CN103491956A - 病毒进入哺乳动物细胞的抑制剂 - Google Patents

病毒进入哺乳动物细胞的抑制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN103491956A
CN103491956A CN201180053724.7A CN201180053724A CN103491956A CN 103491956 A CN103491956 A CN 103491956A CN 201180053724 A CN201180053724 A CN 201180053724A CN 103491956 A CN103491956 A CN 103491956A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
amino
alkyl
influenza
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201180053724.7A
Other languages
English (en)
Inventor
A·巴苏
D·M·米尔斯
J·D·威廉姆斯
B·李
N·P·佩特
T·L·鲍林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mike Ao Tisi Co Of Surrounding And Kneel
Microbiotix Inc
Original Assignee
Mike Ao Tisi Co Of Surrounding And Kneel
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mike Ao Tisi Co Of Surrounding And Kneel filed Critical Mike Ao Tisi Co Of Surrounding And Kneel
Publication of CN103491956A publication Critical patent/CN103491956A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/30—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/37—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C311/38—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring having sulfur atoms of sulfonamide groups and amino groups bound to carbon atoms of six-membered rings of the same carbon skeleton
    • C07C311/44—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring having sulfur atoms of sulfonamide groups and amino groups bound to carbon atoms of six-membered rings of the same carbon skeleton having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及用于在哺乳动物中抑制病毒感染的化合物和方法的开发。开发了一种假型病毒，其用在用于鉴定防止病毒进入宿主细胞的非肽类小分子抑制剂的高通量测定法中。

Description

病毒进入哺乳动物细胞的抑制剂
相关申请的交叉引用
本申请所公开的主题要求了2010年9月13日提交的序列号为61/382,215的美国临时专利申请的权益，通过引用将其全部公开内容整体合并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本文所述的发明得到美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)编号为1R43A1072861-01A2的资助金的支持。因此，美国政府在本发明中具有某些权利。
发明领域
本发明涉及新的非肽类小分子的发现，所述非肽类小分子通过靶向于存在于病毒表面的蛋白质而作为病毒进入宿主细胞的抑制剂发挥作用。具体而言，本发明涉及特异性地靶向于血凝素(HA)包膜糖蛋白的抗H5N1进入抑制剂的发现(所述血凝素通过病毒与宿主细胞的受体结合和融合介导流感病毒进入)，并且涉及靶向于埃博拉病毒表面蛋白质并防止埃博拉病毒进入宿主细胞的抑制剂。
发明背景
病毒是目前地球上最丰富的寄生物，已经发现它们感染所有类型的细胞生命，包括动物、植物和细菌。然而，不同类型的病毒只能感染有限范围的宿主，而且许多病毒是物种特异性的。一些病毒如天花病毒例如只能感染一个物种—在该例子中是人，并且据说其具有窄的宿主范围。另一些病毒如狂犬病病毒能感染不同的哺乳动物物种，并且据说具有广泛的范围。感染植物的病毒对动物是无害的，并且大多数感染其它动物的病毒对人是无害的。由病毒引起的常见的人疾病的实例包括普通感冒、流感、水痘和感冒疮。许多严重的疾病如埃博拉病、AIDS、鸟流感和SARS是由病毒引起的。病毒导致疾病的相对能力用毒力描述。大流行是世界范围的大流行。例如1918年的流感大流行(例如其通常被称为西班牙流感(Spanish flu))是一种第5类的流感大流行，其是由异常严重并致命的甲型流感病毒所引起的。与大多数流感爆发主要侵袭青少年、老年或另外就是虚弱的患者不同，受害者常常是健康的年轻成年人。能引起广泛传播的大流行病的病毒的一些其它实例包括但不限于鸟流感病毒、埃博拉病毒和水泡性口炎病毒。
干扰病毒进入是一种新的有吸引力的控制病毒感染的治疗策略。这种方法的原理的证据来自于肽类HIV抑制剂恩夫韦肽。在确证进入抑制剂用于治疗病毒感染的治疗益处的同时，恩夫韦肽也突显出了肽类抗病毒药的潜在问题。大的七残基重复(heptad repeat)衍生的肽例如恩夫韦肽制备成本高，并且从胃肠道吸收差使得必须进行静脉内递送。
流感病毒
甲型鸟流感(avian influenza A)(H5N1)病毒的不断扩大的地理分布已经使更多的人处于感染风险，并且在人群体中没有对这些病毒的预先免疫已经增加了对新的流感大流行的担心。(Trampuz等人,Mayo Clin Proc.,79:523-530(2004))。此外，该病毒已经跨过了物种屏障，自1997年在亚洲和欧洲的某些地区引起了大量的人死亡。(Beigel等人,2005同前)。目前没有用于人类的对抗该病毒的有效疫苗。(Cox等人,Topley&Wilson'sMicrobiology and Microbial Infections,Collier L,Balows A,Sussman M.编辑,London,pp.634-698(2005);Kemble,G.和H.Greenberg,Vaccine,21:1789-1795(2003))。
正粘病毒科包括甲型、乙型和丙型流感病毒以及Thogotovirus和Isavirus(Cox等人,2005,同前;Lamb,R.A.,和R.M.Krug,Fields Virology,第四版,vol.1,pp.1487–1531,Knipe,D.M.,Howley,P.M.编辑,LippincottWilliams and Wilkins Publishers,Philadelphia(2001))。人的流感大流行是由甲型流感病毒引起的。甲型流感病毒含有8个单链负义病毒RNA(vRNAs)，其编码10-11种蛋白质。(Lamb,R.A.,2001,同前;Wright,P.F.和R.G.Webster,Fields Virology,第四版,vol.1,p.1533–1579,Knipe,D.M.,Howley,P.M.编辑,Lippincott Williams and Wilkins Publishers,Philadelphia(2001))。
甲型流感病毒含有两种表面糖蛋白—血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)(图1)。基于HA和NA蛋白的抗原性，已经鉴定了甲型流感病毒的16种不同的HA亚型(H1-H16)和9种不同的NA亚型(N1-N9)。这其中只有有限数量的病毒亚型在人中传播(即，H1-H3和N1、N2)。(Lamb,R.A.,2001,同前;Wright,P.F.,2001,同前)。
HA是主要的病毒抗原，介导受体结合和膜融合活动，而NA是一种破坏受体的酶，其从细胞表面释放病毒颗粒。(Lamb,R.A.,2001,同前;Wright,P.F.,2001,同前)。原型HA作为单一的多肽被合成，随后其被切割为HA1和HA2亚单位。HA切割是感染性所必需的，因为它产生HA2的疏水N端，其介导病毒包膜和细胞膜之间的融合。(Steinhauer,D.A.,Virology,258:1–20(1999);Skehel,J.J.和D.C.Wiley,Annu.Rev.Biochem.,69:531–569(2000);Lamb,R.A.,2001,同前;Wright,P.F.,2001,同前)。
在HA介导的进入过程中几个步骤是新的抗流感治疗的具有吸引力的靶标：
(a)HA对其唾液酸受体的附着：HA的受体结合位点是位于HA1的远端球状部分的每个亚单位上的袋结构域，在多价附着过程中与细胞表面唾液酸残基结合。形成袋结构域的残基(Y98、W153、H183、E190、L194)在所有流感亚型中高度保守。(Skehel,J.J.,2000,同前)。
因此，可开发通过与受体结合位点结合或经由一些其它机制防止其相互作用来阻断病毒与细胞的结合的抑制剂。集中高分子量的聚合物如多酚和木质素已被报道抑制病毒与细胞膜的结合。(Sakagami等人,Sieb.EtZucc.In Vivo,6:491–496(1992);Mochalova等人,Antiviral Research,23:179–190(1994);Sidwell等人,Chemotherapy,40:42–50(1994))。
(b)HA介导的病毒-细胞融合：通过受体介导的胞吞作用及随后的内体中的酸活化的膜融合，流感病毒进入其宿主细胞。内体中的低pH环境是引发HA从非融合构象向融合构象转变所必需的。这种构象改变将融合肽片段从HA2的氨基端重新定位到该分子的顶端。在这种构象改变之后，融合肽将病毒包膜与内体膜融合。抑制内体的H+-ATP酶(其阻断内体的酸化作用)强烈抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制。(Hernandez等人,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.,12:627-661(1996))。然而，内体H+-ATP酶活性不是病毒特异性靶标，干扰H+-ATP酶活性可导致不希望的毒副作用；
