0.1mg／kg到约0.5mg／kg范围内。在一些实施例中，参考治疗有效量在约0.5mg／kg到约1mg／kg范围内。在一些实施例中，参考治疗有效量在约1mg／kg到约2.5mg／kg范围内。在一些实施例中，参考治疗有效量在约2.5mg／kg到约10mg／kg范围内。在一些实施例中，参考治疗有效量在约10mg／kg到约50mg／kg范围内。在一些实施例中，参考治疗有效量在约50mg／kg到约100mg／kg范围内。在一些实施例中，参考治疗有效量在约100mg／kg到约250mg／kg范围内。在一些实施例中，参考治疗有效量在约250mg／kg到约500mg／kg范围内。hPTH目前是以20微克(mcg)／天的剂量投与。在一些实施例中，本发明的肽和／或类似物的治疗有效量在0.1mcg／天到50mcg／天范围内。在一些实施例中，本发明的肽和／或类似物的治疗有效量在10mcg／天到100mcg／天范围内。

治疗（Treat或Treating).本文所用术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指部分或完全减轻、抑制病症、疾病或病况或所述病症、疾病或病况的一个或一个以上症状或表现、延迟其发作、降低其发生率、对其进行预防、改善和／或缓解。

单位剂量.本文所用表达“单位剂量”是指适用于待治疗个体的调配物的物理离散单位(例如，用于单一剂量)；每一单位含有预定量的所选活性剂以在任选地与可以预定量提供的医药上可接受的载剂一起根据治疗方案投与(应理解，获得所需效应或最佳效应可能需要多个剂量)时产生所需治疗效应。单位剂量可为(例如)含有预定量的一种或一种以上治疗剂的一定体积的液体(例如，可接受载剂)、预定量的一种或一种以上呈固体形式的治疗剂、含有预定量的一种或一种以上治疗剂的持续释放调配物或药物递送装置等。应了解，单位剂量除治疗剂以外可含有多种组份。例如，如下文所述，可包括可接受的载剂(例如，医药上可接受的载剂)、稀释剂、稳定剂、缓冲剂、防腐剂等。然而，应理解，本发明调配物的总日用量将由出诊医师在正确的医学判断范围内决定。用于任一具体个体或生物体的特定有效剂量水平可取决于多种因素，包括所治疗病症和所述病症的严重度；所用特定活性化合物的活性；所用特定组合物；个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定活性化合物的投与时间和排泄速度；与所用特定化合物组合或同时使用的药物和或其它疗法，和医学界熟知的类似因素。

可用半胱氨酸或甲硫氨酸残基.本文所用术语“可用的”或“可用半胱氨酸和／或甲硫氨酸残基”是指位于使得能合成目标肽或蛋白质的位置处的残基。“可用”半胱氨酸和／或甲硫氨酸残基容许合成中等大小的片段(长度>15个氨基酸或<50个氨基酸)。

“可用”半胱氨酸和／或甲硫氨酸残基是并不位于诸如异亮氨酸(I1e)、缬氨酸(Val)、苏氨酸(Thr)和脯氨酸(Pro)等不利氨基酸的N-末端侧的残基。所属领域技术人员可立即识别所述“可用”半胱氨酸和／或甲硫氨酸残基。

野生型.如业内所理解，词组“野生型”一般是指如在自然界中发现的蛋白质或核酸的正常形式。

甲状旁腺激素肽

人类甲状旁腺激素(hPTH)是甲状旁腺分泌的作为含有84个氨基酸的肽的生物信使。(波茨JT.(Potts JT.)2005.“甲状旁腺激素：过去和现在(Parathyroid hormone：past andpresent).”内分泌杂志(J.Endocrinol.)187：311-25；波茨JT、加德拉TJ.(Gardella TJ.)2007.“进展、悖论和可能性：过去五十年间的甲状旁腺激素研究(Progress，paradox，andpotential：parathyroid hormone research over five decades).”纽约科学院年报(Ann.NYAcad.Sci.)1117：196-208)。通过结合受体，hPTH可提高血液中的钙(Ca²⁺)浓度。(塔尔梅奇RV(Talmage RV)、莫布利HT(Mobley HT).2008.“钙稳态：对甲状旁腺激素作用的重新评价(Calcium homeostasis：reassessment of the actions of parathyroid hormone).”普通与比较内分泌学(Gen.Comp.Endocrinol.)156：1-8)。由于片段hPTH(1-34)具有重要生理作用，现在通过皮下注射给予片段hPTH(1-34)来治疗具有高骨折风险的男性和绝经后女性的甲状旁腺功能减退症和骨质疏松。(多明格斯LJ(Dominguez LJ)、斯卡利西R(Scalisi R)、巴巴格尔罗M(Barbagallo M).2010.“骨质疏松的治疗选择(Therapeuticoptions in osteoporosis).”生物医学学报(Acta Biomed.)81增刊1：55-65；埃勒加德M(Ellegaard M)、乔根森NR(Jorgensen NR)、施瓦茨P(Schwarz P).2010.“甲状旁腺激素和骨愈合(Parathyroid hormone and bone healing).”国际钙化组织(Calcif.Tissue Int.)87：1-13；弗雷泽WD(Fraser WD).2009.“甲状旁腺功能亢进症(Hyperparathyroidism).”柳叶刀(Lancet)374：145-58)。

如同大多数激素药物，重组hPTH治疗剂在人体中半衰期极短且需要每天至少服用一次。(别高马耶C(Bieglmayer C)、普拉格G(Prager G)、尼尔德里B(Niederle B).2002.“在甲状旁腺切除术期间如通过三种快速免疫分析测量的甲状旁腺激素清除的动力学分析(Kinetic analyses of parathyroid hormone clearance as measured by three rapidimmunoassays during parathyroidectomy).”临床化学(Clin.Chem.)48：1731-18；亚伯拉罕AK(Abraham AK)、马杰DE(Mager DE)、高X(Gao X)、李M(Li M)、希利DR(HealyDR)、莫勒TS(Maurer TS).2009.“大鼠和人类中甲状旁腺激素-钙稳态的基于机制的药物代谢动力学／药效学模型(Mechanism-based pharmacokinetic／pharmacodynamic model ofparathyroid hormone-calcium homeostasis in rats and humans).”药理学与实验疗法杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)330：169-78)。需要连续每天皮下注射是明显缺点且己限制所述激素的使用。另外，尤其对于己患有严重骨质疏松的患者，其可引起不适且可引发长期并发症。因此，需要产生更稳定的hPTH形式。(小波茨JT(Potts JT，Jr.)、加德拉TJ、朱普纳H(Juppner H)、克罗嫩伯格HM(Kronenberg HM).1997.“甲状旁腺激素类似物的基于结构的设计(Structure based design of parathyroid hormone analogs).”内分泌杂志154增刊：S15-21；雷斯曼S(Reissmann S)、英霍夫D(Imhof D).2004.“使用约束氨基酸和不同类型的环化研发缓激肽和促生长素抑制素的构象受限类似物(Development ofconformationally restricted analogues of bradykinin and somatostatin using constrainedamino acids and different types of cyclization).”当代医药化学(Curr.Med.Chem.)11：2823-44)。因此，业内需要更稳定有效的hPTH类似物。

在一些实施例中，本发明涵盖以下认知：提高hPTH和／或hPTHrP疗法的稳定性和半衰期有助于提高投与耐受性并增强患者的顺应性。在一些实施例中，本发明提供稳定hPTH治疗剂。在一些实施例中，所提供hPTH类似物的稳定性强于SEQ ID NO：2的hPTH(例如，在人类血清中在活体外肽稳定性分析中测量时)。

在某些实施例中，本发明提供人类甲状旁腺激素(hPTH)肽和／或类似物。

全长野生型hPTH序列绘示为SEQ ID NO：1。在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2总体≥80％、≥81％、≥82％、≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或≥99％以上一致。

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7总体≥80％、≥81％、≥82％、≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或≥99％以上一致。

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15总体≥80％、≥81％、≥82％、≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或≥99％以上一致。

在某些实施例中，本发明提供长度为3-84个氨基酸的甲状旁腺激素肽和／或类似物。在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列具有至少最小长度且不超过最大长度，其中最小长度是(例如)至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或37个以上氨基酸，且其中最大长度不超过84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71或70个氨基酸的长度。

在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物长度为84个氨基酸。

在某些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物长度为34个氨基酸。

在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物长度为37个氨基酸。

在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物长度为39个氨基酸。

在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物包括至少一个选自由正亮氨酸、甲氧丁氨酸和其组合组成的群组的非天然氨基酸残基。在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物在对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中残基8和／或残基18的位置处包括非天然氨基酸。在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物在对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中残基8和／或残基18的位置处包括至少一个非天然氨基酸。在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物在对应于SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2中残基8的位置处包括非天然氨基酸。在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物在对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中残基18的位置处包括非天然氨基酸。在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物在对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中残基8和残基18的位置处包括两个非天然氨基酸。

在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物在一个或一个以上对应于SEQID NO：2中以下残基的位置处包括非天然氨基酸：X₁、X₇、X₈、X₁₆、X₁₈、X₂₁、X₂₂、X₂₆、X₃₅、X₃₆、X₃₉、X₄₀、X₄₁、X₄₂、X₄₃、X₄₅、X₄₆、X₄₇、X₄₈、X₅₂、X₅₆、X₅₈、X₅₉、X₆₀、X₆₁、X₆₂、X₆₃、X₆₄、X₇₀、X₇₄、X₇₆、X₇₉、X₈₁或X₈₃。

SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5绘示在多个物种的野生型甲状旁腺激素肽中发现的保守序列单元。在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物包括SEQID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中的至少一者。

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列包括与SEQ ID NO：6≥79％、≥82％、≥85％、≥88％、≥91％、≥94％或≥97％一致的单元。

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列包括与SEQ ID NO：7≥79％、≥82％、≥85％、≥88％、≥91％、≥94％或≥97％一致的单元。

糖基化甲状旁腺激素肽.糖基化是己知可影响肽和蛋白质的特征的常见翻译后修饰。具体来说，糖基化可影响肽和蛋白质的折叠、稳定性和功能。然而，尽管可在生物系统中以重组方式表达肽序列，但仍很难以高特异性产生生物合成糖肽。更特定来说，生物系统中的糖基化产生a)不一致且b)可变的组合物，从而使得需要进行具体纯化步骤以获得均质制剂。相反，本发明的肽和／或类似物的化学合成容许将特定或具体聚糖精确纳入肽序列中。

肽可通过所属领域技术人员己知的若干种方法中的任何一种来糖基化。更具体来说，在将氨基酸纳入肽之前使所述氨基酸糖基化。在一些实施例中，本发明提供经至少一个聚糖基团糖基化的甲状旁腺激素肽和／或类似物。

在一些实施例中，至少一个聚糖基团选自：

在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物经O-糖基化。在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和/或类似物在一个或一个以上丝氨酸或苏氨酸残基处经糖基化。在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和/或类似物经选自以下的聚糖O-糖基化:

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和/或类似物在S₁处经糖基化。

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和/或类似物经N-糖基化。在某些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和/或类似物在一个或一个以上天冬酰胺或谷氨酰胺残基处经糖基化。在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和/或类似物经选自以下的聚糖N-糖基化:

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物在N₃₃处经糖基化。

具体PTH肽和／或类似物

所属领域技术人员在阅读本发明后将了解，在某些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物的特征在于两个或两个以上如上文个别论述的特征。例如，在某些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2≥80％一致，其中甲状旁腺激素肽和／或类似物包括至少一个非天然氨基酸。在一些所述实施例中，所述至少一个非天然氨基酸选自由正亮氨酸和／或甲氧丁氨酸组成的群组。

在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：2≥80％一致，其中甲状旁腺激素肽和／或类似物在对应于SEQ ID NO：2中残基8和／或残基18的位置处包括至少一个非天然氨基酸。在一些所述实施例中，所述至少一个非天然氨基酸选自由正亮氨酸和／或甲氧丁氨酸组成的群组。

在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物具有长度为84个氨基酸的序列，其中所述氨基酸序列包括至少一个非天然氨基酸。在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物具有长度为84个氨基酸的序列，其中所述氨基酸序列包括至少一个选自正亮氨酸、甲氧丁氨酸和其组合的非天然氨基酸。

在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物具有长度为37个氨基酸的序列，其中所述氨基酸序列包括至少一个非天然氨基酸。在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物具有长度为37个氨基酸的序列，其中所述氨基酸序列包括至少一个选自正亮氨酸、甲氧丁氨酸和其组合的非天然氨基酸。

