CN103499684B - 一种检测桃蚜抗药性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测桃蚜抗药性的方法，其是在诊断剂量下采用酶标仪动力学法检测桃蚜田间种群个体对有机磷或氨基甲酸酯类杀虫药剂的抗药性，所述有机磷杀虫药剂为氧化乐果，氨基甲酸酯类杀虫药剂为抗蚜威；氧化乐果的诊断剂量为180.43μM，抗蚜威的诊断剂量为18.85μM。

Description

一种检测桃蚜抗药性的方法
技术领域
本发明涉及一种对农业害虫抗药性进行监测的测定技术方法，具体地说，是以诊断剂量检测桃蚜对有机磷和氨基甲酸酯类两大系列杀虫药剂抗药性的方法。
背景技术
桃蚜是世界上分布最广最为重要的害虫之一，可以在50多个科400多种植物上取食，不仅能够直接刺吸植物营养，造成植物严重失水和营养不良，还可以传播病毒，对植物造成更大的间接伤害，对农业生产造成巨大的经济损失。长期以来，对桃蚜的防治主要以化学防治为主，由于化学杀虫剂的大量、持续及不合理使用，致使许多国家和地区的桃蚜对常用杀虫剂产生了不同程度的抗药性。
乙酰胆碱酯酶作为神经系统胆碱激性传导的重要组分，主要功能是快速水解神经传递介质—乙酰胆碱。以乙酰胆碱酯酶为分子靶标发展了有机磷和氨基甲酸酯类两大系列的杀虫药剂。昆虫乙酰胆碱酯酶基因在这两类药剂的胁迫作用下，发生变异后会导致抗药性的产生。
桃蚜抗药性的形成和发展给化学防治造成了很大困难，如何快速、准确的检测桃蚜抗药性水平是非常重要的。现在用于抗药性监测的方法主要包括传统的生物测定、生化检测法、免疫学方法以及分子生物学方法，其中生化检测方法是简单快速准确反映靶标酶变异情况的检测方法。
现有技术利用生化方法测定桃蚜抗药性，一般采用分光光度计，测定群体比活力，这种方法不但用虫量大，而且操作程序复杂。本发明采用酶标仪法，利用诊断剂量可快速诊断桃蚜个体抗性水平，用虫量少，通过个体抗性水平了解种群抗性水平，简化操作，仪器自动化读数精确，可以同时了解个体及种群抗性水平，诊断剂量的应用，可以快速准确区别抗性水平高低的个体，从而了解种群抗性水平，指导田间用药。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测桃蚜抗药性的方法，其是在诊断剂量下采用酶标仪动力学法检测桃蚜田间种群个体对有机磷或氨基甲酸酯类杀虫药剂的抗药性。
所述有机磷杀虫药剂为氧化乐果，氨基甲酸酯类杀虫药剂为抗蚜威；所述诊断剂量氧化乐果为180.43μM，抗蚜威为18.85μM。
进一步地，氧化乐果和抗蚜威的诊断剂量的获得是通过选用室内选育的敏感种群；采用酶标仪动力学法，分别测定氧化乐果和抗蚜威对敏感种群AChE的抑制曲线；根据测定的抑制曲线，计算氧化乐果和抗蚜威抑制该敏感种群90%AChE活性的浓度，即IC90，作为氧化乐果和抗蚜威AChE的诊断剂量。
所述室内敏感种群为田间采集桃蚜种群，室内单头饲养反选多代后获得。
更为具体地，上述确定氧化乐果和抗蚜威的诊断剂量的具体步骤包括：
（1）桃蚜室内敏感种群的饲养：桃蚜田间种群室内单头饲养反选多代，获得敏感种群。
（2）丙酮稀释抑制剂为不同的浓度梯度：所述抑制剂为氧化乐果和抗蚜威。
（3）缓冲液的配制：pH7.5，0.1M的磷酸缓冲液。
（4）底物ATChI的配制：母液浓度2.5mM，底物终浓度为0.5mM，保存于4℃冰箱中，备用。
（5）显色剂DTNB的配制：母液浓度37.5μM，显色剂终浓度为15μM，保存于4℃冰箱中，备用。
（6）酶液的制备：挑选120头无翅成蚜，加入2mL磷酸缓冲液，使用匀浆器冰浴匀浆，酶液10800g，4℃离心15min，之后将离心上清液稀释定容至24mL。
（7）96孔酶标板中加入50μL步骤（6）制备的酶液。
（8）将步骤（2）稀释好的各浓度抑制剂50μL、步骤（4）配置的底物ATChI50μL以及步骤（5）中的显色剂DTNB100μL混合均匀后加入到步骤（7）对应有酶液的孔中，轻轻混匀。
（9）将步骤（8）的酶标板405nm动力学测定15min，测定氧化乐果和抗蚜威对敏感种群AChE的抑制曲线。