(c)融合三聚体发夹(trimer-of-hairpins)结构：I类融合蛋白可以设想三种不同的构象状态，(i)非融合天然结构，其中融合肽被埋在三聚体蛋白内；(ii)短暂的前发夹中间体，其中N端融合肽被延伸以穿透宿主细胞靶标膜；和(iii)融合三聚体发夹结构，其中C端和N端七残基重复肽(HR-C和HR-N)以六螺旋束构象联结，这对融合很关键。(Hernandez等人,1996,同前;Dutch等人,Biosci.Rep.,20:597-612(2000);Eckert,D.和Kim P.,Annu.Rev.Biochem.,70:777-810(2001))。融合三聚体发夹结构通过蛋白-蛋白相互作用被维持。在HR-N三聚体表面的C端，存在一条开放入腔内的深沟，从而形成被认为是小分子抑制剂的潜在结合位点的疏水的袋结构域。靶向于保守的受体结合域和融合三聚体发夹结构将减少产生耐药性的改变的可能性。
流感大流行
流感大流行是由“抗原性转变”引起的，所述“抗原性转变”即新的HA(或新的HA和NA)亚型被引入到人群体中。(Cox等人,Annu.Rev.Med.,51:407–421(2000))。缺乏与新的HA(或者HA和NA)亚型的在先接触产生了从未暴露于“抗原性转变”变体刺激的群体，从而导致了极高的感染率和世界范围的快速蔓延。在20世纪，已经出现了共计三次主要的大流行：1918/1919年的'西班牙流感'是记录在案的最具毁灭性的传染性疾病。估计全世界有2-5千万人死亡，在美国寿命预期减少了10年。(Johnson等人,Bull.Hist.Med.,76:105–115(2000))。'西班牙流感'的致病因子是H1N1甲型流感病毒，其可能已经被从鸟物种引入到了人群体中。(Gamblin等人,Science,303:1838–1842(2004);Reid等人,Nature Rev.Microbiol,2:909–914(2004);Stevens等人,Science,303:1866–1870(2004))。在1957年和1968年，'亚洲流感'和'香港流感'在美国分别致死了估计70,000人和33,800人。(Johnson等人,2002,同前)。这两次大流行流感病毒株也源自人和鸟病毒株的重配。(Scholtissek等人,Virology,87:13–20(1978);Kawaoka等人,J.Virol.,63:4603–4608(1989);Nakajima等人,Nature,274:334–339(1978))。
高致病性H5N1鸟流感病毒的爆发
尽管高致病性H5N1病毒尚未引起人类大流行病，但是它们向人类的持续传播和在人中的高死亡率已经使得针对这些病毒开发治疗方法称为了重点。高致病性H5N1鸟流感病毒第一次传播到人于1997年发生在香港，当时被感染的18个人中有6个人死于该感染。自2003年以来，高致病性H5N1鸟流感病毒已经在东南亚变得流行并且是该地区一些国家的家禽的地方病。(Fauci,A.S.,Cell,124:665-670(2006))。在亚洲、非洲和欧洲国家已经报道了超过4200次爆发，导致了>1亿家禽的死亡或屠杀。(Beigel等人,2005,同前)。在这些区域的农村地区，人与家禽之间的紧密接触有可能帮助了病毒向人类传播。在9个不同国家已经报道了236例人感染，其中138例死亡。(Beigel等人,2005,同前)。此外，H5N1的奥塞米韦(NA抑制剂)耐药性株的出现提示迫切需要新的治疗方法。(Le等人,2005,同前)。
大流行控制的选择
对抗人的H5N1鸟流感病毒或者任何出现的或重新出现的流感病毒的理想方式是抑制或者至少减少种间转移的可能性，这需要综合的、多面性的方法。目前，接种疫苗是已得到证明的预防流感感染的有效策略。然而，它的效力在大流行期间将受到限制，因为无法提前开发用于对抗新出现的病毒株的'大流行疫苗'。(Hayden,F.G.,2004,同前)。目前灭活的三价疫苗不提供对抗H5和H7鸟流感株的保护。(Cox等人,2005);Kemble,G.和H.Greenberg,2003)。此外，在此时，我们不能预测目前传播的H5N1是否将会是下一次大流行的病毒株。此外，由于在大流行期间需要在短期内对全世界巨大数量的个体进行免疫，疫苗生产能力将会紧张。因此，抗病毒药物是第一线的医学干预。
目前的抗流感药物奥塞米韦和扎那米韦在体外有效地阻断2004年H5N1病毒的NA活性，这提示了它们在流感化学疗法和预防H5N1病毒感染中的有效性。(Ward等人,2005,同前;Mase等人,Virology,332:167–176(2005);Gubareva等人,Lancet,355:827–835(2000))。然而，最近对这些化合物的耐药性突变体的分离已经突显了开发新的抗病毒药的迫切需要。(Le等人,2005,同前)。开发阻断HA的保守的受体结合位点或融合结构域的新的抗病毒药是一种有前景的方法，将对其它机理方法构成补充。
埃博拉病毒
埃博拉病毒引起急性的、致死的出血热，对其目前没有疫苗或治疗。埃博拉病毒GP是I型跨膜糖蛋白。不同埃博拉病毒株的GP的预测的氨基酸序列的比较显示了氨基酸在氨基端和羧基端区域的保守性以及在该蛋白的中间的高变区。(Feldmann等人,Virus Res.,24:1-19(1992))。埃博拉病毒的GP是高度糖基化的并且含有N-连接的和O-连接的碳水化合物，其提供该蛋白质高达50%的分子量。发现大多数糖基化位点在GP的中央可变区。
膜锚定糖蛋白是唯一已知在病毒体和被感染的细胞的表面的病毒蛋白，认为其负责病毒与宿主细胞的受体结合和融合。作为结果，埃博拉病毒糖蛋白可能是预防病毒进入宿主细胞的重要靶标。埃博拉病毒的预防性治疗的开发因为观察到埃博拉病毒糖蛋白以若干种形式存在而陷入困境。埃博拉病毒的跨膜糖蛋白是不寻常的，因为它由两个可读框编码。当2个阅读框通过转录或翻译编辑被连接时发生糖蛋白的表达。(Sanchez等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:3602-3607(1996);Volchkov等人,Virology,214:421-430,(1995))。未经编辑的GP mRNA产生一种非结构性分泌的糖蛋白(sGP)，其在感染过程中被较早大量合成。(Volchkov等人,1995,同前;Sanchez等人,1996,同前;Sanchez等人,J.Infect.Dis.179(suppl.1,S164,(1999)。编辑之后，病毒体相关的跨膜糖蛋白被蛋白水解加工成2个二硫键连接的产物。(Sanchez等人,J.Virol.,72:6442-6447(1998))。氨基端产物被称为GP1(140kDa)，羧基端的剪切产物被称为GP2(26kDa)。GP1和膜结合的GP共价结合形成在病毒体表面发现的GP刺突单体(Volchkov等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:5762(1998);Sanchez等人,J.Virol.,72:6442(1998))。GP1还以可溶形式从被感染的细胞中释放。(Volchkov等人,Virology,245:110(1998))。sGP和GP1的前295个N端氨基酸是相同的，而sGP剩余的69个C端氨基酸和GP1剩余的206个氨基酸是由不同的阅读框所编码的。就对抗埃博拉病毒和任何具有类似进入(即感染)宿主细胞机制的病毒的疫苗而言，开发防止病毒与宿主细胞的受体结合和融合的新的抗病毒药是有前景的方法。
水泡性口炎病毒(VSV)
水泡性口炎病毒(VSV)是非分段的负链RNA病毒，属于弹状病毒科水泡病毒属。VSV在马、牛、猪、绵羊和山羊中引起接触传染病，其以舌头、口腔粘膜和乳房上的泡状损伤为特征，通过节肢动物媒介传播。水泡性口炎的明显的临床表现是口腔内以及比较少见的在乳头和冠状带上发生囊泡和溃疡。死亡率通常很低，但生产受损，因为被侵袭的动物体重降低并且可能发生跛或乳腺炎。水泡性口炎最重要的担心在于，在牛和猪中临床上无法将它与口蹄疫和猪水泡病(swine vesicular disease)区分开。因此，水泡性口炎的爆发导致国际检疫的快速实施以及动物和动物产品贸易的关闭。
还有公共健康的担心，因为人可能被感染，Patterson,W.C.等人,J.Am.Vet.Med.Ass.,133,57(1958)，并且该病毒可以通过昆虫媒介传播，Ferris等人,J.Infect.Dis.,96,184(1955),Tesh等人,Science,175,1477(1972)。
VSV含有单负链核糖核酸(RNA)，其编码5条信使RNA(mRNA)，并且它的11kb的基因组具有五个基因，其编码病毒的五种结构蛋白：核壳蛋白(N)，化学计量的它在复制的RNA的壳体化中是必需的；磷蛋白(P)，其是RNA依赖型RNA聚合酶(L)的辅因子；基质蛋白(M)和附着糖蛋白(G)(例如，参见Gallione等人,1981J.Virol.,39:529-535;Rose和Gallione,1981,J.Virol.,39:519-528;美国专利No.6,033,886;美国专利No.6,168,943)。
水泡性口炎病毒的包膜蛋白G与宿主细胞表面结合，从而引发感染。病毒包膜蛋白参与病毒与宿主细胞的结合和/或感染性病毒进入宿主细胞。
干扰病毒进入是一种新的有吸引力的控制病毒感染的治疗策略。这种方法的原理的证据来自于肽类HIV抑制剂恩夫韦肽。在确证进入抑制剂用于治疗病毒感染的治疗益处的同时，恩夫韦肽也突显出了肽类抗病毒药的潜在问题。大的七残基重复衍生的肽例如恩夫韦肽制备成本高，并且从胃肠道吸收差使得必须进行静脉内递送。
发明概述
本发明涉及抑制病毒进入宿主细胞的非肽类小分子的开发。对于这些药物样分子，可设想多种施用途径，可以容易地实现高性价比的生产策略。这种方法的概念支持来自于先前鉴定的干扰副粘病毒进入的若干小分子。(Plemper等人,Antimicrob.Agents Chemother.,49:3755-3761(2005);Plemper等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101:5628-5633(2004);Cianci等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101:15046-15051(2004);Cianci等人,Antimicrob.Agents Chemother.,48:413-422(2004))。与HIV Gp120和副粘病毒的F蛋白一样，HA是I类融合蛋白。(Cianci等人,2004,同前)。I类融合蛋白经历一系列构象重排，导致C-和N-端七残基重复的联合。所形成的结构(一种稳定的六螺旋束)促进融合期间病毒和细胞包膜的对合。该最终的融合发夹结构由蛋白质-蛋白质相互作用维持。已经鉴定了副粘病毒进入的小分子抑制剂，其干扰最终的融合发夹结构的形成或巩固。(Plemper等人,2005,同前;Cianci等人,2004,同前)。因为在不同的I类融合蛋白(包括流感HA)中存在类似的结构，这些结果支持了靶向于HA作为药物发现策略的假设。
抗病毒药物将是大流行事件中的第一线医学干预。为了实现协同抗病毒作用以防止出现耐药株，需要组合使用具有不同抗病毒活性机制的多种药物。因此，迫切需要新的药物来对抗新的大流行。此外，抗病毒药物的全球市场估计约100亿美元/年(Datamonitor)，并且预计当可获得新的治疗方法时将快速增长。
因此，亟需抗病毒感染的广谱治疗方法来解决大流行(其是全球公共健康的主要威胁)问题。如本文所述，病毒感染抑制剂的发现和开发将为全世界提供拯救生命的治疗，并且证明在处理潜在的灾难性大流行中是无价的。如本文所述，干扰病毒进入是控制病毒感染的新的有吸引力的治疗策略，并且由于RNA包膜病毒进入宿主细胞的机制相似，认为类似的小分子抑制剂将有效防止许多这些类型的病毒进入宿主细胞。本发明的小分子抑制剂将有效防止其感染宿主细胞的病毒的实例包括但不限于流感病毒例如H5N1鸟流感病毒、埃博拉病毒、水泡性口炎病毒(VSV)和SARS。