在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物具有长度为39个氨基酸的序列，其中所述氨基酸序列包括至少一个非天然氨基酸。在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物具有长度为39个氨基酸的序列，其中所述氨基酸序列包括至少一个选自正亮氨酸、甲氧丁氨酸和其组合的非天然氨基酸。

在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物具有长度为34个氨基酸的序列，其中所述氨基酸序列包括至少一个非天然氨基酸。在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物具有长度为34个氨基酸的序列，其中所述氨基酸序列包括至少一个选自正亮氨酸、甲氧丁氨酸和其组合的非天然氨基酸。

在一些实施例中，所提供hPTH肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQID NO：5中的至少一者。

在一些实施例中，所提供甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致，其中X₁是S或A；X₇是F或L；X₁₆是N、S或A；X₁₈是M、L或V；X₂₁是V或M；且X₂₂是E或Q。在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致，其中X₁是S、A、Nle或Mox；X₇是F、L、Nle或Mox；X₁₆是N、S、A、Nle或Mox；X₁₈是M、L、V、Nle或Mox；X₂₁是V、M、Nle或Mox；且X₂₂是E、Q、Nle或Mox。

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致，其中以下中的至少一者：X₃₆是A、Nle或Mox；X₃₉是A、Nle或Mox；X₄₅是D、Nle或Mox；X₄₈是S、Nle或Mox；X₅₆是D、Nle或Mox；X₅₈是V、Nle或Mox；X₆₀是V、Nle或Mox；X₆₁是E、Nle或Mox；X₆₂是E、Nle或Mox；X₇₀是A、Nle或Mox；X₇₄是D、Nle或Mox；且X₈₁是A、Nle或Mox。

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：14≥94％一致，其中对应于位置8和18的残基选自由甲硫氨酸、甲氧丁氨酸、正亮氨酸和其组合组成的群组。

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：14≥94％一致，其中对应于位置8和18的残基选自由甲硫氨酸、甲氧丁氨酸、正亮氨酸和其组合组成的群组，前提是对应于位置8和18的残基并非都是正亮氨酸。

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：14≥94％一致，其中对应于位置8和18的残基选自由甲硫氨酸、甲氧丁氨酸、正亮氨酸和其组合组成的群组，前提是对应于位置8和18的残基并非都是甲硫氨酸。

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且经至少一个聚糖基团糖基化。在一些所述实施例中，至少一个聚糖基团选自：

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且经O-糖基化。在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且在丝氨酸或苏氨酸处经糖基化。在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且在S₁处经糖基化。在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且在S₁处经糖基化，其中聚糖选自：

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且在N₃₃处经糖基化，其中聚糖选自

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且在N₃₃处经糖基化，其中聚糖是

在其它实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且在N₃₃处经糖基化，其中聚糖是

在某些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且在N₃₃处经糖基化，其中聚糖是

在一些实施例中，甲状旁腺激素肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且在N₃₃处经糖基化，其中聚糖是

在一些实施例中，本发明提供与SEQ ID NO：15≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致的甲状旁腺激素肽和／或类似物，其中所述甲状旁腺激素肽和／或类似物在对应于残基8、残基18和其组合的位置处包括正亮氨酸和／或甲氧丁氨酸残基。

在一些实施例中，本发明提供氨基酸序列包括与SEQ ID NO：14≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致的单元的甲状旁腺激素肽和／或类似物，其中所述甲状旁腺激素肽和／或类似物在对应于残基8、残基18和其组合的位置处包括正亮氨酸和／或甲氧丁氨酸残基。

甲状旁腺激素相关蛋白质肽

本发明还提供甲状旁腺激素相关蛋白质(PTHrP)肽。甲状旁腺激素相关蛋白质起内分泌、自分泌、旁分泌和胞内分泌激素作用并通过维持软骨内生长板的恒定宽度来调节软骨内骨发育。hPTHrP在乳腺形成期间进一步调节上皮-间充质相互作用，且可在哺乳期间结合钙敏感受体调节钙动员和将钙转移到乳汁中。

hPTHrP在正常组织和恶性组织中广泛表达。其以含有139个、141个和173个氨基酸的肽的三种同种型存在。所有三种同种型都是从共有基因合成且区别仅在于极端羧基末端。1987年对hPTHrP的一级结构的鉴别开始了对hPTHrP的结构-活性关系的表征。由于hPTHrP N-末端与hPTH的序列相似性，hPTHrP可发挥与hPTH N-末端所介导几乎相同的功能。因此，在一些实施例中，本发明提供hPTHrP的类似物。在一些实施例中，本发明提供稳定的hPTHrP治疗剂。在一些实施例中，hPTHrP类似物的稳定性强于野生型hPTHrP和／或其同种型(例如，在人类血清中在活体外肽稳定性分析中测量时)。

hPTHrP与hPTH的C-末端结构域共享极少序列同源性。这些序列差异使得hPTHrP在正常组织和癌症组织中具有独特功能。

人类hPTHrP的序列显示于SEQ ID NO：8中。在一些实施例中，本发明提供甲状旁腺激素相关蛋白质肽和／或类似物。在某些实施例中，本发明提供长度为3-180个氨基酸的hPTHrP肽和／或类似物。在一些实施例中，所提供hPTHrP肽和／或类似物的氨基酸序列具有至少最小长度且不超过最大长度，其中最小长度是(例如)至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或40个以上氨基酸，且其中最大长度不超过180、179、178、177、176、175、174、173、172、171、170、169、168、167、166、165、164、163、162、161、160、159、158、157、156、155、154、153、152、151、150、149、148、147、146、145、144、143、142、141、140、139、138、137、136、135、134、133、132、131或130个氨基酸的长度。

在某些实施例中，本发明提供hPTHrP的一个或一个以上同种型。在一些实施例中，本发明提供长度为139个氨基酸的hPTHrP肽和／或类似物。

在一些实施例中，本发明提供长度为141个氨基酸的hPTHrP肽和／或类似物。

在一些实施例中，本发明提供长度为173个氨基酸的hPTHrP肽和／或类似物。

SEQ ID NO：8绘示hPTHrP的一种野生型同种型。在一些实施例中，所提供hPTHrP肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：8≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致。在一些实施例中，hPTHrP肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：9≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致。在一些实施例中，所提供hPTHrP肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ IDNO：16≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致。在一些实施例中，所提供hPTHrP肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：17≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致。在一些实施例中，所提供hPTHrP肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：8、9、16或17总体≥80％、≥81％、≥82％、≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或≥99％以上一致。

SEQ ID NO：10、11、12和13绘示不同物种≥间hPTHrP的保守区域。因此，在一些实施例中，所提供hPTHrP肽和／或类似物的氨基酸序列包括SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13中的至少一者。

在一些实施例中，本发明提供经至少一个聚糖基团糖基化的hPTHrP肽和／或类似物。在一些实施例中，至少一个聚糖基团选自：

具体甲状旁腺激素相关蛋白质类似物

在一些实施例中，hPTHrP肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：8≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且包括SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQID NO：13中的至少一者。

在一些实施例中，hPTHrP肽和／或类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：9≥80％、≥85％、≥90％或≥95％一致且包括SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQID NO：13中的至少一者。

肽合成

呈纯净形式的hPTH和hPTHrP以及其片段的可用性是研究hPTH或hPTHrP的生物功能的先决条件。由于hPTHrP不含半胱氨酸残基，通过天然化学连接化学合成hPTHrP存在问题。一般来说，生物方法和／或化学方法可用于产生如本文所述的所提供hPTH和／或hPTHrP多肽。然而，所属领域技术人员将了解，生物方法(例如基于重组DNA的方法)可能不适于纳入非天然氨基酸且特别不适于纳入多个非天然氨基酸。(弗洛库克N(Voloshchuk N)、蒙特克莱尔JK(Montclare JK).2010.“合成生物学中非天然氨基酸的纳入(Incorporation of unnatural amino acids for synthetic biology).”分子生物系统(Mol.Biosyst.)6：65-80)。

在肽和／或蛋白质产生中利用化学合成使得可能解决生物医学中的多种问题。化学合成可对蛋白质组成施加良好控制。此外，化学合成可有助于产生具有所需性质的新颖蛋白质。在历史上，化学制备生物治疗蛋白质和其类似物依赖于使用肯特(Kent)与合作者的有效的基于半胱氨酸的天然化学连接(NCL)方法。(道森PE(Dawson PE)、缪尔TW(Muir TW)、克拉克-路易斯I(Clark-Lewis I)、肯特SB(1994)通过天然化学连接合成蛋白质(Synthesis of proteins by native chemical ligation).科学(Science)266：776-779；塔姆JP(Tam JP)、鲁YA(Lu YA)、刘CF(Liu CF)、邵J(Shao J)(1995)通过正交偶联法使用未保护肽的肽合成(Peptide synthesis using unprotected peptides through orthogonalcoupling methods).美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)92：12485-12489；华QX(Hua QX)、中川SH(Nakagawa SH)、贾w(Jia w)、黄K(Huang K)、菲利普NB(PhillipsNB)、胡SQ(Hu SQ)、韦斯MA(Weiss MA).(2008)，“活性超稳定单链胰岛素类似物的设计：合成、结构和治疗意义(Design of an active ultrastable single-chain insulin analog：synthesis，structure，and therapeutic implications).”生物化学杂志(Ｊ.Biol.Chem.)283：14703-16)。然而，考虑到自然界中半胱氨酸残基的相对缺乏，现有NCL方法对于产生某些肽或蛋白质经常不可用或无效。hPTH是多种缺少半胱氨酸残基的蛋白质中的一种，因此使得NCL无法用于有效生成hPTH的化学类似物。(道森PE、缪尔TW、克拉克-路易斯I、肯特SB.1994.“通过天然化学连接合成蛋白质.”科学266：776-9)。

先前，hPTH的化学合成需要固相合成84聚体长的肽或装配完全保护的肽区段，这对于类似物的生成来说麻烦且不实用。(木村T(Kimura T)、高井M(Takai M)、增井Y(Masui Y)、森川T(Morikawa T)、榊原S(Sakakibara S).1981.“合成大型肽的策略——对人类甲状旁腺-激素[hPTH(1-84)]的总体合成的应用(Strategy for the Synthesis of LargePeptides-an Application to the Total Synthesis of Human Parathyroid-Hormone[hPTH(1-84)]）.”生物聚合物（Biopolymers)20：1823-32；法尔沃尔T(Fairwell T)、霍斯潘塔卡AV(Hospattankar AV)、罗南R(Ronan R)、小布鲁尔HB(Brewer HB，Jr.)、张JK(Chang JK)、清水M(Shimizu M)、齐茨纳L(Zitzner L)、阿诺CD(Arnaud CD).1983.“人类甲状旁腺激素(1-84)的总体固相合成、纯化和表征(Total solid-phase synthesis，purification，and characterization of human parathyroid hormone-(1-84)).”生物化学(Biochemistry)22：2691-7；葛德NA(Goud NA)、麦基RL(McKee RL)、萨达纳MK(SardanaMK)、德黑文PA(DeHaven PA)、休勒E(Huelar E)、赛义德MM(Syed MM)、葛德RA、吉本斯SW(Gibbons SW)、费舍尔JE(Fisher JE)、利维JJ(Levy JJ)等人，1991.“人类甲状旁腺激素(1-84)的固相合成和生物活性(Solid-phase synthesis and biologic activity ofhuman parathyroid hormone(1-84)).”骨与矿物质研究杂志(J.Bone Miner.Res.)6：781-9；富恩特斯G(Fuentes G)、培智K(Page K)、钱特勒CA(Chantell CA)、帕特尔H(PatelH)、刈谷M(Menakuru M).2009.“人类甲状旁腺激素1-84的常规快速合成(Fastconventional synthesis of human parathyroid hormone1-84).”今日化学(Chim.Oggi)27：31-3)。

为使hPTH和其类似物的化学合成比其它方法更有吸引力，研究者己显著扩大了天然化学连接方法的适用性。(万Q(Wan Q)、丹尼谢夫斯基SJ(Danishefsky SJ).2007.“半胱氨酸的基于自由基的特异性脱硫：多肽与糖多肽合成的巨大进步(Free-radical-based，specific desulfurization of cysteine：a powerful advance in the synthesis of polypeptides andglycopolypeptides).”应用化学国际版(Angew.Chem.Iht.Ed.)46：9248-52；陈J(Chen J)、万Q、袁Y(Yuan Y)、朱J(Zhu J)、丹尼谢夫斯基SJ.2008.“缬氨酸处的天然化学连接：对肽和糖肽合成的贡献(Native chemical ligation at valine：a contribution to peptide andglycopeptide synthesis).”应用化学国际版47：8521-4；陈J、王P(Wang P)、朱JL、万Q、丹尼谢夫斯基SJ.2010.“用于在苏氨酸位点连接的计划：对糖肽的受控总体合成的应用(A program for ligation at threonine sites：application to the controlled total synthesis ofglycopeptides).”四面体(Tetrahedron)66：2277-83；谭Z(Tan Z)、尚S(Shang S)、丹尼谢夫斯基SJ.2010.“对天然化学连接中细微问题的见解：级联连接的方法(Insights intothe Finer Issues of Native Chemical Ligation：An Approach to Cascade Ligations).”应用化学国际版，49：9500-9503)。使用偶联的基于非半胱氨酸的连接／脱硫策略，可从小合成肽片段装配全长hPTH分子，这又使得能对其天然结构进行柔性修饰。(塔姆JP、于QT(Yu QT).1998.“甲状旁腺激素的仿生合成中的甲硫氨酸连接策略(Methionineligation strategy in the biomimetic synthesis of parathyroid hormones).”生物聚合物46：319-27)。