（10）根据测定的抑制曲线，计算氧化乐果和抗蚜威对该敏感种群的IC90，作为氧化乐果和抗蚜威AChE的诊断剂量。
其中，步骤（2）中的抑制剂的稀释用含0.05%Triton的磷酸缓冲液，稀释至7～8个浓度梯度。
其中，步骤（4）和步骤（5）中底物和显色剂的配置均用步骤（3）制备的磷酸缓冲液配制。
其中，步骤（6）用于匀浆的匀浆器及缓冲液需提前冰浴5min。
其中，步骤（6）中制备酶液的缓冲液为步骤（3）制备的含0.05%Triton的pH7.5，0.1M的磷酸缓冲液。
其中，步骤（8）中最终反应体系中丙酮含量不超过0.5%。
本发明的有益效果在于：
本发明方法操作简单，使用酶标仪精细数据，所得数据更加真实可靠，用虫量少，弥补了传统生化方法用虫量大的问题，可在快速诊断桃蚜个体抗性水平的基础上有效区分敏感和抗性个体及种群。因此，利用本专利的诊断剂量，可快速精确区分敏感及抗性个体及种群。
附图说明
图1为加样后的96孔板。
图2为抗蚜威对敏感种群AChE抑制曲线。
图3为氧化乐果对敏感种群AChE抑制曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1诊断剂量的获得
1.研究对象
此专利的研究对象为实验室饲养反选多代的桃蚜敏感种群。
2.方法
供试药剂抗蚜威、氧化乐果，采用酶标仪动力学测定方法，得出抗蚜威和氧化乐果抑制曲线及对应诊断剂量（IC90）。
2.1供试桃蚜样本的采集及处理
挑选室内敏感品系无翅成蚜120头于1.5ml离心管中，液氮速冻后用于酶液的制备。
2.2反应试剂的配制
pH7.5，0.1M的磷酸缓冲液，2.5mM的底物ATChI，37.5μM的显色剂DTNB，其中底物和显色剂需保存于4℃的冰箱中。
2.3酶液的制备
用2.1中的桃蚜样本，加入2mL磷酸缓冲液，冰浴匀浆（其中匀浆器及缓冲液需预冷5min），酶液10800g，4℃离心15min，将离心上清液稀释定容至24mL。
2.4酶标仪动力学测定
将2.3制备的酶液加入96孔酶标板中，每孔50μL，对应加入事先混匀的50μLATChI+50μL抑制剂+100μL DTNB，抑制剂浓度为7-8个梯度浓度，反应总体系250μL。所述抑制剂为抗蚜威或氧化乐果。
其中，底物ATChI终浓度0.5mM，显色剂DTNB终浓度15μM，丙酮含量不超过0.5%。将加好样品的酶标板在405nm下，读数15min。
绘制抑制剂的抑制曲线。抗蚜威的抑制曲线如图2所示；氧化乐果的抑制曲线如图3所示。
2.5诊断剂量
根据2.4获得的抑制曲线，分别求出抗蚜威和氧化乐果对敏感品系的IC90，即诊断剂量，该诊断剂量可用于检测桃蚜田间种群个体AChE变异情况。
以抑制该种群AChE活性90%（IC90）抗蚜威和氧化乐果的浓度作为诊断剂量，氧化乐果的诊断剂量为180.43μM，抗蚜威的诊断剂量为18.85μM。以该诊断剂量检测桃蚜田间种群，AChE活性抑制率超过90%的个体为敏感个体,AChE活性抑制率低于90%的个体为抗性个体。在此基础上统计种群抗性个体百分率，从而了解被测种群抗性水平。
实施例2诊断剂量对桃蚜抗药性检测
具体操作：
1.供试桃蚜样本的采集及处理
挑选待测种群单头无翅成蚜于1.5ml离心管中，液氮速冻后用于酶液的制备，每个待测种群至少测定100头。
2.反应试剂的配制
pH7.5，0.1M的磷酸缓冲液，2.5mM的底物ATChI，37.5μM的显色剂DTNB，其中底物和显色剂需保存于4℃的冰箱中。
3.酶液的制备
用1中的桃蚜样本，加入200μl磷酸缓冲液，冰浴匀浆（其中匀浆器及缓冲液需预冷5min），酶液10800g，4℃离心15min。
4.酶标仪动力学测定
将3制备的酶液加入96孔酶标板中，每孔50μL，对应加入事先混匀的50μLATChI+50μL抑制剂+100μL DTNB，反应总体系250μL，其中对照中以缓冲液代替抑制剂。所述抑制剂为抗蚜威或氧化乐果。
其中，底物ATChI终浓度0.5mM，显色剂DTNB终浓度15μM，丙酮含量不超过0.5%。将加好样品的酶标板在405nm下，读数15min。
5.数据处理及统计分析
利用本发明内容获得的氧化乐果及抗蚜威的诊断剂量检测田间种群不同桃蚜个体AChE抑制率，实验结果如表1所示：