因此，本发明涉及用于治疗或预防病毒感染的新的非肽类小分子抑制剂化合物和方法的发现，包括向需要其的个体(即哺乳动物)施用所述化合物。在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防、即抑制病毒进入宿主细胞的新的非肽类小分子抑制剂化合物和方法的发现，包括向需要其的个体(即哺乳动物)施用本文所述的抑制剂化合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及预防流感病毒进入哺乳动物宿主细胞的新的非肽类小分子抑制剂的发现。在一个特别优选的实施方案中，所述的新的非肽类小分子在人中抑制H5N1鸟流感病毒亚型进入，即感染。本文所述的抑制剂适合用于在哺乳动物、特别是人中治疗和/或预防H5N1鸟流感病毒。
在另一个优选的实施方案中，本发明预防埃博拉病毒进入哺乳动物宿主细胞、优选人宿主细胞的新的非肽类小分子抑制剂的发现。本文所述的抑制剂适合用于在哺乳动物、特别是人中治疗和/或预防埃博拉病毒感染。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及预防水泡性口炎病毒(VSV)进入哺乳动物宿主细胞、优选人宿主细胞的新的非肽类小分子抑制剂的发现。本文所述的抑制剂适合用于在哺乳动物、特别是人中治疗和/或预防水泡性口炎病毒感染。
本发明的病毒进入宿主细胞的非肽类小分子抑制剂是式I的化合物：
Figure BDA00003157078700091
其中：
Ar1和Ar2独立地是一价的芳基或杂芳基，其可以是未被取代的或被至多5个取代基取代，所述取代基选自卤素、氨基、脒基、胍基、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、酰胺基、磺酰氨基(sulfonamido)、疏基、烷基硫基、芳基硫基、异羟肟酸酯基(hydroxamate)、硫代酰基(thioacyl)、烷基磺酰基和氨基磺酰基，且
R1是一价的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其可以是未被取代的或另外被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、酰胺基、磺酰氨基、疏基、烷基硫基、芳基硫基、异羟肟酸酯基、硫代酰基、烷基磺酰基和氨基磺酰基，且
R2和R3独立地选自氢或烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基和酰基氨基，且
R4选自氢或一价的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基和杂环烷基；并且其中：
取代基R2和R3可以连接形成碳环或杂环，且
如果取代基R2和R3不同，对映体可以是(R)-或(S)-构型，或者外消旋化合物；
及其药物上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗或预防病毒进入宿主细胞、即病毒感染的方法，其包括施用式I的非肽类小分子抑制剂。在一个优选的实施方案中，本发明涉及通过施用式I的非肽类小分子抑制剂化合物治疗或预防流感病毒进入哺乳动物宿主细胞的方法。在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及通过施用式I的非肽类小分子抑制剂在人中治疗或预防鸟流感病毒H5N1亚型进入、即感染的方法。本文所述的方法适合用于在哺乳动物、特别是人中治疗和/或预防H5N1鸟流感病毒。
在另一个实施方案中，本发明涉及通过施用式I的非肽类小分子抑制剂化合物治疗或预防埃博拉病毒进入、即感染哺乳动物宿主细胞的方法。在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及通过施用式I的非肽类小分子抑制剂化合物在人中预防埃博拉病毒进入、即感染的方法。本文所述的方法适合用于在哺乳动物、特别是人中治疗和/或预防埃博拉病毒感染。
在又一个实施方案中，本发明涉及通过施用式I的非肽类小分子抑制剂化合物治疗或预防水泡性口炎病毒进入、即感染哺乳动物宿主细胞的方法。在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及通过施用式I的非肽类小分子抑制剂化合物在人中预防水泡性口炎病毒进入、即感染的方法。本文所述的方法适合用于在哺乳动物、特别是人中治疗和/或预防水泡性口炎病毒感染。
在一个优选的实施方案中，在需要预防H5N1鸟流感病毒进入人的情况下，本发明的抑制剂将靶向于介导病毒进入细胞的血凝素(HA)包膜糖蛋白，即对介导病毒进入细胞的血凝素(HA)包膜糖蛋白是特异性的。然而，应当理解的是，通过遵循本文所述的操作，可以鉴定针对任何流感病毒、病毒亚型或病毒靶标的非肽类小分子抑制剂。
为了鉴定防止H5N1病毒进入宿主细胞的抑制剂，开发了表达HA的假型病毒(H5亚型)作为模型模拟HA介导的活病毒进入细胞。该假型病毒提供了一种安全地复制病毒进入机制并鉴定其抑制剂的方法，然后所述抑制剂可以在严格调控的条件下进行抗活病毒感染测试，所述严格调控的条件在使用假型病毒进行的初步筛选中是不需要的。
因此，通过按照本文所述的操作，已经使用HIV/HA(H5)开发了筛选HA(H5)抑制剂的HTS检测。已经鉴定了36个HA(H5)特异性抑制剂，其IC90<25μM且CC50>25μM，并且所有36个化合物均抑制细胞培养物中生长的流感病毒(H1N1)(PR8)。
此外，已经鉴定了许多防止埃博拉病毒和水泡性口炎病毒进入宿主细胞的抑制剂。(参见图4)
本发明的一个优选的病毒进入抑制剂化合物具有图12中所示的结构。
在另一个实施方案中，本发明的抑制剂化合物被配制到药学上可接受的载体或赋形剂中，并通过注射应用，所述注射包括但不限于皮内注射、透皮注射、肌内注射、腹膜内注射和静脉内注射。根据本发明的另一个实施方案，所述抑制剂化合物的施用可以是通过口服施用，疫苗可以以例如片剂的形式被提供或者被包入明胶胶囊或微囊中，这使口服应用变得简便。这些施用形式的生产在技术专业人员的一般知识范围内。对于这些药物样分子可以设想多种施用途径，并且可以容易地实现高性价比的生产策略。
本文所给出的数据显示，所要求保护的磺酰胺化合物抑制流感病毒、埃博拉病毒和水泡性口炎病毒感染，提示式I的这类磺酰胺化合物将有效抑制一系列病毒的感染性、即宿主细胞进入，所述的一系列病毒包括但不限于RNA包膜病毒。RNA包膜病毒是类似的，类似之处在于它们都具有1型膜蛋白并且使用类似的机制进入宿主细胞，即通过受体介导的胞吞作用及随后的用于释放入细胞质的酸溶解来进入宿主细胞。不受任何特定理论的限制，认为本文所述的磺酰胺化合物有效地阻断了这种病毒感染性机制。
因此，本文所给出的证明式I的化合物预防H5N1鸟流感病毒、埃博拉病毒和水泡性口炎病毒进入宿主细胞的资料仅仅是本发明能抑制的病毒类型的代表，因此本领域技术人员应当认识到，本文所述的抑制剂化合物将适合用于预防许多其它类型的病毒进入宿主细胞，特别是利用上文针对RNA包膜病毒所述的进入机制的病毒，例如SARS病毒。
附图简要说明
图1是甲型流感病毒的示意图。
图2是高致病性鸟流感(HPAI)病毒和低致病性鸟流感(LPAI)病毒中HA前体分子的翻译后蛋白酶剪切位点的示意图。
图3显示了与对照相比的HIV/HA假型病毒在以下四种细胞系中的感染性(萤光素酶活性)：292T(人)、HeLa(人)、QT6(鹌鹑)和DF-1(鸡)细胞。所有四种被HIV/HA假型病毒感染的细胞系都显示出高水平的萤光素酶活性(其表示感染性)。
图4显示了神经氨酸酶(NA)处理(0-40单位/ml)对HIV/HA假型病毒在293T生产细胞(producer cell)中的感染性的作用。与对照相比，转染后26小时用NA(0-40单位/ml)处理的细胞显示出更高水平的感染性。
图5显示了在用或不用胰蛋白酶预处理的情况下HIV/HA和HIV/HA(USDA)假型病毒感染293T细胞的比较。当该假型病毒包括蛋白酶剪切位点时，用胰蛋白酶处理对HIV/HA进入没有任何作用。用胰蛋白酶预处理增强不具有天然蛋白酶剪切位点但其感染性需要酶处理的HIV/HA(USDA)的进入。
图6显示了阻断内体酸化作用的巴佛洛霉素A(0-150nM)和弱碱NH4Cl(0-25nM)对HIV/HA假型病毒在293T细胞上的感染性的作用。用巴佛洛霉素预处理293T细胞防止了HIV/HA感染细胞，这表明HIV/HA进入细胞依赖于低pH环境。
图7显示了巴佛洛霉素(0-200nM)处理对流感株A/WS/33在MDCK细胞上的感染性的作用。结果提示甲型流感病毒A/WS/33进入也依赖于低pH环境。
图8显示了多种靶细胞系对HIV/HA假型病毒感染的易感性。人肺细胞系A549和NCI/H661对HIV/HA感染高度易感。这两种细胞系被用于筛选防止流感病毒进入的小分子抑制剂的化合物库。
图9显示了HA对易感细胞的结合测定法的开发，以阐明HA/抑制剂相互作用的模式。图9A显示了与人IgG Fc融合以产生融合蛋白的H5N1HA1的四个不同区域。图9B显示了在SDS-PAGE上运行的并用考马斯蓝染色的一微克每种融合蛋白。图9C显示了用流式细胞术测量的融合蛋白(1μg-20μg)与293T细胞的结合。构建体#2和#3没有显示出良好的结合，但构建体#1和#4确实显示出了与293T细胞的良好结合。有趣的是，缺乏HA1的N端的17-88位残基的构建体#4比为全长HA1蛋白的构建体#1显示出了更好的与293T细胞的结合。图9D显示了融合蛋白与易感的293T和A549细胞以及抗性Jurkat(人T细胞系)细胞的结合。如所预计的那样，构建体#4显示出了与293T和A549细胞、而非Jurkat细胞的显著的结合。因此这些结果表明已经开发了一种敏感的HA结合测定法。
图10是生产HIV/HA假型病毒和用病毒感染细胞的方法的图解表示。
图11是将小分子化合物“命中(hits)”从用HIV/HA进行的初步筛选阶段推进到HA特异性流感抑制剂的工作流程图。
图12显示了分离的化合物2的结构，如实施例9所述，其作为初步SAR骨架被用于研究本发明鉴定的类似的小分子抑制剂化合物。
定义
术语“卤代”或“卤素”表示氟、氯、溴或碘。
“烷基”指饱和的和/或不饱和的碳原子和氢原子的直链或支链的一价或二价基团，如甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(Pr)、异丙基(iPr)、丁基(Bu)、异丁基(iBu)、仲丁基(sBu)、叔丁基(tBu)等，其可以是未被取代的或被一个或多个适合的本文提到的取代基取代。
“卤代烷基”指被一个或多个相同的或不同的卤素原子取代的烷基，例如-CH2Cl、-CF3、-CH2CF3、-CH2CCl3等。
“烯基”指具有2-8个碳原子和至少一个双键的直链、支链或环状烃基，例如乙烯基、3-丁烯-1-基、3-己烯-1-基、环戊-1-烯-3-基等，其可以是未被取代的或被一个或多个适合的本文提到的取代基取代。
“炔基”指具有2-8个碳原子和至少一个三键的直链或支链烃基，例如乙炔基、3-丁炔-1-基、2-丁炔-1-基、3-戊炔-1-基等，其可以是未被取代的或被一个或多个适合的本文提到的取代基取代。