在某些实施例中，本发明提供合成甲状旁腺激素、甲状旁腺激素相关蛋白质和／或其肽和／或类似物的方法。在某些实施例中，本发明提供合成hPTH、hPTHrP和其肽和／或类似物的方法，其在并非半胱氨酸或甲硫氨酸的氨基酸残基处包含至少一个天然化学连接偶联。在一些实施例中，本发明提供合成hPTH、hPTHrP和／或其肽和／或类似物的方法，其在选自丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸和脯氨酸的氨基酸残基处包含至少一个天然化学连接偶联。在一些实施例中，本发明提供合成SEQ ID NO：1的hPTH的方法：

在一些实施例中，本发明提供hPTH的合成，其包含将片段I、II、III和IV天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供hPTH的合成，其包含将片段I和II天然化学连接以产生片段V：

在一些实施例中，本发明提供hPTH的合成，其包含将片段III和IV天然化学连接以产生片段VI：

在一些实施例中，本发明提供hPTH的合成，其包含将片段III和IV天然化学连接以产生片段VI，之后将N-末端去保护以产生片段VII：

在一些实施例中，本发明提供hPTH的合成，其包含将片段V和VII天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供hPTH的合成，其包含将片段V和VII天然化学连接，之后将片段VIII脱硫以获得hPTH(1-84)。

在一些实施例中，本发明提供制备hPTH肽的方法，其包含：

(i)将片段I和II天然化学连接以产生片段V：

(ii)将片段III和IV天然化学连接以产生片段VI：

(iii)使片段VI去保护以产生片段VII：

(iv)将片段V和VII天然化学连接以产生片段VIII：

(v)还原片段VIII以产生hPTH肽：

在一些实施例中，本发明提供合成SEQ ID NO：14的hPTH类似物A的方法，其中所述序列在对应于残基8和18的位置处包括正亮氨酸：

在一些实施例中，本发明提供hPTH类似物A的合成，包含将片段IX和XVII天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供hPTH类似物A的合成，其包含将片段XVIII和XIX天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供合成SEQ ID NO：14的hPTH类似物的方法，其中所述肽经至少一个聚糖基团糖基化。在一些实施例中，本发明提供合成SEQ ID NO：14的hPTH类似物的方法，其中所述肽经至少一个聚糖基团糖基化且其中所述序列在对应于残基8和18的位置处包括正亮氨酸。在一些实施例中，本发明提供合成糖基化hPTH类似物B的方法：

其中

在一些实施例中，本发明提供hPTH类似物B的合成，其包含将片段XX、XXI和XXII天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供合成糖基化hPTH类似物C的方法：

其中

在一些实施例中，本发明提供hPTH类似物C的合成，其包含将片段XVIII、XXIII和XXIV天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供合成糖基化hPTH类似物D的方法：

其中

在一些实施例中，本发明提供hPTH类似物D的合成，其包含将片段XVIII、XXIII和XXV天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供合成SEQ ID NO：1的hPTH类似物E的方法，其中所述序列在对应于残基8和18的位置处包括正亮氨酸：

在一些实施例中，本发明提供hPTH类似物E的合成，其包含将片段IX、II和X天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供合成SEQ ID NO：1的糖基化类似物F的方法，其中所述序列在对应于残基8和18的位置处包括正亮氨酸：

其中

在一些实施例中，本发明提供hPTH类似物F的合成，其包含将片段XX、XXVI和II和X天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供合成SEQ ID NO：1的糖基化类似物G的方法，其中所述序列在对应于残基8和18的位置处包括正亮氨酸：

其中

在一些实施例中，本发明提供hPTH类似物G的合成，其包含将片段XXVII、XXVIII和X天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供合成SEQ ID NO：1的糖基化类似物H的方法，其中所述序列在对应于残基8和18的位置处包括正亮氨酸：

其中

在一些实施例中，本发明提供hPTH类似物H的合成，其包含将片段XXVII、XXIX和X天然化学连接：

人类甲状旁腺激素相关蛋白质不含半胱氨酸或甲硫氨酸残基，且因此无法通过常规天然化学连接方法来合成。在一些实施例中，本发明提供合成SEQ ID NO：8的hPTHrP肽的方法，其包含将片段XXX、XXXI、XXXII和XXXIII天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供中间体XXXIV的合成：

其包含将中间体XXX和XXXI天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供中间体XXXV的合成：

其包含将中间体XXXII和XXXIII天然化学连接：

在一些实施例中，本发明提供中间体XXXVI的合成：

其包含将中间体XXXIV和XXXV天然化学连接。

在一些实施例中，本发明提供hPTHrP XXXVII的合成：

其包含用脱硫剂还原中间体XXXVI。

在某些实施例中，本发明提供天然化学连接中间体。在一些实施例中，本发明提供天然化学连接中间体I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX、XX、XXI、XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXVI、XXVII、XXVIII、XXIX、XXX、XXXI、XXXII、XXXIII、XXXIV、XXXV和XXXVI。

化合物和医药上可接受的组合物的用途

根据一些实施例，本发明提供包含任选地呈其医药上可接受的盐、酯或其它衍生物形式的本发明肽和／或类似物以及医药上可接受的载剂、佐剂或媒剂的组合物。

在一些实施例中，医药上可接受的组合物包含和／或在投与后提供治疗有效量的hPTH或hPTHrP肽和／或类似物。在一些实施例中，医药上可接受的组合物包含和／或在投与后提供治疗有效量的hPTH或hPTHrP肽和／或类似物。

在一些实施例中，本发明提供包含hPTH肽和／或类似物和至少一种医药上可接受的载剂的医药组合物。在某些实施例中，本发明提供包含hPTH肽和／或类似物和至少一种医药上可接受的载剂的医药组合物，其中所述组合物进一步包含另一治疗剂。

在一些实施例中，本发明提供包含hPTHrP肽和／或类似物和至少一种医药上可接受的载剂的医药组合物。在某些实施例中，本发明提供包含hPTHrP肽和／或类似物和至少一种医药上可接受的载剂的医药组合物，其中所述组合物进一步包含另一治疗剂。

在某些实施例中，本发明组合物经调配用于投与需要所述组合物的患者。在一些实施例中，本发明组合物经调配用于经口投与患者。

本发明组合物可用于治疗与甲状旁腺激素水平不足有关的症状、疾病和／或病症。在一些实施例中，本发明组合物可用于治疗与甲状旁腺功能减退症有关的症状、疾病和／或病症。在一些实施例中，本发明组合物可用于治疗与活化不足的甲状旁腺激素有关的症状、疾病和／或病症。在一些实施例中，本发明组合物可用于治疗骨质疏松。

本发明组合物可通过任何适宜途径来投与，例如经口、非经肠、吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或植入型药盒。

对于非经肠投与，可采用任何温和不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。可使用脂肪酸(例如油酸和其甘油酯衍生物)制备注射剂，所述注射剂是天然的医药上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是呈其聚氧乙烯化形式者。这些油溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或常用于调配包括乳液和悬浮液在内的医药上可接受的剂型的类似分散剂。也可使用其它常用表面活性剂(例如吐温(Tween)、司盘(Span)和其它常用于制造医药上可接受的固体、液体、或其它剂型的乳化剂或生物利用度增强剂)达成调配目的。在一些实施例中，所提供肽和／或类似物是非经肠投与。

本发明的医药上可接受的组合物可以任何经口可接受剂型(包括(但不限于)胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液)经口投与。在口服用片剂情形中，常用载剂包括乳糖和玉米淀粉。通常也可添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式经口投与，可用稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。在经口使用需要水性悬浮液时，可将活性成份与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，也可添加某些甜味剂、矫味剂或着色剂。

或者，本发明的医药上可接受的组合物可以用于直肠投与的栓剂形式投与。这些组合物可通过将药剂与适宜的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，且因此可在直肠中融化以释放药物。所述材料包括可可油、蜂蜡和聚乙二醇。

本发明的医药上可接受的组合物还可经局部投与，尤其在治疗目标包括通过局部施加易于达到的区域或器官(包括眼部、皮肤或下肠道的疾病)时。可易于制备用于这些区域或器官中每一者的适宜局部调配物。

用于下肠道的局部施加可以直肠栓剂调配物(参见上文)或以适宜灌肠调配物来实现。还可使用局部经皮贴剂。

对于局部施加，可将所提供的医药上可接受的组合物调配于含有悬浮或溶解于一种或一种以上载剂中的活性组份的适宜软膏剂中。用于局部投与本发明化合物的载剂可包括(但不限于)矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将所提供的医药上可接受的组合物调配于含有悬浮或溶解于一种或一种以上医药上可接受的载剂中的活性组份的适宜洗剂或乳霜中。适宜载剂包括(但不限于)矿物油、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。

对于眼部使用，可将所提供的医药上可接受的组合物调配为(例如)存于等渗、pH经调节的无菌盐水中的微粒化悬浮液，或优选地调配为存于等渗、pH经调节的无菌盐水中的含有或不含有防腐剂(例如苯扎氯铵)的溶液。或者，对于眼部使用，可将医药上可接受的组合物调配于软膏剂(例如矿脂)中。

本发明的医药上可接受的组合物也可通过经鼻气溶胶或吸入剂来投与。所述组合物是根据医药调配领域熟知的技术来制备并且可将其制备为盐水溶液，其中采用苯甲醇或其它适宜防腐剂、吸收促进剂(增强生物利用度)、碳氟化合物和／或其它常规增溶或分散剂。

可与载剂材料组合以产生呈单一剂型的组合物的本发明化合物的量可根据所治疗主体、具体投与方式而变。优选地，所提供组合物应经调配以使得可向接受这些组合物的患者投与介于0.01mg／kg体重／日到100mg／kg体重／日之间的剂量的抑制剂。

还应理解，用于任一具体患者的特定剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所采用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、投与时间、排泄速度、药物组合和治疗医师的判断以及所治疗具体疾病的严重性。组合物中本发明化合物的量还将取决于组合物中的具体化合物。

以

销售的特立帕肽(Teriparatide)是长度为34个氨基酸的hPTH肽，其目前被联邦药物管理局(Federal Drug Administration，FDA)批准用于治疗具有高骨折风险的患有骨质疏松的绝经后女性。特立帕肽还被批准用于治疗具有高骨折风险的患有与持续全身糖皮质激素疗法有关的骨质疏松的男性和女性二者。特立帕肽在具有高骨折风险的患有原发性或性腺机能减退性骨质疏松的男性中进一步增加骨量。

在本发明的一些实施例中，本发明的hPTH或hPTHrP肽和／或类似物具有如本文所述的活性。在一些实施例中，hPTH或hPTHrP肽和／或类似物促进血清钙水平的恢复。因此，在某些实施例中，本发明提供用于治疗特征为甲状旁腺水平不足的疾病和／或病症的方法，其包含向有需要的个体投与本发明化合物或其医药上可接受的组合物的步骤。

在一些实施例中，本发明提供治疗与hPTH或hPTHrP水平不足有关的症状、疾病或病症的方法。在一些所述实施例中，本发明提供治疗甲状腺功能减退症的方法，其包含向有需要的个体投与治疗有效量的hPTH或hPTHrP肽和／或类似物。在一些实施例中，本发明提供用于治疗骨质疏松或降低其严重性的方法。在一些实施例中，本发明提供用于治疗骨质疏松或降低其严重性的方法，其包含向有需要的个体投与hPTH或hPTHrP肽和／或类似物。在一些实施例中，本发明提供用于治疗绝经后女性的骨质疏松或降低其严重性的方法。

在一些实施例中，本发明提供用于治疗骨质疏松或降低其严重性的方法，其包含向有需要的个体投与hPTH或hPTHrP肽和／或类似物与钙和／或维生素D的组合。

在一些实施例中，本发明提供用于提高骨矿物质密度的方法，其包含向有需要的个体投与hPTH或hPTHrP肽和／或类似物。在一些实施例中，本发明提供用于提高骨矿物质密度的方法，其包含向有需要的个体投与hPTH或hPTHrP肽和／或类似物与钙和／或维生素D的组合。