表1氧化乐果及抗蚜威的诊断剂量检测田间种群不同桃蚜个体AChE抑制率
以上实施例及数据结果显示，不同抗性水平的种群在实施例1确定的诊断剂量下，AChE抑制率超过90%的个体百分率与传统生物测定数据呈显著相关性，说明该诊断剂量有效可行。
现有技术测定乙酰胆碱酯酶活性一般采用分光光度计，对群体乙酰胆碱酯酶比活力进行测定，这种方法只能从群体水平大概了解乙酰胆碱酯酶的活性，且用虫量大，而本专利诊断剂量，可大范围的了解中群内个体抗性情况，进而了解种群的抗性水平。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种检测桃蚜抗药性的方法，在诊断剂量下采用酶标仪动力学法检测桃蚜田间种群个体对有机磷或氨基甲酸酯类杀虫药剂的抗药性，其特征在于，所述有机磷杀虫药剂为氧化乐果，氨基甲酸酯类杀虫药剂为抗蚜威；所述诊断剂量氧化乐果为180.43μM，抗蚜威为18.85μM；
所述氧化乐果和抗蚜威的诊断剂量的获得是通过选用室内选育的敏感种群；采用酶标仪动力学法，分别测定氧化乐果和抗蚜威对敏感种群乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制曲线；根据测定的抑制曲线，计算氧化乐果和抗蚜威抑制该敏感种群90％AChE活性的浓度，作为氧化乐果和抗蚜威AChE的诊断剂量；
所述室内敏感种群为田间采集桃蚜种群，室内单头饲养反选多代后获得；
所述氧化乐果和抗蚜威的诊断剂量是通过如下步骤确定的：
(1)桃蚜室内敏感种群的饲养：桃蚜田间种群室内单头饲养反选多代，获得敏感种群；
(2)用丙酮配置抑制剂母液，用0.05％Triton X-100磷酸盐缓冲液稀释抑制剂母液到不同的浓度梯度：所述抑制剂为氧化乐果和抗蚜威；
(3)缓冲液的配制：pH7.5，0.1M的磷酸缓冲液；
(4)底物ATChI的配制：母液浓度2.5mM，底物终浓度为0.5mM，保存于4℃冰箱中，备用；
(5)显色剂DTNB的配制：母液浓度37.5μM，显色剂终浓度为15μM，保存于4℃冰箱中，备用；
(6)酶液的制备：挑选120头无翅成蚜，加入2mL磷酸缓冲液，使用匀浆器冰浴匀浆，酶液10800g，4℃离心15min，之后将离心上清液稀释定容至24mL；
(7)96孔酶标板中加入50μL步骤(6)制备的酶液；
(8)将步骤(2)稀释好的各浓度抑制剂50μL、步骤(4)配置的底物ATChI 50μL以及步骤(5)中的显色剂DTNB 100μL混合均匀后加入到步骤(7)对应有酶液的孔中，轻轻混匀；
(9)将步骤(8)的酶标板405nm动力学测定15min，测定氧化乐果和抗蚜威对敏感种群AChE的抑制曲线；
(10)根据测定的抑制曲线，计算氧化乐果和抗蚜威对该敏感种群的IC90，作为氧化乐果和抗蚜威AChE的诊断剂量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的抑制剂的稀释用含Triton的磷酸缓冲液，稀释至7～8个浓度梯度。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)配制的缓冲液为含0.05％Triton的pH7.5，0.1M的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(5)中底物和显色剂的配置均用步骤(3)制备的不含Triton的磷酸缓冲液配制。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)用于匀浆的匀浆器及缓冲液需提前冰浴5min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(6)中制备酶液的缓冲液为步骤(3)制备的含0.05％Triton的pH7.5，0.1M的磷酸缓冲液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中最终反应体系中丙酮含量不超过0.5％。
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