“环烷基”指具有3-12个碳原子的非芳族的一价或二价的单环或多环基团，所述碳原子中的每一个可以是饱和的或不饱和的，例如环戊基、环己基、十氢化萘基等，其是未被取代的或被一个或多个适合的本文提到的取代基取代，并且其可以稠合有一个或多个芳基、杂芳基或杂环烷基(它们本身可以是未被取代的或被一个或多个适合的本文提到的取代基取代)。
“杂环烷基”指具有2-12个碳原子和1-5个选自氮、氧或硫的杂原子的非芳族的一价或二价的单环或多环基团，所述原子中的每一个可以是饱和的或不饱和的，例如吡咯烷基、四氢吡喃基、吗啉基、哌嗪基、环氧乙烷基等，其是未被取代的或被一个或多个适合的本文提到的取代基取代，并且其可以稠合有一个或多个芳基、杂芳基或杂环烷基(它们本身可以是未被取代的或被一个或多个适合的本文提到的取代基取代)。
“芳基”指包含6至18个碳环成员的芳族的一价或二价的单环或多环基团，例如苯基、联苯基、萘基、菲基等，其可以被一个或多个适合的本文提到的取代基取代，并且其可以稠合有一个或多个杂芳基或杂环烷基(它们本身可以是未被取代的或被一个或多个适合的本文提到的取代基取代)。
“杂芳基”指包含2至18个碳环成员和至少1个选自氮、氧或硫的杂原子的芳族的一价或二价的单环或多环基团，例如吡啶基、吡嗪基、哒嗪基(pyridizinyl)、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、三唑基、喹啉基、咪唑啉基、苯并咪唑啉基、吲哚基等，其可以是未被取代的或被一个或多个适合的本文提到的取代基取代，并且其可以稠合有一个或多个芳基、杂芳基或杂环烷基(它们本身可以是未被取代的或被一个或多个适合的本文提到的取代基取代)。
“羟基”表示基团–OH。
“烷氧基”表示基团–OR，其中R是烷基或环烷基。
“芳基氧基”表示基团–OAr，其中Ar是芳基。
“杂芳基氧基”表示基团–O(HAr)，其中HAr是杂芳基。
“酰基”表示基团–C(O)R，其中R是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环烷基，例如乙酰基、苯甲酰基等。
“羧基”指基团–C(O)OH。
“烷氧基羰基”指基团–C(O)OR，其中R是烷基、烯基、炔基或环烷基。
“芳基氧基羰基”指基团–C(O)OR，其中R是芳基或杂芳基。
“氨基”指基团–NH2。
“烷基氨基”指基团–NRR’，其中R和R’独立地是氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或杂芳基或杂环烷基。
“酰基氨基”指基团–NHC(O)R，其中R是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环烷基，例如乙酰基、苯甲酰基等，例如乙酰基氨基、苯甲酰基氨基等。
“酰胺基”指基团–C(O)NRR’，其中R和R’独立地是氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或杂芳基或杂环烷基。
“磺酰氨基”指基团–NHSO2R，其中R是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环烷基。
“脒基”指基团–C(NR)NR’R”，其中R、R’和R”独立地是氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或杂芳基，且其中R、R’和R”可以形成杂环烷基环，例如酰胺基、咪唑啉基、四氢嘧啶基。
“胍基”指基团–NHC(NR)NR’R”，其中R、R’和R”独立地是氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或杂芳基，并且其中R、R’和R”可以形成杂环烷基环。
“疏基”指基团–SH。
“烷基硫基”指基团–SR，其中R是烷基或环烷基。
“芳基硫基”表示基团–SAr，其中Ar是芳基。
“异羟肟酸酯基”指基团–C(O)NHOR，其中R是烷基或环烷基。
“硫代酰基”指基团–C(S)R，其中R是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环烷基。
“烷基磺酰基”指基团–SO2R，其中R是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环烷基。
“氨基磺酰基”指基团–SO2NRR’，其中R和R’独立地是氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或杂芳基或杂环烷基。
发明详述
本发明涉及病毒感染的新的非肽类小分子抑制剂的发现。更具体地，本发明涉及防止病毒进入、即感染宿主细胞的新的非肽类小分子抑制剂和方法的发现。
在一个实施方案中，本发明涉及防止流感病毒进入哺乳动物宿主细胞的新的非肽类小分子抑制剂的发现。在一个特别优选的实施方案中，所述的非肽类小分子在人中抑制H5N1鸟流感病毒亚型进入、即感染。本文所述的抑制剂适合用在通过施用本文所述的小分子抑制剂在哺乳动物中、特别是在人中治疗和/或预防H5N1鸟流感病毒的方法中。
在另一个实施方案中，本发明涉及预防埃博拉病毒进入哺乳动物宿主细胞、优选人宿主细胞的新的非肽类小分子抑制剂的发现。本文所述的抑制剂适合用在通过施用本文所公开的抑制剂在哺乳动物中、特别是在人中治疗和/或预防埃博拉病毒的方法中。
在另一个实施方案中，本发明涉及预防水泡性口炎病毒进入哺乳动物宿主细胞、优选人宿主细胞的新的非肽类小分子抑制剂的发现。本文所述的抑制剂适合用在通过施用本文所公开的抑制剂在哺乳动物中、特别是在人中治疗和/或预防水泡性口炎病毒的方法中。
鸟流感H5N1的潜在大流行是一个全球公共健康的担心。目前还没有可用于H5N1病毒的获得批准的人疫苗，迄今用灭活的H5N1疫苗进行的研究提示这些测试疫苗具有低的免疫原性。因此，耐药性H5N1株在人患者中的出现对新的抗H5N1(以及其它流感)治疗方法的开发敲响了警钟。(Le等人,2005,同前)。本文所述的开发新的抗流感治疗方法的策略是靶向于表面蛋白血凝素(HA)，其通过病毒与宿主细胞的受体结合和融合介导流感病毒进入。(Lamb,R.A.,2001,同前;Wright,P.F.,2001,同前)。
本发明描述了发挥抑制病毒进入宿主细胞功能的非肽类小分子的分离和鉴定。这种方法的概念支持来自于先前鉴定的若干个干扰RSV和MV进入的小分子。(Plemper等人,2005,同前;Plemper等人,2004,同前;Cianci等人,2004,同前;Cianci等人,Antimicrob.Agents Chemother.,48:413-422(2004))。HA是I类融合蛋白，该类包括HIV Gp120和副粘病毒的F蛋白(RSV和MV)。(Lamb,R.A.,2001,同前;Wright,P.F.,2001,同前;Cianci等人,2004,同前)。
I类融合蛋白经历一系列构象重排，导致稳定的六螺旋束融合结构，其通过蛋白质-蛋白质相互作用被维持(Cianci等人,2004,同前)。已经鉴定了RSV和MV的小分子进入抑制剂，其干扰最终的融合发夹结构的形成或巩固。(Plemper等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101:5628-33(2004);Cianci等人,2004,同前)。因为在其它I类融合蛋白(包括流感HA)中存在类似的结构，这些抑制剂的发现支持了靶向于HA作为药物发现策略的假设。
本发明提供了抑制病毒进入宿主细胞的特异性有机化合物。通过遵循本文所述的操作，发现了一系列具有磺酰胺骨架的化合物，其防止病毒进入、即感染宿主细胞。
本发明的化合物具有式I的结构：
Figure BDA00003157078700181
其中：
Ar1和Ar2独立地是一价的芳基或杂芳基，其可以是未被取代的或被至多5个取代基取代，所述取代基选自卤素、氨基、脒基、胍基、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、酰胺基、磺酰氨基、疏基、烷基硫基、芳基硫基、异羟肟酸酯基、硫代酰基、烷基磺酰基和氨基磺酰基，且
R1是一价的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其可以是未被取代的或另外被一个或多个取代基取代，所述取代基选自：环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、酰胺基、磺酰氨基、疏基、烷基硫基、芳基硫基、异羟肟酸酯基、硫代酰基、烷基磺酰基和氨基磺酰基，且
R2和R3独立地选自氢或烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基和酰基氨基，且
R4选自氢或一价的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基和杂环烷基；并且其中：
取代基R2和R3可以连接形成碳环或杂环，且
如果取代基R2和R3不同，对映体可以是(R)-或(S)-构型，或者外消旋化合物；
及其药物上可接受的盐。
优选开发口服有效的治疗物(片剂或液体)，因为在大流行的情况下这是最方便和快速的对大量接触群体施用的方法。然而，本文所述的抑制剂也适合用于静脉内施用，因为可以设想的是在自然爆发的情况下，被感染的患者可能需要静脉内施用。因此，本文所述的抑制剂为任何新出现的大流行病毒株提供了有效、安全和容易的治疗选择。
对于口服施用，药物组合物可以采取例如用药学上可接受的载体或赋形剂通过常规方法制备的片剂或胶囊剂的形式，所述的载体或赋形剂例如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域公知的方法包衣。用于口服施用的液体制剂可以采用例如溶液、糖浆或混悬剂的形式，或者它们可以是用于在使用前用水或其它适合的介质进行构建的干燥产品的形式。这类液体制剂可以用药学上可接受的添加剂通过常规方法制备，所述添加剂例如助悬剂(例如山梨醇糖浆、甲基纤维素或可食用的氢化脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性介质(例如杏仁油、油性酯或乙醇)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。
本文被描述为“包括”或“包含”一个或多个所给出的要素或步骤的组合物或方法是开放式的，意指所给出的要素或步骤是基本的，但在所述组合物或方法的范围内也可以加入其它要素或步骤。为了避免冗长，还应当理解的是，任何被描述为“包括”或“包含”(或者其“包括”或“包含”)一个或多个所给出的要素或步骤的组合物或方法也描述了相应的额外限定的“基本由相同的所给出的要素或步骤组成”的组合物或方法，意指所述组合物或方法包括所给出的基本要素或步骤，并且也可以包括不实质性影响所述组合物或方法的基础的和新的特性的另外的要素或步骤。还应当理解的是，本文被描述为“包括”或“包含”一个或多个所给出的要素或步骤或者被描述为“基本上由一个或多个所给出的要素或步骤组成”的任何组合物或方法也描述了相应的额外限定的闭合的“由所给出的要素或步骤组成”(或者“其由所给出的要素或步骤组成”)的组合物或方法，排除了任何其它未给出的要素或步骤。在任何本文所公开的组合物或方法中，任何所给出的基本要素或步骤的已知的或公开的等同物均可以替代该元素或步骤。还应当理解的是，“选自……”的要素或步骤是指在随后的列表中的要素或步骤中的一个或多个，包括任意两个或多个所列出的要素和步骤的组合。
其它术语的含义应当根据上下文按照本领域技术从业者所理解的那样进行理解，所述“本领域”包括有机化学、药理学和微生物学领域。