在一些实施例中，本发明提供用于在患有原发性或性腺机能减退性骨质疏松的男性中增加骨量的方法，其包含向有需要的个体投与hPTH或hPTHrP肽和／或类似物。在一些实施例中，本发明提供用于在患有原发性或性腺机能减退性骨质疏松的男性中增加骨量的方法，其包含向有需要的个体投与hPTH或hPTHrP肽和／或类似物与钙和／或维生素D的组合。

在一些实施例中，本发明提供用于治疗糖皮质激素引发的骨质疏松的方法，其包含向有需要的个体投与hPTH或hPTHrP肽和／或类似物。在一些实施例中，本发明提供用于治疗糖皮质激素引发的骨质疏松的方法，其包含向有需要的个体投与hPTH或hPTHrP肽和／或类似物与钙和／或维生素D的组合。

在某些实施例中，本发明的肽和／或类似物或其医药上可接受的组合物是与一种或一种以上其它治疗剂组合投与。

在一些实施例中，所提供hPTH或hPTHrP肽和／或类似物或其医药组合物是与一种或一种以上抗增殖剂或化学治疗剂组合投与。在一些实施例中，所提供hPTH或hPTHrP肽和／或类似物或其医药组合物是与一种或一种以上选自以下中的任何一种或一种以上的抗增殖剂或化学治疗剂组合投与：阿巴瑞克(Abarelix)、阿地白介素(Aldesleukin)、阿地白介素、阿仑珠单抗(Alemtuzumab)、阿利维甲酸(Alitretinoin)、别嘌呤醇(Allopurino1)、六甲蜜胺(Altretamine)、氨磷汀(Amifostine)、阿那曲唑(Anastrozole)、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿扎胞苷(Azacitidine)、注射用卡介苗(BCG Live)、贝伐珠单抗(Bevacuzimab)、氟尿嘧啶、贝沙罗汀(Bexarotene)、博来霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、白消安(Busulfan)、卡普睾酮(Calusterone)、卡培他滨(Capecitabine)、喜树碱(Camptothecin)、卡铂(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、塞来昔布(Celecoxib)、西妥昔单抗(Cetuximab)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、克拉屈滨(Cladribine)、氟法拉滨(Clofarabine)、环磷酰胺、阿糖胞苷(Cytarabine)、更生霉素(Dactinomycin)、达依泊汀α(Darbepoetin alfa)、柔红霉素(Daunorubicin)、地尼白介素(Denileukin)、右雷佐生(Dexrazoxane)、多西他赛(Docetaxel)、多柔比星(Doxorubicin，中性)、盐酸多柔比星、丙酸屈他雄酮(DromostanolonePropionate)、表柔比星(Epirubicin)、阿法依泊汀(Epoetin alfa)、厄洛替尼(Erlotinib)、雌莫司汀(Estramustine)、磷酸依托泊苷(Etoposide Phosphate)、依托泊苷、依西美坦(Exemestane)、非格司亭(Filgrastim)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟维司群(Fulvestrant)、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他滨(Gemcitabine)、吉妥珠单抗(Gemtuzumab)、醋酸戈舍瑞林(Goserelin Acetate)、醋酸组氨瑞林(Histrelin Acetate)、羟基脲、替伊莫单抗(Ibritumomab)、伊达比星(Idarubicin)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、伊立替康(Irinotecan)、来那度胺(Lenalidomide)、来曲唑(Letrozole)、甲酰四氢叶酸(Leucovorin)、醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate)、左旋咪唑(Levamisole)、洛莫司汀(Lomustine)、醋酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)、美法仑(Melphalan)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、6-MP、美司钠(Mesna)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、甲氧沙林(Methoxsalen)、丝裂霉素C(Mitomycin C)、米托坦(Mitotane)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、苯丙酸诺龙(Nandrolone)、奈拉滨(Nelarabine)、若莫单抗(Nofetumomab)、奥普瑞白介素(Oprelvekin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、帕利夫明(Palifermin)、帕米膦酸(Pamidronate)、培加酶(Pegademase)、培门冬酶(Pegaspargase)、培非司亭(Pegfilgrastim)、培美曲塞二钠(Pemetrexed Disodium)、喷司他汀(Pentostatin)、哌泊溴烷(Pipobroman)、普卡霉素(Plicamycin)、卟吩姆钠(PorfimerSodium)、丙卡巴肼(Procarbazine)、奎纳克林(Quinacrine)、拉布立酶(Rasburicase)、利妥昔单抗(Rituximab)、沙格司亭(Sargramostim)、索拉非尼(Sorafenib)、链佐星(Streptozocin)、马来酸舒尼替尼(Sunitinib Maleate)、滑石、他莫昔芬(Tamoxifen)、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、VM-26、睾内酯、硫鸟嘌呤、6-TG、塞替派(Thiotepa)、托泊替康(Topotecan)、托瑞米芬(Toremifene)、托西莫单抗(Tositumomab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、维甲酸(Tretinoin)、ATRA、尿嘧啶氮芥、戊柔比星(Valrubicin)、长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、唑来膦酸盐(Zoledronate)或唑来膦酸(Zoledronic acid)。

也可与本发明化合物组合的药剂的其它实例包括(但不限于)：用于阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease)的治疗，例如

和

用于帕金森病(Parkinson's Disease)的治疗，例如L-DOPA／卡尔多巴(carbidopa)、恩他卡朋(entacapone)、罗吡尼洛(ropinrole)、普拉克索(pramipexole)、溴隐亭(bromocriptine)、培高利特(pergolide)、三己芬迪(trihexyphenidyl)和金刚烷胺(amantadine)；用于治疗多发性硬化症(MS)的药剂，例如β干扰素(例如，

和

)、

和米托蒽醌；用于哮喘的治疗，例如沙丁胺醇(albutero1)和

用于治疗精神分裂症的药剂，例如再普乐(zyprexa)、维思通(risperdal)、思瑞康(seroquel)和氟哌啶醇(haloperido1)；消炎药，例如皮质类固醇、TNF阻断剂、IL-1RA、硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺和柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；免疫调节剂和免疫抑制剂，例如环孢素(cyclosporin)、他罗利姆(tacrolimus)、雷帕霉素(rapamycin)、吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil)、干扰素、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤和柳氮磺胺吡啶；神经营养因子，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂、MAO抑制剂、干扰素、抗惊厥药、离子通道阻断剂、利鲁唑(riluzole)和抗帕金森药；用于治疗心血管疾病的药剂，例如β-阻断剂、ACE抑制剂、利尿药、硝酸盐、钙通道阻断剂和他汀类；用于治疗肝病的药剂，例如皮质类固醇、消胆胺(cholestyramine)、干扰素和抗病毒药；用于治疗血液病的药剂，例如皮质类固醇、抗白血病药和生长因子；和用于治疗免疫缺陷病的药剂，例如γ球蛋白。

在某些实施例中，本发明的hPTH或hPTHrP肽和／或类似物或其医药上可接受的组合物是与单克隆抗体或siRNA治疗剂组合投与。

所述其它药剂可作为多剂量方案的一部分与含有本发明化合物的组合物分开投与。或者，所述药剂可为单一剂型的一部分，在单一组合物中与本发明化合物混合在一起。如果作为多剂量方案的一部分投与，那么两种活性剂可同时、依序或彼此在一段时间内呈送。

本发明肽和／或类似物与其它治疗剂(在那些包含如上文所述的其它治疗剂的组合物中)二者可与载剂材料组合以产生单一剂型的量可根据所治疗主体和具体投与模式而变。在一些实施例中，本发明组合物经调配以使得可投与介于0.0001mg／kg体重／日到100mg／kg体重／日之间的剂量的类似物。

在那些包含其它治疗剂的组合物中，所述其它治疗剂与本发明化合物可协同作用。因此，所述组合物中其它治疗剂的量可小于仅使用所述治疗剂的单一疗法所需的量。在所述组合物中，可投与介于0.001μg／kg体重／日到1000μg／kg体重／日之间的剂量的其它治疗剂。

存在于本发明组合物中的其它治疗剂的量将不超过通常在包含所述治疗剂作为唯一活性剂的组合物中投与的量。优选地，当前所揭示组合物中其它治疗剂的量将在通常存于包含所述药剂作为唯一治疗活性剂的组合物中的量的约50％到100％范围内。

也可将本发明化合物或其医药组合物纳入用于涂布可植入医学装置(例如假肢、人工瓣膜、血管移植物、支架和导管)的组合物中。例如，己使用血管支架来克服再狭窄(血管壁在损伤后再次变窄)。然而，使用支架或其它可植入装置的患者具有形成凝块或活化血小板的风险。这些不利作用可通过用包含治疗剂的医药上可接受的组合物将装置预涂布来预防或减轻。经本发明化合物涂布的可植入装置是本发明的另一实施例。

范例

所有市售材料(奥德里奇(Aldrich)、弗卢卡(Fluka)、诺瓦(Nova))都是不经进一步纯化即使用。所有溶剂都是试剂级或HPLC级(费舍尔)。无水THF、二乙醚、CH₂C1₂、甲苯和苯得自干溶剂系统(通过氧化铝柱)且不经进一步干燥即使用。所有反应都是在预纯化干燥Ar(g)气氛下进行。NMR谱(¹H和¹³C)是在布鲁克高级(Bruker Advance)II600MHz或布鲁克高级DRX-500MHz上记录，以TMS或残留溶剂为参考。用JOELJMS-DX-303-HF质谱仪或沃特斯(Waters)Micromass ZQ质谱仪执行低分辨率质谱分析。在E.默克(E.Merck)硅胶60F254板上执行分析型TLC且在E.默克硅胶60(40-63mm)上执行快速柱色谱。产率是指色谱纯化合物。

HPLC：所有分离都涉及存于水(溶剂A)中的0.05％TFA(v／v)／存于乙腈(溶剂B)中的0.04％TFA的流动相。LCMS分析是使用沃特斯2695分离模块和配备有瓦里安(Varian)Microsorb100-5(C18150×2.0mm柱)和瓦里安Microsorb300-5(C4250×2.0mm柱)的沃特斯996光二极管阵列检测器在0.2mL／min流速下执行。UPLC-MS分析是使用配备有Acquity 

BEH C18(1.7μ1，2.1×100mm)、Acquity BEH C8(1.7μ1，2.1×100mm)、Acquity 

BEH300C4(1.7μ1，2.1×100mm柱)的沃特斯Acquity^TM超高效LC系统在0.3mL／min流速下执行。制备型分离是使用配备有瑞宁(Rainin)UV-1检测器的瑞宁HPLC溶剂递送系统和使用瓦里安Microsorb100-5(C18250×21.4mm)和瓦里安Microsorb300-5(C4250×21.4mm柱)的瓦里安Dynamax在16.0mL／min流速下执行。

固相肽合成(SPPS).在应用生物系统(Applied Biosystems)先锋(Pioneer)连续流肽合成仪上执行自动化肽合成。肽是根据标准自动化Fmoc协议(HATU、DIEA、DMF)来合成。解封溶液是DMF／哌啶／DBU的100／5／5混合物(100／5／5)。采用以下来自诺瓦生物化学(NovaBiochem)的Fmoc氨基酸：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Thz-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH。在以0.05mmol规模完成自动化合成后，用DCM洗涤肽树脂。使用AcOH／TFE／DCM(1：1：8)或TFA／TIS／H₂O(95：2.5：2.5)进行裂解。通过过滤移除树脂，并浓缩所得溶液。用醚使残留物沉淀并进行离心。使丸粒再悬浮于乙腈／H₂O(1：1)中并冻干。

CD谱是在Aviv410圆二色分光偏振仪上获得。蛋白质浓度是基于根据Trp残基数计算的消光系数来确定。所有实验的溶剂都是1：1CH₃CN：H₂O。在14μM和7μM蛋白质浓度下用1mm光程长度的比色皿采集光谱。

实例1：hPTH(1-84)的合成

hPTH的一级结构显示于图1中。基于hPTH的氨基酸序列，hPTH多肽链可通过收敛性策略从四个片段hPTH(1-23)I、hPTH(24-38)II、hPTH(39-59)III和hPTH(60-84)IV来装配。每一肽片段分别含有23个氨基酸残基、15个残基、21个残基和25个残基，且因此易于通过固相肽合成来制备。所述片段通过使用hPTH中的三个最丰富氨基酸Leu24、Ala39和Val60接合在一起(图1)。

hPTH的合成显示于图2中。通过Fmoc化学以0.05mmol规模人工合成完全保护的肽。使亮氨酸和缬氨酸替代物通过HATU附接到完全保护的肽的N-末端。在由榊原和同事建立的非差向异构条件下使用EDCI介导的酰胺形成反应从完全保护的肽具有C-末端硫酯的肽片段。片段I硫酯和片段II的选择性亮氨酸连接是在9h内完成而以59％产率提供肽V。片段III与片段IV的反应在pH7.5胍缓冲剂中进行5h以获得肽VI。在连接完成后，在一锅法(one-pot)中通过用pH4.0甲氧胺·HCl处理使肽VI中的噻唑烷转化为N-末端半胱氨酸，从而经两个步骤获得86％产率(图2B)。在这些合成后，肽V硫酯与VII在200mM4-甲氧基苯基醋酸(MPAA)催化剂存在下连接，从而以63％产率生成VIII。VIII的脱硫是在2h内完成且产生最终全长产物。通过HPLC纯化以86％产率提供纯净hPTH。

肽苯硫基酯I的合成：

通过SPPS使用上述一般程序制备完全保护的肽基酸。在裂解后，获得156.4mg粗制肽(68％产率)。

将存于CHCl₃／TFE(v／v=3／1，620μL)中的完全保护的肽基酸(71.7mg，15.8μM，1.1当量)和HCl.H-Trp-SPh(4.8mg，14.4μM，1.0当量)冷却到-10℃。添加HOOBt(2.6mg，15.8μM，1.1当量)和EDCI(2.8μL，15.8μM，1.1当量)。将反应混合物在室温下搅拌3h。然后在温和N₂流下吹除溶剂并添加TFA／H₂O／TIS(95：2.5：2.5)。在去保护45min后，吹除TFA且将油状残留物与二乙醚一起研磨。将沉淀物丸粒化且随后倾析醚。通过HPLC纯化所得固体以获得11.5mg片段I(28％产率)。化学式：C₁₂₄H₁₉₃N₃₅O₃₅S₃，预期质量：2828.36，[M+2H]²⁺m／z=1415.18，[M+3H]³⁺m／z=943.79。

含有硫代亮氨酸的肽烷基硫酯II的合成.

将来自Fmoc SPPS的肽树脂(6.49μmol，1.0当量)与Boc-Leu(SSMe)-OH(2.0mg，6.49μmol，1.0当量)、HATU(7.6mg，19.5μmol，3.0当量)和DIEA(6.8μL，39.0μmol，6.0当量)在DMF(200μL)中混合并在室温下搅拌10min。将树脂用DMF、DCM和MeOH洗涤若干次并在真空下干燥。通过用AcOH／TFE／DCM(1：1：8)处理2×1小时来裂解干燥树脂，以获得完全保护的肽基酸。

将存于CHCl₃／TFE(v／v=3／1，435μL)中的上述粗制肽基酸(6.49μM，1.0当量)和HCl.H-Gly-3-硫代丙酸乙基酯(7.79μM，1.2当量)冷却到-10℃。添加HOOBt(6.49μM，1.0当量)和EDCI(6.49μM，1.0当量)。将反应混合物在室温下搅拌3.5h。然后在温和N₂流下吹除溶剂并添加TFA／H₂O／TIS(95：2.5：2.5)。在去保护20min后，吹除TFA且将油状残留物与二乙醚一起研磨。将沉淀物丸粒化且随后倾析醚。通过HPLC纯化所得固体以获得3.7mg硫酯II(30％产率，基于树脂重量来计算)。化学式：C₈₅H₁₄₂N₂₄O₂₁S₃，预期质量：1930.99，[M+2H]²⁺m／z=966.50。

肽苯硫基酯III的合成.

通过SPPS使用上述一般程序制备完全保护的肽基酸。在裂解后，获得45.5mg粗制肽(23％产率)。

将存于CHCl₃／TFE(v／v=3／1，440μL)中的完全保护的肽基酸(45.5mg，11.3μM，1.1当量)和HCl.H-Leu-SPh(2.7mg，10.3μM，1.0当量)冷却到-10℃。添加HOOBt(1.8mg，11.3μM，1.1当量)和EDCI(2.0μL，11.3μM，1.1当量)。将反应混合物在室温下搅拌3h。然后在温和N₂流下吹除溶剂并添加TFA／H₂O／TIS(95：2.5：2.5)。在去保护45min后，吹除TFA且将油状残留物与二乙醚一起研磨。将沉淀物丸粒化且随后倾析醚。通过HPLC纯化所得固体以获得7.2mg苯硫基酯III(28％产率)。化学式：C₁₀₅H₁₇₂N₃₄O₃₀S₂，预期质量：2453.24，[M+2H]²⁺m／z=1227.62，[M+3H]³⁺m／z=818.75。

含有硫代缬氨酸的肽IV的合成.

将来自Fmoc SPPS的肽树脂(6.64μmol，1.0当量)与Boc-Val(SSMe)-OH(2.0mg，6.64μmol，1.0当量)、HATU(7.6mg，19.9μmol，3.0当量)和DIEA(6.9μL，39.8μmol，6.0当量)在DMF(200μL)中混合并在室温下搅拌10min。将树脂用DMF、DCM和MeOH洗涤若干次并在真空下干燥。裂解肽且通过用TFA／H₂O／TIS(95：2.5：2.5)处理1h10min来去保护。然后吹除TFA且将油状残留物与二乙醚一起研磨。将沉淀物丸粒化且随后倾析醚。通过HPLC纯化所得固体以获得8.9mg硫酯IV(49％产率，基于树脂重量来计算)。化学式：C₁₁₄H₁₉₃N₃₃O₄₂5₂，预期质量：2760.34，[M+2H]²⁺m／z=1381.17，[M+3H]³⁺m／z=921.1l。

肽V的合成.

V的合成是在动力学受控的连接条件下进行。将肽I(6.1mg，2.2μmol，1.1当量)和肽II(3.7mg，1.9μmol，1.0当量)溶解于连接缓冲剂(600μL，6M Gdn.HCl，100mMNa₂HPO₄，50mM TCEP，pH7.5)中。将反应混合物在室温下搅拌9h。通过LC-MS监测反应并通过HPLC直接纯化以获得5.2mg连接肽V(59％产率)。如通过LC-MS分析所估计，II的环化产物与连接产物V之间的比率为l：10。化学式：C₂₀₂H₃₂₇N₅₉0₅₆S₄，预期质量：4603.34，[M+2H]²⁺m／z=2302.67，[M+3H]³⁺m／z=1535.45，[M+4H]⁴⁺m／z=1151.84，[M+5H]⁵⁺m／z=921.67。

连接肽VI的合成.

将肽III(2.7mg，1.1μmol，1.6当量)和肽IV(1.8mg，0.67μmol，1.0当量)溶解于连接缓冲剂(300μL，6M Gdn.HCl，100mM Na₂HPO₄，50mM TCEP，pH7.5)中。将反应混合物在室温下搅拌9h。通过LC-MS监测反应且将粗制肽VI不经进一步纯化直接去保护。

肽VII的合成.

通过添加0.2M甲氧胺HCl(pH4.0)将Thz基团转化为半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌5h。通过LC-MS监测反应并通过HPLC直接纯化以获得2.9mg去保护肽VII(86％产率)。化学式：C₂₁₁H₃₅₇N₆₇O₇₂S₂，预期质量：5045.58，[M+3H]³⁺m／z=1682.86，[M+4H]⁴⁺m／z=1262.40，[M+5H]⁵⁺m／z=1010.12，[M+6H]⁷⁺m／z=841.93，[M+7H]⁵⁺m／z=721.8l。

连接肽VIII的合成.

将肽V(1.1mg，0.24μmol，1.1当量)和肽VII(1.1mg，0.22μmol，1.0当量)溶解于连接缓冲剂(100μL，6M Gdn.HCl，300mM Na₂HPO₄，200mM MPAA，20mM TCEP，pH7.9)中。将反应混合物在室温下搅拌4h。通过LC-MS监测反应并通过HPLC直接纯化以获得1.3mg连接肽VIII(59％产率)。化学式：C₄₀₈H₆₇₄N₁₂₆O₁₂₆S₅，预期质量：9514.88，[M+5H]⁵⁺m／z=1903.98，[M+6H]⁶⁺m／z=1586.81，[M+7H]⁷⁺m／z=1360.27，[M+8H]⁸⁺m／z=1190.36，[M+9H]⁹⁺m／z=1058.21，[M+10H]¹⁰⁺m／z=952.49，[M+11H]¹¹⁺m／z=865.99，[M+12H]¹²⁺m／z=793.91，[M+13H]¹³⁺m／z=732.91。

脱硫肽hPTH的合成.

向纯化连接肽VIII(0.7mg)于脱气CH₃CN／H₂O(v／v=1：1，0.2m1)中的溶液添加0.2m1的0.5M粘合分隔剂

TCEP溶液(皮尔斯(Pierce))、0.02m1的2-甲基-2-丙硫醇和0.2m1的自由基引发剂(0.1M，存于H₂0中)。将反应混合物在37℃下搅拌2h。通过LC-MS监测反应并通过HPLC直接纯化以获得0.6mg hPTH(86％)。化学式：C₄₀₈H₆₇₄N₁₂₆O₁₂₆S₂，预期质量：9418.96，[M+5H]⁵⁺m／z=1884.79，[M+6H]⁶⁺m／z=1570.83，[M+7H]⁷⁺m／z=1346.57，[M+8H]⁸⁺m／z=1178.37，[M+9H]⁹⁺m／z=1047.55，[M+10H]¹⁰⁺m／z=942.90，[M+11H]¹¹⁺m／z=857.27，[M+12H]¹²⁺m／z=785.91，[M+13H]¹³⁺m／z=725.54。

实例2：［Ｎle ^8,18 ]hPTH(1-84)的合成

肽酚酯IX的合成：

通过固相肽合成(SPPS)使用上述一般程序来制备完全保护的肽基酸。在裂解后，获得151.0mg粗制肽(66％产率)。

将存于CHCl₃／TFE(v／v=3／1，1mL)中的完全保护的肽基酸(87.8mg，19.3μM，1.1当量)和HCl.H-Trp-Ar(7.2mg，17.5μM，1.0当量)冷却到-10℃。添加HOOBt(3.1mg，19.3μM，1.1当量)和EDCI(3.4μL，19.3μM，1.1当量)。将反应混合物在室温下搅拌3h。然后在温和N₂流下吹除溶剂并添加7m1的TFA／H₂O／TIS(95：2.5：2.5)。在去保护45min后，吹除TFA且将油状残留物与5m1的二乙醚一起研磨。将沉淀物丸粒化且随后倾析醚。通过HPLC纯化所得固体以获得11.0mg酚酯IX(22％产率)。化学式：C₁₂₈H₂₀₁N₃₅O₃₆S₂；预期质量：2868.44，[M+2H]²⁺m／z=1435.22，[M+3H]³⁺m／z=957.15，[M+4H]⁴⁺m／z=71811。

肽X的合成：

通过SPPS使用上述一般程序来制备完全去保护的肽基酸X。在HPLC纯化后，获得28.1mg肽(11％产率)。化学式：C₂₁₅H₃₆₅N₆₇O₇₂S₂，预期质量：5101.64，[M+3H]³⁺m／z=1701.55，[M+4H]⁴⁺m／z=1276.41，[M+5H]⁵⁺m／z=1021.33，[M+6H]⁶⁺m／z=851.27，[M+7H]⁷⁺m／z=729.81，[M+8H]⁸⁺m／z=638.70。

连接肽XI：

XI的合成是在动力学受控的连接条件下进行。将肽IX(5.3mg，1.85μmol，1.27当量)和肽II(2.8mg，1.45μmol，1.0当量)溶解于连接缓冲剂(600μL，6M Gdn.HCl，100mMNa₂HPO₄，50mM TCEP，pH7.5)中。将反应混合物在室温下搅拌2h。通过LC-MS监测反应并通过HPLC直接纯化以提供1.3mg连接肽XI(20％产率)。化学式：C₂₀₄H₃₃₁N₅₉O₅₆S₂，预期质量：4567.43，[M+3H]³⁺m／z=1523.48，[M+4H]⁴⁺m／z=1142.86，[M+5H]⁵⁺m／z=914.49，[M+6H]⁶⁺m／z=762.24。

连接肽XII：

将肽XI(2.0mg，0.438μmol，1.1当量)和肽X(2.0mg，0.398μmol，1.0当量)溶解于连接缓冲剂(200μL，6M Gdn.HCl，300mM Na₂HPO₄，200mM MPAA，20mM TCEP，pH7.9)中。将反应混合物在室温下搅拌1h。通过LC-MS监测反应并通过HPLC直接纯化以获得1.6mg连接肽XII(43％产率)。