本发明涉及防止病毒进入宿主细胞的非肽类小分子抑制剂的发现。式I的磺酰胺化合物类有效地抑制一系列病毒的感染性、即进入宿主细胞，所述的一系列病毒包括但不限于RNA包膜病毒。RNA包膜病毒是类似的，类似之处在于它们都具有1型膜蛋白并使用类似的机制进入宿主细胞，即通过受体介导的胞吞作用及随后的用于释放入细胞质的酸溶解来进入宿主细胞。流感病毒、埃博拉病毒和水泡性口炎病毒是利用这种机制进入的RNA包膜病毒的代表性实例。不受任何特定理论的限制，认为本文所述的磺酰胺化合物有效地阻断了这种病毒感染性机制。因此，本领域技术人员应当理解的是，本文所述的式I的磺酰胺化合物将有效地抑制这类病毒(即RNA包膜病毒，其包括例如SARS病毒)对宿主细胞的感染性。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防流感病毒感染的非肽类小分子抑制剂和方法的发现。本文所述的抑制剂适合用于治疗和/或预防流感病毒。更特定地，本文所述的抑制剂适合用于在人中治疗和/或预防流感病毒。特定地，本发明涉及防止病毒进入宿主细胞的非肽类小分子(抑制剂)的鉴定和表征。甚至更特定地，本发明涉及用于预防鸟流感H5N1亚型进入宿主细胞的非肽类小分子抑制剂的鉴定。在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂靶向于介导病毒进入细胞的血凝素(HA)包膜糖蛋白，即对介导病毒进入细胞的血凝素(HA)包膜糖蛋白是特异性的。然而，应当理解的是，通过遵循本文所述的操作，不仅能鉴定用于任何流感病毒或流感病毒亚型的非肽类小分子抑制剂，还能鉴定用于其它病毒(例如，但不限于埃博拉病毒和水泡性口炎病毒)的非肽类小分子抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防埃博拉病毒感染的非肽类小分子抑制剂和方法的发现。本文所述的抑制剂适合用于在哺乳动物中治疗和/或预防埃博拉病毒感染。更特定地，本文所述的抑制剂适合用于在人中治疗和/或预防埃博拉病毒感染。特定地，本发明涉及防止埃博拉病毒进入宿主细胞的非肽类小分子(抑制剂)的鉴定和表征。然而，本领域技术人员应当理解的是，通过遵循本文所述的操作，能鉴定用于防止任何病毒或病毒亚型感染宿主的非肽类小分子抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及用治疗或预防水泡性口炎病毒(VSV)感染的非肽类小分子抑制剂和方法的发现。本文所述的抑制剂适合用于在哺乳动物中治疗和/或预防VSV感染。更特定地，本文所述的抑制剂适合用于在人中治疗和/或预防VSV感染。特定地，本发明涉及防止VSV进入宿主细胞的非肽类小分子(抑制剂)的鉴定和表征。然而，本领域技术人员应当理解的是，通过遵循本文所述的操作，能鉴定用于防止任何病毒或病毒亚型感染宿主的非肽类小分子抑制剂。
下文描述了用于鉴定防止鸟流感病毒H5N1进入宿主细胞的抑制剂化合物的假型病毒的构建。然而，本领域技术人员应当理解的是，下面所述的操作适合用于鉴定防止许多病毒(包括但不限于埃博拉病毒和水泡性口炎病毒)中的任何病毒进入宿主细胞的抑制剂化合物。
鸟流感病毒H5N1抑制剂的鉴定
为了鉴定防止H5N1病毒进入宿主细胞的抑制剂，开发了表达HA的假型病毒(H5亚型)作为模拟HA介导的活病毒进入细胞的模型。该假型病毒提供了一种安全地复制病毒进入机制行和鉴定其抑制剂的方法，然后所述抑制剂可以在严格调控的条件下进行抗活病毒感染测试，所述严格调控的条件在使用假型病毒进行的初步筛选中是不需要的。
为了构建假型病毒，将编码候鸟中高致病性H5N1流感病毒的HA基因的cDNA在CMV启动子的控制下克隆到pcDNA3哺乳动物表达载体中。为了产生表达HA的HIV源流感假型病毒(HIV/HA)，将含有萤光素酶报道基因(pNL4.3.Luc.R-E-)的HIV-1原病毒基因组与H5HA(pcDNA3-HA)一起共转染到293T细胞中。HIV/HA含有萤光素酶基因报道基因。一旦进入靶细胞后，病毒RNA被反转录，主动输入细胞核并稳定整合入基因组中。转染的细胞中的萤光素酶活性提供了病毒感染性的量度。(Basu等人,J.Virol.,81:3933-3941(2007);Manicassamy等人,J.Virol.,79:4793-4805(2005))。萤光素酶测定法高度灵敏，适合用于高通量筛选(HTS)96孔板模式。此外，非复制性HIV源流感假型病毒的使用使得HTS可行，且无需处理致病性鸟流感株所需要的严格的生物危害条件。这是HIV/HA用于开发HTS测定法来测量病毒附着和进入的关键优势。
本申请还解决了与本发明的小分子抑制剂的发现相关的几个重要参数的优化，包括：(a)HIV/HA的生成，(b)要使用的靶细胞，(c)HIV/HA的滴定，和(d)对最大化感染性和信号与背景(S/B)比值(>100/1)的控制。
在构建HIV/HA之后，按照标准的方案收集假型病毒并评估感染性。假型病毒的一个特别的优势是它提供了一种安全可靠地模拟“活”病毒进入宿主细胞的方法，同时消除了直接用活病毒工作的危险。最后在该早期筛选过程中鉴定的潜在抑制剂将被测试防止活病毒进入宿主细胞的能力，然而这些后面的测试将在严格的调控条件下进行，所述严格的调控条件是用假型病毒进行的工作所不需要的。因此，然后在增强的BSL3实验室中针对低致病性鸟H5N2分离物以及针对重组H5N1株评估来自假型病毒测定法的“初步命中”的抑制剂。该二级筛选将快速地仅鉴定出那些对抗感染病毒有活性的化合物。
与活感染病毒不同，用假型病毒进行初步筛选的另一个优势是，用活病毒工作将导致鉴定的不仅是那些抑制病毒进入的化合物，还有抑制病毒复制和流出的化合物。初步筛选用>100,000个抑制进入的化合物的化合物库进行，因此甚至初步命中的数量的小幅增加(这是由于存在复制和装配抑制剂造成的)可能导致需要对数千个化合物进行另外的二级测试。与此相反，本文所述的用假型病毒进行的初步筛选减少了初步命中的数量，因为它只鉴定H5流感病毒的推定的进入抑制剂。因此，用假型病毒进行的初步筛选的方法既减少了待处理的化合物的数量，又减少了需要进行的筛选。
另一方面，本发明涉及使用本文所述的假型病毒进行的用于快速筛选潜在的流感病毒小分子抑制剂的高通量系统(HTS)测定法。然而，本领域技术人员应当理解的是，本文所述的高通量测定法可以适应于鉴定防止病毒进入宿主细胞的抑制剂化合物，例如但不限于防止埃博拉病毒或水泡性口炎病毒进入宿主细胞的抑制剂化合物。因此，本文所述的测定法提供了一种有价值的用于鉴定病毒抑制性化合物的工具，所述病毒抑制性化合物具有在哺乳动物、特别是人中治疗或预防多种多样的病毒相关疾患的潜能。
本发明的一个目的是以通过与宿主细胞的受体结合和融合介导流感病毒进入的包膜糖蛋白血凝素(HA)为靶标。本申请的焦点是发现抗H5N1进入抑制剂和针对H5N1和其它潜在大流行流感病毒开发进入治疗剂。在多种亚型中HA显示出显著的变异(>30%)，但是用于受体附着和融合的重要结构域是保守的。(Fauci,A.S.,2006,同前;Lamb,R.A.,2001,同前;Wright,P.F.,2001,同前)。
因此，以这些保守的区域为靶标将减少发生耐药性的可能性。
在另一个实施方案中，本发明涉及可能没有明确定义的作用机制的广谱抗流感抑制剂的鉴定。可以设想这种类型的抑制剂将适合用于进一步测试潜在的流感病毒抑制剂，同时进一步阐述作用机制。
按照下文所述的操作，筛选了约40,000个离散的化合物并鉴定了141个初步命中。HTS的Z'因子是0.5±0.2。将初步命中用表达不相关的糖蛋白(VSV-G)的假型病毒和感染性H1N1病毒反筛选(counter-screened)它们的特异性。用再合成的化合物评价了它们的效力和细胞毒性。初步命中中只有36个特异性地抑制HA介导的进入过程。HTS的最终命中率是0.09%。所有36个命中化合物均显示出≤25μM的IC90值。在结构上，HA抑制剂可以被表示为各自具有≥2个成员的集合(clusters)和单物(singletons)。
因此，通过遵循本文所述的操作，已经使用HIV/HA(H5)开发了筛选HA(H5)抑制剂的HTS测定法。已经鉴定了36个HA(H5)特异性抑制剂，其IC90<25μM且CC50>25μM，且所有36个化合物都抑制细胞培养物中生长的流感病毒(H1N1)(PR8)。
本发明的一个优选的病毒进入抑制剂化合物具有图12中所示的结构。
实施例
实施例1.H5N1鸟流感进入的HIV/HA假型化系统的建立
本研究中所用的流感病毒HA。编码高致病性H5N1流感病毒的HA(H5)基因的cDNA由中国的中国科学院微生物研究所George Gao博士惠赠。该HA基因最初是从中国青海省死亡的候鸟(鹅)中存在的甲型流感H5N1病毒中分离的。
本文所述的HIV/HA假型病毒含有萤光素酶基因报道基因。一旦进入靶细胞，病毒RNA被反转录，主动输入细胞核并稳定地整合到基因组中。转染的细胞中的萤光素酶活性提供了病毒感染性的量度。(Basu等人,J.Virol.,81:3933-3941(2007);Manicassamy等人,2005,同前)。萤光素酶测定法是高度灵敏的并适合于96孔板模式。此外，非复制性HIV源流感假型病毒的使用使得HTS可行，并且不需要处理致病性鸟流感株所要求的严格的生物危害条件。两者都是HIV/HA用于开发测量病毒附着和进入的HTS测定法的关键优势。为了分离本文所述的小分子，对几个重要的参数进行了优化，包括：(a)HIV/HA的生成，(b)要使用的靶细胞，(c)HIV/HA的滴定，和(d)对最大化感染性和信号与背景(S/B)比值(>100/1)的控制。
pNL luc3R-E-和pNL luc3R+E-是基于HIV-1原病毒克隆pNL4-3的质粒。这些质粒不同于以前的版本，不同之处在于这两种质粒都含有Promega’s luc+基因—一种针对在哺乳动物和植物细胞中表达优化的第三代萤火虫萤光素酶基因。它们可通过在其各自的名字中于luc后面存在3而区别于以前版本的pNL luc质粒。
为了构建本文所述的假型病毒，含有萤光素酶报道基因的包膜缺陷的原病毒基因组pNL4.3.LucR-E-被用作HIV-I表达载体。(He等人,J.Virol.,69:6705–6711(1995))。在pNL4.3.Luc.R–E–载体中，萤火虫萤光素酶基因被插入到pNL4-3nef基因中。两个移码(5′Env和Vpr aa26)赋予该克隆Env–和Vpr–，从而使得它只能单轮复制。该载体从萨克生物研究学院(SalkInstitute)的Ned Landeau博士处获得许可。为了构建本文所述的假型病毒，编码HA基因的cDNA在CMV启动子的控制下被克隆到哺乳动物的表达载体pcDNA3(Invitrogen)。为了产生表达HA的HIV源流感假型病毒[HIV/HA]，如先前所述，将pNL4.3.Luc.R-E-与H5HA(pcDNA3-HA)共转染到293T细胞中。(Basu等人,J.Virol.,81:3933-3941(2007);Manicassamy等人,2005,同前;Cormier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101:14067-14072(2004))。于转染后48小时收集含有假型病毒的上清液，合并，用0.45μm孔径的过滤器过滤，并根据标准方案对感染性进行评价。(Basu等人,J.Virol.,81:3933-3941(2007);Hsu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:7271-7276(2003);“HIV-1萤光素酶报道基因病毒的生产和使用(Production and Use of HIV-1Luciferase Reporter viruses)”,EnnaWilliams M.编辑.Current Protocols in Pharmacology,12.5.1-12.5.12,JohnWiley&Sons(2004);Connor等人,Virology,206:935-944(1995))。