脱硫肽[Nle^8,18]hPTH(1-84)(XIII)：

向纯化连接肽XII(1.6mg)存于脱气CH₃CN／H₂O(v／v=1：1，0.2m1)中的溶液添加0.2m1的0.5M粘合分隔剂

TCEP溶液(皮尔斯)、0.02m1的2-甲基-2-丙硫醇和0.2m1的自由基引发剂(0.1M，存于H₂O中)。将反应混合物在37℃下搅拌2h。通过LC-MS监测反应并通过HPLC直接纯化以获得0.9mg[Nle^8,18]hPTH(1-84)(XIII)(57％产率)。化学式：C₄₁₀H₆₇₈N₁₂₆O₁₂₆，预期质量：9383.05，[M+5H]⁵⁺m／z=1877.61，[M+6H]⁶⁺m／z=1564.84，[M+7H]⁷⁺m／z=1341.44，[M+8H]⁸⁺m／z=1173.88，[M+9H]⁹⁺m／z=1043.56，[M+10H]¹⁰⁺m／z=939.30，[M+1IH]¹¹⁺m／z=854.00，[M+12H]¹²⁺m／z=782.92，[M+13H]¹³⁺m／z=722.77，[M+14H]¹⁴⁺m／z=626.54。

实例3：［Ｎle ^8.18 ]hPTH(1-37)的合成

肽XIV的合成：

将来自Fmoc SPPS的肽树脂(9.12μmol，1.0当量)与Boc-Leu(SSMe)-OH(4.8mg，15.50μmol，1.7当量)、HATU(17.3mg，45.6μmol，5.0当量)和DIEA(15.9μL，91.2μmo1，10.0当量)在DMF(500μL)中混合并在室温下搅拌10min。将树脂用DMF、DCM和MeOH洗涤若干次并在真空下干燥。将干燥树脂用TFA／TIS／H₂O(95：2.5：2.5)处理40min，通过N₂吹除TFA且将油状残留物与二乙醚一起研磨。将沉淀物丸粒化且随后倾析醚。通过HPLC纯化所得固体以获得8.2mg肽XIV(51％产率，基于树脂来计算)。

肽XV的合成：

将肽IX(1.8mg，0.628μmol，1.5当量)和肽XIV(0.74mg，0.418μmol，1.0当量)溶解于连接缓冲剂(167μL，6M Gdn.HCl，100mM Na₂HPO₄，50mM TCEP，pH7.5)中。将反应混合物在室温下搅拌2.5h。通过LC-MS监测反应并用1m1的CH₃CN／H₂O／AcOH(1：1：5％)溶液骤冷。使用HPLC纯化提供0.8mg肽XV(44％)。化学式：C₁₉₇H₃₂₀N₅₈O₅₄S，预期质量：4394.38，[M+3H]³⁺m／z=1465.79，[M+4H]⁴⁺m／z=1099.59，[M+5H]⁵⁺m／z=879.88，[M+6H]⁶⁺m／z=733.40。

脱硫肽[Nle^8,18]hPTH(1-37)(XVI)：

向纯化连接肽XV(0.8mg)存于脱气CH₃CN／H₂O(v／v=1：1，0.2m1)中的溶液添加0.2m1的0.5M粘合分隔剂

TCEP溶液(皮尔斯)、0.02m1的2-甲基-2-丙硫醇和0.2m1的自由基引发剂(0.1M，存于H₂O中)。将反应混合物在37℃下搅拌4h。通过LC-MS监测反应并通过HPLC直接纯化以提供0.3mg[Nle^8,18]hPTH(1-37)(XVI)(38％)。化学式：C₁₉₇H₃₂₀N₅₈O₅₄，预期质量：4362.41，[2M+5H]⁵⁺m／z=1745.96，[M+3H]³⁺m／z=1455.14，[M+4H]⁴⁺m／z=1091.60，[M+5H]⁵⁺m／z=873.48，[M+6H]⁶⁺m／z=728.07。

实例4.hPTHrP(XXXVII)的合成

肽XXX的合成：

将完全保护的肽H-AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEIR-OH(510.00mg，67.6μmol，1.0eq)与(2S)-1-(2-(乙基硫代亚磺酰基)苯氧基)-1-氧代-5-(3-((2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基)磺酰基)胍基)戊烷-2-氯化铵(85.37mg，2.0eq)和HOOBt(22.06mg，2.0eq)在溶剂(1.5m1，CHCl₃／TFE=3：1v／v)中混合且然后冷却到-10℃。向所述混合物缓慢添加EDC(23.9μ1，2.0eq)。随后使混合物升温到23℃并搅拌3h，用UPLC监测。将所得混合物用存于水中的5％HOAc(2.0m1)处理并分离有机层。然后将有机层注入混合剂B溶液(30.0m1)中并搅拌1.5h。之后，在N₂流下浓缩溶液并通过倒入冷二乙醚(30.0m1)来使粗制产物沉淀。将悬浮液离心并倾析上部醚层。用二乙醚(2×30.0ml)冲洗沉淀物且将沉淀物溶解于水性MeCN(20.0m1)中并冻干。用制备型HPLC进一步纯化所得粗制产物以提供33.12mg肽XXX(11％产率)。化学式：C₂₀₅H₃₂₅N₆₃0₅₃S₂，预期质量4581.41，[M+4H]⁴⁺m／z=1146.9，[M+5H]⁵⁺m／z=917.8。

肽XXXI的合成：

将完全保护的肽H-TSEVSPNSKPSPNTKNHPVRFGSDDEGRY-OH(147.0mg，25.6μmol，1.0eq)与(S)-3-((2-氨基-3-(4-(叔丁氧基)苯基)丙酰基)硫基)丙酸乙酯(18.12mg，2.0eq)和HOOBt(7.96mg，2.0eq)在溶剂(0.25m1，CHCl₃／TFE=3：1v／v)中混合且然后冷却到-10℃。向所述混合物缓慢添加EDC(9.1μ1，2.0eq)。随后使混合物升温到23℃并搅拌3h，用UPLC监测。将所得混合物用存于水中的5％HOAc(0.5m1)处理并分离有机层。然后将有机层注入混合剂B溶液(20.0m1)中并搅拌1.5h。之后，在N₂流下浓缩溶液并通过倒入冷二乙醚(20.0m1)来使粗制产物沉淀。将悬浮液离心并倾析上部醚层。用二乙醚冲洗沉淀物(2×20.0m1)且将沉淀物溶解于水性MeCN(15.0m1)中并冻干。通过制备型进一步纯化所得粗制产物以提供25.34mg肽XXXI(29％产率)。化学式：C₁₄₇H₂₂₉N₄₃O₅₁8₃，预期质量3508.58，[M+3H]³⁺m／z=1170.9，[M+4H]⁴⁺m／z=878.9。

肽XXXII的合成：

将来自Fmoc SPPS的肽树脂(0.10mmol，1.0eq)与Boc-Leu(SSMe)-OH(31.91mg，1.0eq)、HATU(114.02mg，3.0eq)和DIEA(104μ1，6.0eq)在DMF(1.0m1)中混合并在23℃下搅拌10min。用DMF、DCM和MeOH将树脂洗涤若干次并在真空下干燥。通过用AcOH／TFE／DCM(1：1：8)处理2×1小时来裂解树脂，以获得完全保护的肽基酸。

将完全保护的肽基酸(266.80mg，29.7μmol，1.0eq)和(2S)-2-氨基-3-(叔丁氧基)丙酸2-(乙基硫代亚磺酰基)苯基酯(19.58mg，2.0eq)溶解于溶剂(594μ1，CHCl₃／TFE=3：1v／v)中。向此混合物中添加HOOBt(9.69mg，2.0eq)。然后对混合物进行超声波处理并冷却到-10℃。向所述混合物缓慢搅拌添加EDC(11.0μ1，2.0eq)。随后使混合物升温到23℃并搅拌3h，用UPLC监测。将所得混合物用存于水中的5％HOAc(1.0m1)处理且分离有机层。然后将有机层注入混合剂B溶液(30.0m1)中并搅拌1.5h。之后，在N₂流下浓缩溶液并通过倒入冷二乙醚(30.0m1)来使粗制产物沉淀。将悬浮液离心并倾析上部醚层。用二乙醚冲洗沉淀物两次(每次30.0m1)并将沉淀物溶解于水性MeCN(1：1v／v，20m1)中并冻干。用HPLC进一步纯化所得粗制产物以提供46.46mg肽XXXII(9％总产率)。化学式：C₂₂₅H₃₉₁N₇₁O₆₄5₄，预期质量5239.84，[M+4H]⁴⁺m／z=1311.9，[M+5H]⁵⁺m／z=1049.5。

肽XXXIII的合成：

XXXIII的合成是通过Fmoc-SPPS直接完成(0.05mmol规模)。化学式：C₁₄₅H₂₃₁N₄₃O₅₅S₂，预期质量3518.60，[M+3H]³⁺m／z=1174.3，[M+4H]⁴⁺m／z=881.2。

肽XXXIV的合成：

将肽XXX(2.5mg，0.39μmol，1.00eq)和肽XXXI(1.54mg，0.44μmol，1.12eq)溶解于水性MeCN中并冻干。向所得起始材料添加连接缓冲剂(300μ1，6M Gdn HCl，100mMNa₂HPO₄，50mM TCEP，pH7.2)。将混合物在氩和23℃下搅拌3h，用UPLC监测且随后用制备型HPLC纯化以提供1.63mg肽XXXIV(49％产率)。化学式：C₃₅₇H₆₀₂N₁₁₄O₁₁₈S₂，预期质量8438.41，[M+11H]¹¹⁺m／z=768.32，[M+12H]¹²⁺m／z=845.39。

肽XXXV的合成：

将肽XXXII(3.53mg，0.77μmol，1.0eq)和肽XXXIII(2.70mg，0.77μmol，1.0eq)溶解于连接缓冲剂(350μ1，6M Gdn HCl，100mM Na₂HP0₄，50mM TCEP，pH7.2)中。将混合物在氩和23℃下搅拌3h，用UPLC监测且随后用制备型HPLC纯化以提供3.35mg肽XXXV(56％产率)。化学式：C₃₄₀H₅₃₆N₁₀₆0₁₀₃S₂，预期质量7815.94，[M+5H]⁵⁺m／z=1564.8，[M+6H]⁶⁺m／z=1304.1。

肽XXXVI的合成：

肽XXXIV与肽XXXV的连接是在动力学受控的条件下进行。将肽XXXIV(2.28mg，0.29μmol，1.0eq)和肽XXXV(2.95mg，0.35μmol，1.2eq)溶解于连接缓冲剂(292μ1，6MGdn HCl，300mM Na₂HPO₄，20mM TCEP，200mM MPAA，pH7.2)中。将混合物在氩和23℃下搅拌16h。用UPLC监测反应且随后用制备型HPLC纯化以提供6.91mg肽XXXVI(含有TCEP用于抵抗氧化)。化学式：C₆₉₂H₁₁₂₈N₂₂₀O₂₁₉S₃，预期质量16120.31，[M+14H]¹⁴⁺m／z=1153.03，[M+15H]¹⁵⁺m／z=1076.29，[M+16H]¹⁶⁺m／z=1009.17，[M+17H]¹⁷⁺m／z=949.88，[M+18H]¹⁸⁺m／z=897.13。

肽XXXVII的合成：

将肽XXXVI溶解于缓冲剂(1.4m1，6M Gdn HCl，100mM Na₂HPO₄.pH7.2)中。向此缓冲剂添加VA-044(32.0mg)和粘合分隔剂(600μ1，TCEP的0.5M溶液)和tBuSH(100μ1)。将系统在氩气氛和37℃下搅拌2h。将额外VA-044(32.0mg，存于1.0m1水中)和tBuSH(100μ1)添加到混合物中并将混合物再搅拌1h。用LC-MS监测反应。用制备型HPLC直接纯化产物以提供0.92mg XXXVII(20％产率，经两个步骤)。化学式：C₆₉₂H₁₁₂₈N₂₂₀O₂₁₉，预期质量16024.39，[M+14H]¹⁴⁺m／z=1147.26，[M+15H]¹⁵⁺m／z=1071.15，[M+16H]¹⁶⁺m／z=1003.39，[M+17H]¹⁷⁺m／z=944.74，[M+18H]¹⁸⁺m／z=892.76。

实例5.甲状旁腺激素类似物的活体外分析

甲状旁腺激素(PTH)通过其受体PTHR1或PTHR在维持离子化钙(Ca⁺⁺)和无机磷酸盐(Pi)的正常血液浓度中起关键作用。因此，在对血液Ca⁺⁺浓度降低的快速反应中，从甲状旁腺分泌PTH且其作用于骨以促进对矿化基质的吸收，且作用于肾以促进从肾小球滤液重吸收Ca⁺⁺。骨和肾中的这些协调作用用于将血液和流体Ca⁺⁺水平维持在狭窄范围(约1.2mM±10％)。PTHR1是主要通过Gαs／cAMP／PKA第二信使路径传导信号的B类G蛋白偶联受体。

对PTH受体对PTH类似物的结合亲和性的分析

在基于膜的竞争分析中评价类似物结合呈非G蛋白依赖性构象R⁰和G蛋白依赖性构象RG的PTHR的能力。用于R⁰的分析是使用¹²⁵I-PTH(1-34)示踪放射性配体且在过量GTPγS存在下执行。在这些R⁰条件下，每一类似物以在低到中纳摩尔范围内的亲和性结合(IC₅₀=4nM到40nM；Log M=-8.4到-7.4；图34A，表1)。用于RG结合的分析是使用¹²⁵I-M-PTH(1-15)示踪放射性配体和来自表达高亲和性Gαs突变体的细胞的膜来执行。在这些RG条件下，每一类似物以在亚纳摩尔范围内的亲和性结合(IC₅₀=0.12nM到0.25nM；Log M=-9.9到-9.6；图34B，表1)。

cAMP分析：使用经瞬时转染以表达人类PTHR1的完整HEK-293细胞来评价类似物的信号传导性质。在IBMX存在下用配体将细胞处理30分钟，并通过RIA测量细胞中的细胞内cAMP水平。还使用经瞬时共转染以表达人类PTHR1和在含有cAMP反应单元的启动子的转录控制下的含有荧光素酶报道子基因的CRE-Luc cAMP报道子质粒的HEK-293细胞来分析类似物。在这些分析中，类似物展现在低到中纳摩尔范围内的潜能(EC₅₀=约1nM到0.1nM；Log M=-9.0到-9.9；(图34C和D，表1)。

实例6.甲状旁腺激素类似物的活体内分析

在小鼠中PTH类似物对血液Ca⁺⁺水平的效应.在正常9周龄雄性C57BL／6小鼠中评价类似物刺激血液Ca⁺⁺增加的能力。在注射前，野生型小鼠中的血液Ca⁺⁺浓度为约1.24mM(图35A和35B)。在注射PTH类似物后，血液Ca⁺⁺水平稳定升高并在截至注射后1小时时达到约1.36mM的峰值。然后，对于所测试每一类似物，血液Ca⁺⁺水平在截至6小时时回到媒剂对照水平。

材料和方法

肽和试剂：所用PTH衍生物包括根据所述制备的人类PTH(1-34)NH₂和放射性配体¹²⁵I-PTH(1-34)(¹²⁵I-[Nle⁸,²¹,Tyr³⁴]大鼠PTH(1-34)NH₂)和¹²⁵I-M-PTH(1-15)(¹²⁵I-[Aib¹,³Nle⁸,Gin¹⁰,Har¹¹,Ala¹²,Trp¹⁴,Tyr¹⁵]PTH(1-15)NH₂)。

PTH结合和信号传导分析:通过在96孔板中使用瞬时转染的COS-7细胞膜执行的竞争反应来评价与呈两种药理上不同的构象RG和R0的人类PTHR的结合。简单来说，与非G蛋白依赖性构象R⁰的结合是使用¹²⁵I-PTH(1-34)作为示踪放射性配体来评价，且在反应中包括GTPγS(1×10^-5M)。与G蛋白依赖性构象RG的结合是使用含有高亲和性负显性Gαs亚单位(Gαs^ND)和¹²⁵I-M-PTH(1-15)的膜作为示踪放射性配体来评价。

通过cAMP路径的信号传导是在经瞬时转染以表达人类PTHR的HEK-293细胞中评价。用含有磷酸二酯酶抑制剂、IBMX和PTH类似物的缓冲剂将96孔板中的细胞处理30分钟；然后通过用50mM HCl替代缓冲剂并在干冰上冷冻所述板来裂解细胞；然后通过RIA对裂解物中的cAMP进行定量。

还使用CRE-Luc报道子分析使用经瞬时共转染以表达WT hPTHR以及cAMP反应单元／荧光素酶报道子基因构筑体(Cre-Luc)的HEK-293细胞来评价对cAMP的刺激。在CO₂培育器中，在37。C下用培养基中的配体将细胞处理4小时，之后添加SteadyGlo荧光素酶试剂(普洛麦格(Promega))，并使用珀金埃尔默(PerkinElmer)Envision读板器记录发光。

对PTH类似物在小鼠中的效应的测量:从查理斯河(Charles River)实验室获得C57BL／6品种的9周龄雄性小鼠，并根据M.G.H.采用的伦理守则进行处理。向小鼠皮下注射媒剂(10mM柠檬酸／150mM NaCl／0.05％吐温-80，pH5.0)或含有PTH类似物的媒剂。以20nmol／kg的剂量注射肽。在即将注射前和在注射后采集尾静脉血以供使用西门子(Siemens)RapidLab348Ca⁺⁺／pH分析仪分析Ca⁺⁺浓度。

数据计算使用微软(Microsoft)Excel和全杰(GraphPad Prism)4.0软件包处理数据。

实例7.甲状旁腺激素类似物的稳定性研究.

使用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)来监测四种合成化合物在一段时间中的降解。在环境条件(室温、空气、水溶液和中性pH)下，分析结果表明，天然PTH(1-84)随时间显著降解，且在7天后超过90％(基于UV信号估计)的PTH降解为片段或其它副产物。相反，类似物[Nle^8,18]hPTH(1-84)在相同条件下显示显著更强的稳定性，其中在7天后观察到少于10％降解。两种其它类似物hPTH(1-37)和[Nle^8,１８］hPTH(1-37)显示类似的储存稳定性，且分析结果显示，在两种情形中，在7天后降解约70％。

SEQIDNO：1

S₁V₂S₃E₄I₅Q₆L₇M₈H₉N₁₀L₁₁G₁₂K₁₃H₁₄L₁₅N₁₆S₁₇M₁₈E₁₉R₂₀V₂₁E₂₂W₂₃L₂₄R₂₅K₂₆K₂₇L₂₈Q₂₉D₃₀V₃₁H₃₂N₃₃F₃₄V₃₅A₃6L₃₇G₃₈A₃₉P₄₀L₄₁A₄₂P₄₃R₄₄D₄₅A₄₆G₄₇S₄₈Q₄₉R₅₀P₅₁R₅₂K₅₃K₅₄E₅₅D₅₆N₅₇V₅8L₅₉V₆₀E₆₁S₆₂H₆₃E₆₄K₆₅S₆₆L₆₇G₆₈E₆₉A₇₀D₇₁K₇₂A₇₃D₇₄V₇₅N₇₆V₇₇L₇₈T₇₉K₈₀A₈₁K₈₂S₈₃Q₈₄

SEQIDNO:2

X₁V₂S₃E₄I₅Q₆X₇X₈H₉N₁₀L₁₁G₁₂K₁₃H₁₄L₁₅X₁₆S₁₇X₁₈E₁₉R₂₀X₂₁X₂₂W₂₃L₂₄R₂₅X₂₆K₂₇L₂₈Q₂₉D₃₀V₃₁H₃₂N₃₃F₃₄X₃₅X₃₆L₃₇G₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃R₄₄X₄₅X₄₆X₄₇X₄₈Q₄₉R₅₀P₅₁X₅₂K₅₃K₅₄E₅₅X₅₆N₅₇X₅₈X₅₉X₆₀X₆₁X₆₂X₆₃X6₄K₆₅S₆₆L₆₇G₆₈E₆₉X₇₀D₇₁K₇₂A7₃X₇₄V7₅X₇₆V₇7L₇₈X₇₉K₈₀X₈₁K₈₂X₈₃Q₈₄

SEQIDNO：3

X₈H₉N₁₀L₁₁G₁₂K₁₃H₁₄L₁₅

SEQ IDNO：4

W₂₃L₂₄R₂₅K₂₆K₂₇L₂₈Q₂₉D₃₀V₃₁H₃₂N₃₃F₃₄

SEQIDNO：5

X₈H₉N₁₀L₁₁G₁₂K₁₃H₁₄L₁₅X₁₆S₁₇X₁₈

SEQIDNO：6

X₁V₂S₃E₄I₅Q₆X₇M₈H₉N₁₀L₁₁G₁₂K₁₃H₁₄L₁₅X₁₆S₁₇M₁₈E₁₉R₂₀X₂₁X₂₂W₂₃L₂₄R₂₅X₂₆K₂₇L₂₈Q₂₉D₃₀V₃₁H₃₂N₃₃F₃₄

SEQIDNO：7

X₁V₂S₃E₄I₅Q₆X₇X₈H₉N₁₀L₁₁G₁₂K₁₃H₁₄L₁₅X₁₆S₁₇X₁₈E₁₉R₂₀X₂₁X₂₂W₂₃L₂₄R₂₅X₂₆K₂₇L₂₈Q₂₉D₃₀V₃₁H₃₂N₃₃F₃₄

SEQ ID NO：8

A₁V₂S₃E₄H₅Q₆L₇L₈H₉D₁₀K₁₁G₁₂K₁₃S₁₄I₁₅Q₁₆D₁₇L₁₈R₁₉R₂₀R₂₁F₂₂F₂₃L₂₄H₂₅H₂₆L₂₇I₂₈A₂₉E₃₀I₃₁H₃₂T₃₃A₃₄E₃₅I₃₆R₃₇A₃₈T₃₉S₄₀E₄₁V₄₂S₄₃P₄₄N4₅S₄₆K₄₇P₄₈S₄₉P₅₀N₅₁T₅₂K₅₃N₅₄H₅₅P₅₆V₅₇R₅₈F₅₉G₆₀S₆₁D₆₂D₆₃E₆₄G₆₅R₆₆Y₆₇L₆₈T₆₉Q₇₀E₇₁T₇₂N₇₃K₇₄V₇₅E₇₆T₇₇Y₇₈K₇₉E₈₀Q₈₁P₈₂L₈₃K₈₄T₈₅P₈₆G₈₇K₈₈K₈₉K₉₀K₉₁G₉₂K₉₃P₉₄G₉₅K₉₆R₉₇K₉₈E₉₉Q₁₀₀E₁₀₁K₁₀₂K₁₀₃K₁₀₄R₁₀₅R₁₀₆T₁₀₇R₁₀₈S₁₀₉A₁₁₀W₁₁₁L₁₁₂D₁₁₃S₁₁₄G₁₁₅V₁₁₆T₁₁₇G₁₁₈S₁₁₉G₁₂₀L₁₂₁E₁₂₂G₁₂₃D₁₂₄H₁₂₅L₁₂₆S₁₂₇D₁₂₈T₁₂₉S₁₃₁₀T₁₃₁T₁₃₂S₁₃₃L₁₃₄E₁₃₅L₁₃₆D₁₃₇S₁₃₈R₁₃₉R₁₄₀H₁₄₁

SEQIDNO：9

A₁V₂S₃E₄H₅Q₆L₇L₈H₉D₁₀K₁₁G₁₂K₁₃S₁₄I₁₅Q₁₆D₁₇L₁₈R₁₉R₂₀R₂₁X₂₂F₂₃L₂₄X₂₅X₂₆L₂₇I₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂T₃₃A₃₄E₃₅I₃₆R₃₇A₃₈T₃₉S₄₀E₄₁V₄₂S₄₃P₄₄N₄₅X₄₆K₄₇p₄₈X₄₉X₅₀N₅₁T₅₂K₅₃N₅₄X₅₅X₅₆V₅₇R₅₈F₅₉G₆₀S₆₁X₆₂D₆₃E₆₄G₆₅X₆₆Y₆₇L₆₈T₆₉Q₇₀E₇₁T₇₂N₇₃K₇₄X₇₅X₇₆X₇₇Y₇₈K₇₉E₈₀Q₈₁P₈₂L₈₃K₈₄X₈₅X₈₆G₈₇K₈₈K₈₉K₉₀K₉₁X₉₂K₉₃P₉₄G₉₅K₉₆R₉₇X₉₈E₉₉Q₁₀₀E₁₀₁K₁₀₂K₁₀₃K₁₀₄R₁₀₅R₁₀₆X₁₀₇R₁₀₈S₁₀₉A₁₁₀W₁₁₁X₁₁₂X₁₁₃S₁₁₄X₁₁₅X₁₁₆X₁₁₇X₁₁₈X₁₁₉X₁₂₀X₁₂₁X₁₂₂X₁₂₃X₁₂₄X₁₂₅X₁₂₆X₁₂₇X₁₂₈X_{1 29}S₁₃₀X₁₃₁X₁₃₂X₁₃₃X₁₃₄X₁₃₅X₁₃₆X₁₃₇X₁₃₈X₁₃₉X₁₄₀H₁₄₁