编码VSV-G(HIV/VSV-G)的质粒和空载体(empty vector)也与pNL4.3.Luc.R-E-共转染以产生对照的假型病毒。用市售的试剂盒(Beckman Coulter,CA)测量了假型病毒的p24含量，用于直接比较它们各自的感染性。用p24标准化的HIV/HA或对照病毒体感染293T(人)、HeLa(人)、QT6(鹌鹑)和DF-1(鸡)细胞，在激发后48小时测定了细胞的萤光素酶活性(图3)。如预期的那样，所有感染了VSV-G假型病毒HIV病毒体的四种细胞系都显示出高水平的萤光素酶活性(RLU的对数值为6.6至7.2)，而空载体感染的细胞显示出较低水平的萤光素酶活性(RLU的对数值为2.8至3.1)。被HIV/HA病毒体感染的细胞表达的萤光素酶活性高于背景约100倍，这提示所有这些细胞(无论是人来源，还是鸟来源)都能被HIV/HA病毒感染。
这些结果证明了一种研究H5N1感染的进入机制的功能性测定法。重要的是强调这种功能性测定法将大大缓解对用活H5N1病毒进行进入机制研究和进入抑制剂筛选的安全担忧。这种功能性测定法被用于鉴定防止流感病毒进入宿主细胞的潜在小分子抑制剂。
如下文所述，通过采用这种测定法，已经证明了人肺细胞系A549和NCI H661对HIV/HA转导高度易感，并且这些细胞将在鉴定防止HIV/HA进入这些宿主细胞的小分子抑制剂的HTS测定法中被用作靶细胞。此外，重要的是具有足够数量的靶细胞/孔，以便被感染的细胞给出良好的萤光素酶信号与背景噪声比值(>100/1)。
实施例2.生产细胞的神经氨酸酶(NA)处理增强假型病毒的感染性
为了优化HIV/HA假型病毒系统，使用神经氨酸酶(NA)处理293T生产细胞以增强基于HIV的假型病毒的感染性。293T细胞用pNL4.3.Luc+R-E-和HA质粒共转染。转染后(26h)，用浓度为0、5、10、20、40单位/ml的NA(New England Biolabs)处理被转染的293T细胞。将病毒上清液稀释5倍并用来激发靶细胞。在感染后48小时测定了被感染的细胞的萤光素酶活性，结果如图4所示。
结果表明，从用NA(5单位/ml NA)处理的细胞收集到的HIV/HA显示出比未经处理的细胞至少高10倍的萤光素酶活性。用更高浓度的NA(10-40单位/ml)处理生产细胞进一步增加靶细胞中的萤光素酶信号，但不是大幅度增加(对数值为5.62至5.73)。HIV/VSVG和空载体转染的假型病毒被用作对照。这些结果与NA处理易化病毒从生产细胞中释放是一致的。
此外，高的信号/背景比值表明成功建立了有效的HIV/HA假型病毒，在进一步HTS优化后其将广泛地用于计划的实验。
因此，通过使用lipofectamine2000按照标准方案用pcDNA3-HA(12μg)和pNL4.3.Luc.R-E-(12μg)共转染293T细胞(在100mm的皿中3×106个细胞，～70%汇合)生成了HIV/HA假型病毒(参见图10)。对于对照，通过按照相同的方案将携带VSV-G(pcDNA3-VSV-G)的质粒和pNL4.3.Luc.R–E–共转染到293T细胞中生成了HIV源VSV-G假型病毒(HIV/VSV-G)，以建立化合物的HA靶标特异性。HIV/HA或HIV/VSV-G假型病毒是复制缺陷的，并且所述假型病毒将只被评价一轮感染过程。由被转染的细胞的萤光素酶活性测量病毒感染性。从空pcDNA3载体和pNL4.3.Luc.R-E-转染的细胞的上清液感染的细胞的萤光素酶活性测定背景活性。
实施例3.HIV/HA假型病毒不需要胰蛋白酶处理
如之前所述，HA剪切是感染性所必需的，因为它产生HA2的疏水N端，其介导病毒包膜和细胞膜之间的融合。(Skehel等人,2000,同前;Steinhauer,D.A.,1999,同前;White等人,EMBO J.,1:217–222(1982);Luscher-Mattli M.,.Arch.Virol.,145:2233-2248(2000))。研究了胰蛋白酶处理对来源于H5N1的HIV/HA的感染性的作用。为了比较，生成了另一种表达低致病性鸟H5N2分离物的HA的HIV/HA假型病毒(CK/Michoacan/28159-530/95)。该病毒株的HA没有可以被任何遍在蛋白酶所剪切的剪切位点，并且其剪切需要TPCK-处理的胰蛋白酶处理。它由David L.Suarez博士(USDA)惠赠。
该低致病性鸟分离物的HIV/HA被指定为HIV/HA(USDA)以将其区别于实验的HIV/HA。将HIV/HA或HIV/HA(USDA)假型病毒于37°C用胰蛋白酶(50μg/ml)处理30分钟或不进行胰蛋白酶处理，然后激发293T靶细胞。胰蛋白酶处理不增强(或抑制)HIV/HA介导的病毒进入(图5)。与此相反，与不进行胰蛋白酶处理的相比，胰蛋白酶处理的HIV/HA(USDA)的感染性被大大增强。
实施例4.低致病性实验室甲型流感病毒[A/WS/33]的感染性需要胰蛋白酶 处理
甲型流感病毒实验室株A/WS/33(H1N1)[ATCC#VR-1520]是从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)获得的。将病毒储备液(virus stocks)在MDCK细胞上生长并滴定。将80%汇合的MDCK细胞用该病毒感染，使其于37°C吸收3小时，每15分钟震荡一次以保持孔被覆盖。孵育后，将细胞洗涤并用添加了0.125% BSA、10 mM HEPES (pH7.4)的EMEM在存在或不存在1μg/ml TPCK处理的胰蛋白酶的情况下孵育。为了确定胰蛋白酶处理对甲型流感病毒[A/WS/33]感染性的作用，将MDCK细胞用胰蛋白酶处理的和未经胰蛋白酶处理的甲型流感病毒株A/WS/33以为1的MOI感染。如表1所示，与TPCK-胰蛋白酶处理的病毒相比，未经处理的甲型流感病毒的感染性被显著抑制。这些结果与HIV/HA(USDA)假型病毒结果是一致的。这进一步提示了在HIV/HA(USDA)假型病毒和低致病性实验室株二者中均表达的HA行为类似，并且验证了本文所述的假型病毒模型。
表1.胰蛋白酶处理的作用
Figure BDA00003157078700271
进行了三个独立的实验以确定病毒滴度
实施例5.HIV/HA假型病毒在进入期间对向溶酶体(lysosomotropic)化合物 敏感
为了测试HA介导的病毒进入的pH依赖性，在巴佛洛霉素A和氯化铵(NH4Cl)存在下用预先确定滴度的HIV/HA感染293T细胞。巴佛洛霉素A是内体H+-ATP酶的高选择性抑制剂，其阻断内体酸化作用，从而升高内体的pH。(Marsh等人,Adv.Virus Res.,36:107–151(1989);Bowman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:7972–7976(1988);Yoshimori等人,J.Biol.Chem.,266:17707–17712(1991);
Figure BDA00003157078700281
等人,Biochemistry,32:3902–3906(1993))。同样地，NH4Cl是一种弱碱，升高内体的pH。(Marsh,M.1989,同前)。如图6的A组所示，用50-150nM的巴佛洛霉素A处理293T细胞有效地抑制HIV/HA假型病毒的感染性。类似地，与未经处理的对照相比，在病毒吸收的前3小时期间将细胞与NH4Cl[5-25mM]接触显著地减少病毒感染(图6,B组)。因此，结果提示了HIV/HA进入依赖于低pH诱导的HA改变。
实施例6.巴佛洛霉素A抑制甲型流感病毒[A/WS/33]感染
研究了巴佛洛霉素A对甲型流感病毒感染性的作用。将MDCK细胞(在6孔板中～80%汇合)用连续稀释剂量的巴佛洛霉素A(25-200nM)处理15分钟。将甲型流感病毒(～100pfu/孔)加入到细胞中并于37°C吸收3小时。在3小时的吸收期间巴佛洛霉素A也存在。孵育后，通过洗涤除去未被吸收的病毒，将细胞用含有EMEM(补充有4%的牛血清白蛋白和1μg/ml的TPCK处理的胰蛋白酶)的0.8%琼脂糖覆盖，于37°C孵育3天。进行三次独立的实验以测定病毒滴度。
如图7所示，巴佛洛霉素A在测试的浓度(25-200nM)下有效地抑制流感病毒感染的感染性。因此，该结果提示，甲型流感病毒A/WS/33进入也依赖于低pH诱导的HA改变，并且验证了本文所述的HIV/HA假型病毒模型。
实施例7.人肺细胞显示出对HIV/HA假型病毒最大的感染性
为了表征和比较趋向性，按照之前描述的方法通过噬菌斑检测法用一组靶细胞系评价了HIV/HA的感染性。将人肺细胞系(A549、NCI-H661和HAPEC)和大鼠肺细胞系(L2)用作感染的靶细胞。还使用了对流感病毒感染具有抗性的Lec1(中国仓鼠卵巢)细胞系。按照之前描述的方案将细胞用HIV/HA和HIV/HA(USDA)假型病毒感染。HIV/VSVG和空载体转染的假型病毒被分别用作阳性和阴性对照。与人肺细胞系HAPEC相比，人肺细胞系A549和NCI-H661对HIV/HA假型病毒的感染高度易感(图8)。用胰蛋白酶处理的HIV/HA(USDA)假型病毒也对这些细胞非常具有感染性。然而，未经处理的HIV/HA(USDA)假型病毒是没有感染性的(数据未示出)。大鼠肺细胞(L2)对HIV/HA和HIV/HA(USDA)的感染都不是非常易感，而Lec1细胞对两种假型病毒都具有高度抗性(图8)。这些结果提示HIV/HA和HIV/HA(USDA)对人肺细胞显示出优选的进入趋向性。人肺细胞系A549和NCI-H661在进一步优化后将被用于筛选流感进入抑制剂的化合物库。
这些结果提示，HIV/HA假型病毒的HA保留了感染性流感病毒中存在的HA的功能性性质。
实施例8.HA对易感细胞的结合测定法的开发
开发了HA结合测定法用于阐明HA/抑制剂相互作用的模式。H5N1HA1的四个不同区域(在图9A中标记为#1-4)与人IgG Fc融合，从而产生融合蛋白。所有构建体都通过DNA测序确证。按照Kuhn等人,J.Biol.Chem.,281:15951-15958(2006)的方案(进行了一些调整)将这些融合蛋白进行了表达和纯化。转染后给细胞再加入添加了4mM L-谷氨酰胺的VP-SFM培养基达16小时。在48小时和72小时收集上清液两次，用0.45μM滤膜过滤。将每个上清液应用到装在柱(Pierce)中的蛋白A琼脂糖(SantaCruz Biotech)上。将蛋白A琼脂糖用PBS洗涤两次，通过离心用1ml0.1M的甘氨酸(pH2.8)洗脱蛋白质三次。洗脱后通过加入60μl Tris.HCl(pH8.0)立即中和蛋白质。然后将蛋白质在PBS中通过Slide-A-Lyzer透析盒(Pierce)透析，并用Centricon Centrifugal Filter Units(Millipore)浓缩。将一微克的每种纯化的蛋白质在SDS-PAGE上运行，随后用考马斯亮蓝染色(图9B)。取决于构建体，可通过合并来自100mm板的上清液纯化0.1-1mg融合蛋白，其适合用于下文所述的结合测定法。