SEQIDNO：10

H₅Q₆L₇L₈H₉D₁₀K₁₁G₁₂K₁₃S₁₄I₁₅Q₁₆D₁₇L₁₈R₁₉R₂₀R₂₁

SEQIDNO：11

T₃₃A₃₄E₃₅I₃₆R₃₇A₃₈T₃₉S₄₀E₄₁V₄₂S₄₃P₄₄N₄₅

SEQIDNO：12

Y₆₇L₆₈T₆₉Q₇₀E₇₁T₇₂N₇₃K₇₄

SEQ ID NO：13

E₉₉Q₁₀₀E₁₀₁K₁₀₂K₁₀₃K₁₀₄R₁₀₅R₁₀₆

SEQIDNO：14

S₁V₂S₃E₄I₅Q₆L₇M₈H₉N₁₀L₁₁G₁₂K₁₃H₁₄L₁₅N₁₆S₁₇M₁₈E₁₉R₂₀V₂₁E₂₂W₂₃L₂₄R₂₅K₂₆K₂₇L₂₈Q₂₉D₃₀V₃₁H₃₂N₃₃F₃₄

SEQIDNO：15

S₁V₂S₃E₄I₅Q₆L₇M₈H₉N₁₀L₁₁G₁₂K₁₃H₁₄L₁₅N₁₆S₁₇M₁₈E₁₉R₂₀V₂₁E₂₂W₂₃L₂₄R₂₅K₂₆K₂₇L₂₈Q₂₉D₃₀V₃₁H₃₂N₃₃F₃₄V₃₅A₃₆L₃₇

SEQIDNO：16

A₁V₂S₃E₄H₅Q₆L₇L₈H₉D₁₀K₁₁G₁₂K₁₃S₁₄I₁₅Q₁₆D₁₇L₁₈R₁₉R₂₀R₂₁F₂₂F₂₃L₂₄H₂₅H₂₆L₂₇I₂₈A₂₉E₃₀I₃₁H₃₂T₃₃A₃₄E₃₅I₃₆R₃₇A₃₈T₃₉S₄₀E₄₁V₄₂S₄₃P₄₄N₄₅S₄₆K₄₇P₄₈S₄₉P₅₀N₅₁T₅₂K₅₃N₅₄H₅₅P₅₆V₅₇R₅₈F₅₉G₆₀S₆₁D₆₂D₆₃E₆₄G₆₅R₆₆Y₆₇L₆₈T₆₉Q₇₀E₇₁T₇₂N₇₃K₇₄V7₅E7₆T7₇Y₇₈K₇₉E₈₀Q₈₁P₈₂L₈₃K₈4T₈₅P₈₆G₈7K₈₈K₈₉K₉₀K₉₁G₉₂K₉₃P₉₄G₉₅K₉₆R₉₇K₉₈E₉₉Q₁₀₀E₁₀₁K₁₀₂K₁₀₃K₁₀₄R₁₀₅R₁₀₆T₁₀₇R₁₀₈S₁₀₉A₁₁₀W₁₁₁L₁₁₂D₁₁₃S₁₁₄G₁₁₅V₁₁₆T₁₁₇G₁₁₈S₁₁₉G₁₂₀L₁₂₁E₁₂₂G₁₂₃D₁₂₄H₁₂₅L₁₂₆S₁₂₇D₁₂₈T₁₂₉S₁₃₀T₁₃₁T₁₃₂S₁₃₃L₁₃₄E₁₃₅L₁₃₆D₁₃₇S₁₃₈R₁₃₉

SEQIDNO:17

A₁V₂S₃E₄H₅Q₆L₇L₈H₉D₁₀K₁₁G₁₂K₁₃S₁₄I₁₅Q₁₆D₁₇L₁₈R₁₉R₂₀R₂₁F₂₂F₂₃L₂₄H₂₅H₂₆L₂₇I₂₈A₂₉E₃₀I₃₁H₃₂T₃₃A₃₄E₃₅I₃₆R₃₇A₃₈T₃₉S₄₀E₄₁V₄₂S₄₃P₄₄N₄₅S₄₆K₄₇P4₈S₄₉P₅₀N₅₁T₅₂K₅₃N₅₄H₅₅P₅₆V₅₇R₅₈F₅₉G₆₀S₆₁D₆₂D₆₃E₆₄G₆₅R₆₆Y₆₇L₆₈T₆₉Q₇₀E₇₁T₇₂N₇₃K₇₄V₇₅E₇₆T₇₇Y₇₈K₇₉E₈₀Q₈₁P₈₂L₈₃K₈₄T₈₅P₈₆G₈₇K₈₈K₈₉K₉₀K₉₁G₉₂K₉₃P₉₄G₉₅K₉₆R₉₇K₉₈E₉₉Q₁₀₀E₁₀₁K₁₀₂K₁₀₃K₁₀₄R₁₀₅R₁₀₆T₁₀₇R₁₀₈S₁₀₉A₁₁₀W₁₁₁L₁₁₂D₁₁₃S₁₁₄G₁₁₅V₁₁₆T₁₁₇G₁₁₈S₁₁₉G₁₂₀L₁₂₁E₁₂₂G₁₂₃D₁₂₄H₁₂₅L₁₂₆S₁₂₇D₁₂₈T₁₂₉S₁₃₀T₁₃₁T₁₃₂S₁₃₃L₁₃₄E₁₃₅L₁₃₆D₁₃₇S₁₃₈R₁₃₉T₁₄₀A₁₄₁L₁₄₂L₁₄₃W₁₄₄G₁₄₅L₁₄₆K₁₄₇K₁₄₈K₁₄₉K₁₅₀E₁₅₁N₁₅2N₁₅₃R₁₅₄R₁₅₅T₁₅₆H₁₅₇H₁₅₈M₁₅₉Q₁₆₀L₁₆₁M₁₆₂I₁₆₃S₁₆₄L₁₆₅F₁₆₆K₁₆₇S₁₆₈P₁₆₉L₁₇₀L₁₇₁L₁₇₂L₁₇₃

SEQIDNO：18

S₁V₂S₃E₄I₅Q₆L₇M₈H₉N₁₀L₁₁G₁₂K₁₃H₁₄L₁₅N₁₆S₁₇M₁₈E₁₉R₂₀V₂₁E₂₂W₂₃L₂₄R₂₅K₂₆K₂₇L₂₈Q₂₉D₃₀V₃₁H₃₂N₃₃F₃₄V₃₅A₃₆L₃₇G₃₈A₃₉

Claims (31)

1.一种长度为1到84个氨基酸且氨基酸序列与SEQ ID NO：2≥80％一致的甲状旁腺激素肽，其中所述甲状旁腺激素肽在一个或一个以上对应于以下残基的位置处包括非天然氨基酸：X₁、X₇、X₈、X₁₆、X₁₈、X₂₁、X₂₂、X₂₆、X₃₅、X₃₆、X₃₉、X₄₀、X₄₁、X₄₂、X₄₃、X₄₅、X₄₆、X₄₇、X₄₈、X₅₂、X₅₆、X₅₈、X₅₉、X₆₀、X₆₁、X₆₂、X₆₃、X₆₄、X₇₀、X₇₄、X₇₆、X₇₉、X₈₁或X₈₃。

2.根据权利要求1所述的甲状旁腺激素肽，其中所述甲状旁腺激素包括至少一个正亮氨酸(Nle)和／或甲氧丁氨酸(Mox)残基。

3.根据权利要求1所述的甲状旁腺激素肽，其中所述甲状旁腺激素肽在对应于残基8、残基18和其组合的位置处包括正亮氨酸和／或甲氧丁氨酸残基。

4.根据权利要求1所述的甲状旁腺激素肽，其中所述肽包括SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5中的至少一个。

5.根据权利要求3所述的甲状旁腺激素肽，其中以下表述中的至少一个是真实的：

X₁是S、A、Nle或Mox；

X₇是F、L、Nle或Mox；

X₁₆是N、S、A、Nle或Mox；

X₁₈是M、L、V、Nle或Mox；

X₂₁是V、M、Nle或Mox；和

X₂₂是E、Q、Nle或Mox。

6.根据权利要求4所述的甲状旁腺激素肽，其中以下表述中的至少一个是真实的：

X₃₆是A、Nle或Mox；

X₃₉是A、Nle或Mox；

X₄₅是D、Nle或Mox；

X₄₈是S、Nle或Mox；

X₅₆是D、Nle或Mox；

X₅₈是V、Nle或Mox；

X₆₀是V、Nle或Mox；

X₆₁是E、Nle或Mox；

X₆₂是E、Nle或Mox；

X₇₀是A、Nle或Mox；

X₇₄是D、Nle或Mox；和

X₈₁是A、Nle或Mox。

7.根据权利要求1所述的甲状旁腺激素肽，其中所述肽被至少一个聚糖基团糖基化。

8.根据权利要求7所述的甲状旁腺激素肽，其中所述肽在丝氨酸或苏氨酸残基处被糖基化。

9.根据权利要求8所述的肽，其中所述至少一个聚糖基团选自

10.根据权利要求8所述的肽，其中所述至少一个聚糖基团是

11.根据权利要求8所述的肽，其中所述至少一个聚糖基团是

12.根据权利要求7所述的肽，其中所述肽在天冬酰胺或谷氨酰胺残基处被糖基化。

13.根据权利要求12所述的肽，其中所述至少一个聚糖基团选自：

14.根据权利要求13所述的肽，其中所述至少一个聚糖基团是

15.根据权利要求13所述的肽，其中所述至少一个聚糖基团是

16.根据权利要求13所述的肽，其中所述至少一个聚糖基团是

17.根据权利要求13所述的肽，其中所述至少一个聚糖基团是

18.一种长度为1到37个氨基酸且氨基酸序列与SEQ ID NO：15≥80％一致的甲状旁腺激素肽，其中所述甲状旁腺激素肽在对应于残基8、残基18和其组合的位置处包括正亮氨酸和／或甲氧丁氨酸残基。

19.一种氨基酸序列包括与SEQ ID NO：14≥80％一致的单元的甲状旁腺激素肽，其中所述甲状旁腺激素肽在对应于残基8、残基18和其组合的位置处包括正亮氨酸和／或甲氧丁氨酸残基。

20.一种甲状旁腺激素相关肽，其长度为1到141个氨基酸且氨基酸序列与SEQ IDNO：8≥80％一致。

21.一种医药组合物，其包含根据权利要求2所述的甲状旁腺激素肽、根据权利要求7所述的糖基化甲状旁腺激素片段或根据权利要求18所述的甲状旁腺激素相关蛋白质和医药上可接受的赋形剂。

22.一种制备生物活性激素或糖肽的方法，其在并非半胱氨酸或甲硫氨酸的氨基酸残基处包含至少一个天然化学连接偶联。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述天然化学连接偶联发生在选自丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸和脯氨酸的残基处。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述生物活性激素选自甲状旁腺激素(1到34)、甲状旁腺激素(1到37)、甲状旁腺激素(1到39)、甲状旁腺激素(1到84)、N-糖基化甲状旁腺激素、O-糖基化甲状旁腺激素、甲状旁腺激素相关蛋白质(1到139)、甲状旁腺激素相关蛋白质(1到141)、甲状旁腺激素相关蛋白质(1到173)。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物活性激素是甲状旁腺激素(1到34)。

26.根据权利要求25所述的方法，其包含以下步骤：

(i)通过片段I和II的所述天然化学连接制备片段V：

(ii)通过片段III和IV的所述天然化学连接制备片段VI：

(iii)将片段VI去保护以产生片段VII：

(iv)通过天然化学连接偶联片段V和VII以产生片段VIII：

(v)还原片段VIII以产生hPTH肽：

27.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物活性激素是甲状旁腺激素相关蛋白质(1到141)。

28.根据权利要求27所述的方法，其包含片段XXX、XXXI、XXXII和XXXIII的天然化学连接偶联。

29.一种天然化学连接片段，其选自由以下片段组成的群组：I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX、XX、XXI、XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXVI、XXVII、XXVIII、XXIX、XXX、XXXI、XXXII、XXXIII、XXXIV、XXXV、XXXVI或XXXVII。

30.一种治疗与甲状旁腺功能减退症有关的疾病、病症和／或症状的方法，其包含投与治疗有效量的hPTH或hPTHrP肽和／或类似物。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病、病症和／或症状选自骨质疏松、低钙血症和低尿钙症。

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