如Kuhn等人(2006,同前)所述使用流式细胞术测量了这些蛋白质与细胞的结合。简言之，用PBS/5mM EDTA剥离293T细胞，重新混悬于PBS/1%BSA中并在冰上保持30分钟。将不同量的HA-hIgG蛋白质(1至20μg)与0.5×106个细胞一起在冰上孵育1小时，随后用PBS/1%BSA洗涤两次。将与FITC轭合的抗人IgG抗体以1:100的稀释度与细胞一起在冰上孵育45分钟。将细胞用PBS/1%BSA洗涤三次并用PBS洗涤两次，然后进行流式细胞术。将阴性对照(没有加入HA-hIgG蛋白)的平均荧光强度(MFI)从HA#1至HA#4的MFI中减去(图9C)。显然，构建体#2和#3在这些条件下没有显示出与293T细胞有许多结合。与此相反，构建体#1和#4显示出与靶细胞的剂量依赖性结合。令人感兴趣的是，构建体#4具有删除的HA1的N末端(残基17-88)，但它比全长的HA1融合蛋白(#1)与靶细胞具有更好的结合。
为了进一步表征这些融合蛋白的细胞结合性质，在测定法中使用了两种易感的细胞系和一种有抗性的细胞系。人肺细胞系293T和A549都已被证明是高度易感的，而人T细胞系Jurkat对HIV/HA感染是具有抗性的。使用2μg的每种融合蛋白。在这些条件下，只有构建体#4显示出与易感细胞的显著的结合，而剩余的三种融合蛋白没有表现出许多结合。重要的是，这些融合蛋白中没有一个显示出与Jurkat细胞有许多结合(图9D)，这与上文所述的转导数据是一致的。这些实验表明，这些融合蛋白中的一种(构建体#4)甚至在2μg下也能特异性地与易感细胞结合。这证明了一种敏感的HA结合测定法的建立，其将被用在随后的实验中。
基于以上实施例，有可能筛选结构上多样化的化合物库以鉴定防止流感病毒进入宿主细胞的小分子抑制剂，并使用二级测定法把这些命中化学物质区分优先次序。如上所述，开发了鉴定在病毒进入期间靶向于流感HA的抑制剂的HTS测定法。通过使用该测定法，可从中到高通量测定条件(>1000个化合物/天)进行筛选，并且容易读取(萤光素酶/GFP报道基因)，具有高的信号/背景比值(>10/1)。
1.使用“低致病性”H5流感病毒评价HA抑制剂。用活的感染性流感H5N1病毒进行的实验所要求的严格的生物防护措施将限制能针对“活的”H5N1病毒被评价的“命中”的数量。因此，“命中”将针对表达HA的H5亚型的低致病性鸟甲型流感病毒株CK/Michoacan/28159-530/95(USDA株)以盲筛模式(a blind fashion)被筛选(来自上文)(Liu等人,Science,309:1206(2005))，并且它们的效力将在细胞培养物中针对活的感染性病毒被评价。该病毒株是从David L.Suarez博士(USDA)处获得的，并且不像野生型H5N1病毒那样需要所述严格的生物防护。USDA株的H5HA与野生型H5N1的H5HA之间唯一的区别是缺失可以被任何遍在蛋白酶剪切的规范的弗林蛋白酶剪切位点(RRRKKR)。(Liu等人,Science,309:1206(2005))。大量的报道已经表明，H5HA蛋白的这种多碱基剪切肽是H5病毒的高致病性所必需的。(Steinhauer,D.A.,1999,同前;Garten,W.,1999,同前);Horimoto,T.,1997,同前;Stieneke-Grober等人,EMBO J.,11:2407–2414(1992);Horimoto等人,1994,同前)。因为未预期我们的“命中”会影响HA剪切(这是由于依赖于具有已经剪切的HA的假型病毒的筛选策略造成的)，所以预计抑制高致病性H5N1病毒的“命中”还将抑制USDA株。对这种低致病性USDA株具有最好的抑制活性的“命中”将进一步用野生型H5N1评价。该最终评价是必要的，因为野生型H5N1病毒比低致病性流感病毒更具攻击性。
甲型流感病毒株CK/Michoacan/28159-530/95将生长在10日龄的能生育的母鸡的鸡蛋的尿囊腔中。简言之，将病毒注射入尿囊腔并于37°C孵育28-42小时。将上清液分成小的等分试样，快速冷冻并于–80°C储存备用。每个等分试样仅在使用前被解冻一次。为了测定病毒滴度，将连续稀释的病毒混悬液在6孔板中接种到汇合的MDCK单层细胞培养物中并于37°C孵育2小时。将细胞洗涤并用含有0.6%琼脂糖和2μg/ml乙酰化的胰蛋白酶的DMEM覆盖，于37°C孵育2天。用吉姆萨染色使噬菌斑可视。(Anders等人,J.Gen.Virol.,75:615-622(1994))。
流感病毒感染性的抑制。将病毒与连续稀释的“命中”一起于37°C预孵育(1小时)，以为0.1的MOI加入到在96孔微量滴定板中的MDCK细胞(2×105细胞/ml)中，总体积为0.1ml。未经处理的病毒将被用作阳性对照。于37°C孵育2小时后，通过洗涤除去未吸收的病毒，将含有2μg/ml胰蛋白酶的新鲜培养基加入到细胞中并于37°C孵育2天。通过用未感染的蛋的尿囊液感染细胞来确定每个板的背景。作为比较物，使用已知的流感抑制剂巴佛洛霉素A1、金刚烷胺和司他弗林(stachyflin)。(Yoshimoto等人,Arch.Virol.,144:865-878(1999))。孵育后，收获培养物上清液并测量培养物上清液的乳酸脱氢酶(LDH)活性。LDH是一种在糖原酵解过程中将乳酸转变成丙酮酸的氧化酶。LDH广泛地存在于细胞膜和细胞质中，在细胞损伤后立即从细胞中释放到培养物上清液中。(Decker,T.和M.L.Lohmann-Matthes,J.Immunol.Meth.115:61–69(1988))。因此细胞外LDH的定量将提供病毒感染性的量度。上清液的LDH活性将根据生产商的说明书用
Figure BDA00003157078700321
非放射性细胞毒性测定试剂盒(PromegaCorporation,USA)测量。流感病毒感染的抑制百分比将被计算为(%抑制)=100-[{(ODT)V-(ODC)M}/{(ODC)V-(ODC)M}]Χ100。(ODT)V是在存在抑制剂的情况下病毒感染的培养物上清液的吸光度(LDH活性)，(ODC)V是在不存在抑制剂的情况下病毒感染的培养物上清液的吸光度(阳性对照)，(ODC)M是用未感染的蛋的尿囊液感染的细胞的吸光度(阴性对照/背景)。显示出IC50<10μM的抑制剂从储备板(stock plate)中被挑选出来并进一步通过噬菌斑测定法进行确证。抑制百分比被计算为=100x[化合物存在下的噬菌斑数量/阳性对照(没有任何抑制剂)的噬菌斑数量]。显示出阳性结果(IC50<10μM)的化合物[“二级命中”]将如下文所述进一步针对重组H5N1株进行检查。
组织培养物中“活的”H5N1病毒的抑制。“二级命中”的抗H5N1流感活性将在增强的BSL3防护设施中针对重组大流行H5N1流感病毒进行证实。具有来自高致病性H5N1越南株(A/Vietnam/1203/2004)的HA的重组病毒使用Fodor等人,J.Virol.,73:9679-9682(1999)的反向遗传学系统并按照Basler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98:2746-2751(2001)的方法生成。选择目前传播的致病性H5N1越南株(A/Vietnam/1203/2004)是因为它具有提示新的大流行病毒株的特征。这些“命中”对H5N1株的抑制活性通过使用MDCK细胞的噬菌斑测定法被证实。抑制百分比将被计算为=100x[化合物存在下的噬菌斑数量/阳性对照(没有任何抑制剂)的噬菌斑数量]。
图11显示了将小分子化合物“命中”从用HIV/HA进行的初步筛选阶段推进到适合在人和其它哺乳动物中用作疫苗的HA特异性流感抑制剂的工作流程图。
实施例9.鉴定流感病毒的小分子抑制剂的化合物库的初步筛选
如上文所述，假型病毒是根据供应商的方案用Lipofectamine2000(Invitrogen)在10cm的板中通过将12μg含有适宜的病毒包膜糖蛋白的构建体与12μg pNL4-3-Luc-R--E-HIV载体共转染到293T细胞(90%汇合)产生的。根据标准的方案在存在1μg/ml甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)处理的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)的情况下将细胞培养物中生长的流感H1N1(PR8)病毒于37°C历经3天在MDCK细胞中繁殖和滴定。(Centersfor Disease Control and Prevension,2004,同前。
筛选的化学物质库代表了广泛并非常均衡采集的超过152,500个化合物。它们是从Chembridge(San Diego,CA)和Timtec(Newark,DE)购买的，于96孔主板(96-well master plates)中以2.5mM稀释在二甲亚砜(DMSO)中，并于-20°C储存。在200-500Da的分子量范围内选择了化合物。它们具有有利的cLogP值(计算的正辛醇/水分配系数的对数)，并包含超过200种化学型。
使用假型病毒的组合化学物质库的高通量筛选是在96孔板中进行的。在存在25μM(终浓度)测试化合物的情况下将低传代的A549细胞单层用100μl含有8μg/ml1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物的假型病毒感染。5小时后，除去接种物，加入新鲜的培养基并于37°C和5%CO2下将板孵育72小时。在Wallac EnVision2102Multilabel Reader(PerkinElmer,MA)中使用Britelite PlusTM检测系统(Perkin Elmer)对感染进行定量。抑制百分比被计算为：100x[化合物存在下的相对萤光素酶单位(RLU)-阴性对照的RLU/阳性对照(没有任何抑制剂)的RLU-阴性对照的RLU]。
根据生产商的方案使用AlphaScreen SureFire GAPDH检测试剂盒(Perkin Elmer)通过测量细胞裂解液中内源性细胞GAPDH来检测细胞存活力。
结果
筛选了约40,000个离散的化合物，鉴定了141个初级命中。HTS的Z'因子是0.5±0.2。将初级命中用表达无关糖蛋白(VSV-G)的假型病毒和感染性H1N1病毒反筛选它们的特异性。用再合成的化合物评价了它们的效力和细胞毒性。初级命中中只有36个特异性地抑制HA介导的进入过程。HTS的最终命中率是0.09%。所有36个命中化合物均显示出≤25μM的IC90值。在结构上，HA抑制剂可以被表示为各自具有≥2个成员的集合和单物。
本文所鉴定的HA抑制剂包括化学上相关的结构的多个集合以及单物。在五个所观察到的“命中”(参见表2)中，一个化合物、特别是具有磺酰胺骨架的化合物2被证明IC90为3.9μM，基于该结果对一组磺酰胺类似物进行了进一步的构效关系(SAR)研究(参见表3)。
表2--流感HA(H5)命中的特异性
Figure BDA00003157078700341
表3--磺酰胺类似物抗流感抑制剂的SAR
Figure BDA00003157078700351
针对表3所示的骨架所研究的另外的取代基包括在R1的乙氧基取代基(2-乙氧基、4-乙氧基)、在R2的卤素取代基(F、Cl、Br)和用来代替R3-取代的苯基与胺的氮之间的直接键的柔性连接基，例如–CH2CH2O–(也就是，
上文所鉴定的化合物是作为用于预防和治疗流感感染的抗病毒剂开发的候选物。所述化合物也可作为分子探针用于研究流感病毒进入宿主细胞。
表4--另外的确证的病毒进入抑制剂
Figure BDA00003157078700361
实施例10.合成流程
流程1氨基乙酰胺磺酰胺病毒抑制剂化合物的合成
Figure BDA00003157078700391
氨基乙酰胺磺酰胺是从两个被取代的苯胺(其可以相同或不同)、磺酰氯和溴乙酰溴开始用一种会聚式的三步方法合成的。一个苯胺在碱水溶液存在下被溴乙酰氯酰化，形成溴乙酰苯胺(bromoacetanlilde)，而另一个苯胺被磺酰氯磺酰化，形成磺酰胺。将磺酰胺用弱碱去质子化，用所得到的阴离子置换溴乙酰苯胺的溴取代基，形成目标化合物。
目标化合物的变化通常在起始的苯胺水平实现。取代基R和R’在起始的苯胺中出现并在整个合成过程中保持。取代基R”在起始的磺酰氯中出现，也在整个合成过程中保持。
流程2合成氨基乙酰胺磺酰胺的代表性操作
N-(联苯-2-基)-2-溴乙酰胺
向于10°C的2-氨基联苯(10g,59mmol)在乙醚(60mL)中的溶液中加入1.0MNaOH水溶液(32mL,32mmol)。历经15分钟加入溴乙酰溴(11.93g,59mmol)在乙醚(30mL)中的溶液。除去冷却浴，将反应混合物搅拌另外15分钟。将混合物分离，用乙醚(100mL)洗涤水层。将合并的有机提取物用水(2×50mL)和盐水(50mL)洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤并蒸发至原始体积的四分之一。将所得的固体通过过滤收集并于高真空下干燥，得到6.5g(37%)所需产物，为白色结晶性固体：1H-NMR(CDCl3)δ8.32(d,2H),7.53-7.36(m,6H),7.27-7.22(m,2H)。
Figure BDA00003157078700401
I.N-(4-氯苯基)-4-甲氧基苯磺酰胺
历经10分钟向于0°C的4-甲氧基苯磺酰氯(5.0g,24mmol)和4-氯苯胺(3.1g,24mmol)在二氯甲烷(24mL)中的溶液中加入三乙胺(3.4mL,24mmol)。除去冰浴，将混合物搅拌16小时。将混合物用二氯甲烷(100mL)稀释，将合并的溶液用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机溶液用MgSO4干燥，过滤并蒸发，将粗产物用硅胶色谱法(15-60%EtOAc/Hex)纯化。将含有产物的级分合并、蒸发并在高真空下干燥，得到4.9g(69%)产物，为褐色的油：1H-NMR(CDCl3)δ10.17(s,1H),7.71(d,2H),7.61(d,2H),7.04(d,2H),6.96(d,2H),2.19(s,3H)。
II.N-(联苯-2-基)-2-(N-(4-氯苯基)-4-甲氧基苯基磺酰氨基)乙酰胺
向N-(联苯-2-基)-2-溴乙酰胺(150mg,0.52mmol)和N-(4-氯苯基)-4-甲氧基苯磺酰胺(154mg,0.52mmol)在DMF(1.5mL)中的混合物中加入K2CO3(180mg,1.3mmol)。将所形成的混悬液加热至60°C达45分钟。将反应混合物倒入水(30mL)中，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(1×50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，用硅胶色谱法(15-40%EtOAc/Hex)纯化。将含有产物的级分合并并蒸发，得到175mg(66%)产物，为白色微晶固体：mp100-104°C,Rf0.17(25%EtOAc/Hex);1H-NMR(CDCl3)δ8.78(s,1H),8.49(d,1H),7.72-7.67(dd,2H),7.63-7.60(m,1H),7.50(d,2H),7.42(d,2H),7.36-7.29(t,2H),7.21-7.18(m,2H),7.09-7.04(t,1H),6.94-6.91(dd,2H),6.43(s,1H),6.28(d,1H),4.10(s,2H),3.87(s,3H)。
Figure BDA00003157078700411
III.N-(4-甲苯酰基)-4-甲氧基苯磺酰胺
历经10分钟向于0°C的4-甲氧基苯磺酰氯(5.0g,24mmol)和4-甲基苯胺(2.6g,24mmol)在二氯甲烷(24mL)中的溶液中加入三乙胺(3.4mL,24mmol)。除去冰浴，将混合物搅拌16小时。将混合物用二氯甲烷(100mL)稀释，将合并的溶液用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机溶液用MgSO4干燥，过滤并蒸发，将粗产物用硅胶色谱法(15-60%EtOAc/Hex)纯化。将含有产物的级分合并，蒸发并在高真空下干燥，得到6.4g(93%)产物，为褐色的油：1H-NMR(DMSO-d6)δ9.94(s,1H),7.66-7.63(m,2H),7.04-6.93(m,6H),3.77(s,3H),2.16(s,3H)。
IV.N-(联苯-2-基)-2-(N-(4-甲苯酰基)-4-甲氧基苯基磺酰氨基)乙酰胺
向N-(联苯-2-基)-2-溴乙酰胺(150mg,0.52mmol)和N-(4-甲苯酰基)-4-甲氧基苯磺酰胺(144mg,0.52mmol)在DMF(1.5mL)中的混合物中加入K2CO3(180mg,1.3mmol)。将所形成的混悬液加热至60°C达45分钟。将反应混合物倒入水(30mL)中，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(1×50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，用硅胶色谱法(15-40%EtOAc/Hex)纯化。将含有产物的级分合并并蒸发，得到122mg(48%)产物，为白色微晶固体：mp160-161°C,Rf0.19(25%EtOAc/Hex);1H-NMR(DMSO-d6)δ9.19(s,1H),7.67(d,1H),7.50(d,2H),7.42(t,3H),7.33-7.24(m,5H),7.07(d,4H),6.75(d,2H),4.24(s,2H),3.83(s,3H),2.27(s,3H)。
V.N-(2-甲氧基苯基)-4-甲氧基苯磺酰胺
历经10分钟向于0°C的4-甲氧基苯磺酰氯(5.0g,24mmol)和2-甲氧基苯胺(3.0g,24mmol)在二氯甲烷(24mL)中的溶液中加入三乙胺(3.4mL,24mmol)。除去冰浴，将混合物搅拌16小时。将混合物用二氯甲烷(100mL)稀释，将合并的溶液用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机溶液用MgSO4干燥，过滤并蒸发，将粗产物用硅胶色谱法(15-60%EtOAc/Hex)纯化。将含有产物的级分合并，蒸发并在高真空下干燥，得到5.3g(44%)产物，为褐色的油：1H-NMR(CDCl3)δ7.70-7.67(d,2H),7.53-7.50(d,1H),7.05-6.99(m,2H),6.91-6.83(m,3H),6.73(d,1H),3.80(s,3H),3.65(s,3H)。
VI.N-(联苯-2-基)-2-(N-(2-甲氧基苯基)-4-甲氧基苯基磺酰氨基)乙酰胺
向N-(联苯-2-基)-2-溴乙酰胺(150mg,0.52mmol)和N-(2-甲氧基苯基)-4-甲氧基苯磺酰胺(153mg,0.52mmol)在DMF(1.5mL)中的混合物中加入K2CO3(180mg,1.3mmol)。将所形成的混悬液加热至60°C达45分钟。将反应混合物倒入水(30mL)中，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(1×50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，用硅胶色谱法(15-40%EtOAc/Hex)纯化。将含有产物的级分合并并蒸发，得到84mg(33%)产物，为白色微晶固体：mp130-131°C,Rf0.10(25%EtOAc/Hex);1H-NMR(DMSO-d6)δ9.16(s,1H),7.68(d,1H),7.51(d,2H),7.40-7.28(m,9H),7.07(d,2H),6.95(d,1H),6.86(d,2H),4.19(s,2H),3.84(s,3H),3.31(s,3H)。
Figure BDA00003157078700431
VII.N-(4-甲氧基苯基)-4-甲氧基苯磺酰胺
历经10分钟向于0°C的4-甲氧基苯磺酰氯(5.0g,24mmol)和4-甲氧基苯胺(3.0g,24mmol)在二氯甲烷(24mL)中的溶液中加入三乙胺(3.4mL,24mmol)。除去冰浴，将混合物搅拌16小时。将混合物用二氯甲烷(100mL)稀释，将合并的溶液用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机溶液用MgSO4干燥，过滤并蒸发，将粗产物用硅胶色谱法(15-60%EtOAc/Hex)纯化。将含有产物的级分合并，蒸发并在高真空下干燥，得到9.5g(79%)产物，为褐色的油：1H-NMR(DMSO-d6)δ9.29(s,1H),7.63(d,2H),7.23-7.19(m,1H),7.11-7.01(m,3H),6.91-6.83(m,2H),3.79(s,3H),3.52(s,3H)。
VIII.N-(联苯-2-基)-2-(N-(4-甲氧基苯基)-4-甲氧基苯基磺酰氨基)乙酰胺
向N-(联苯-2-基)-2-溴乙酰胺(150mg,0.52mmol)和N-(4-甲氧基苯基)-4-甲氧基苯磺酰胺(153mg,0.52mmol)在DMF(1.5mL)中的混合物中加入K2CO3(180mg,1.3mmol)。将所形成的混悬液加热至60°C达45分钟。将反应混合物倒入水(30mL)中，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(1×50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，用硅胶色谱法(15-40%EtOAc/Hex)纯化。将含有产物的级分合并并蒸发，得到112mg(42%)产物，为白色微晶固体：mp131-133°C,Rf0.12(25%EtOAc/Hex);1H-NMR(CDCl3)8.98(s,1H),8.35(d,1H),7.62-7.47(m,7H),7.29-7.19(m,4H),6.88(dd,2H),6.71-6.67(m,2H),6.21-6.18(dd,1H),4.20(s,2H),3.85(s,3H),3.22(s,3H)。
Figure BDA00003157078700441
IX.N-(4-甲苯酰基)苯磺酰胺
历经10分钟向于0°C的苯磺酰氯(4.2g,24mmol)和4-甲基苯胺(2.6g,24mmol)在二氯甲烷(24mL)中的溶液中加入三乙胺(3.4mL,24mmol)。除去冰浴，将混合物搅拌16小时。将混合物用二氯甲烷(100mL)稀释，将合并的溶液用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机溶液用MgSO4干燥，过滤并蒸发，将粗产物用硅胶色谱法(15-60%EtOAc/Hex)纯化。将含有产物的级分合并，蒸发并在高真空下干燥，得到10.6g(97%)产物，为褐色的油：1H-NMR(DMSO-d6)δ10.09(s,1H),7.73-7.70(m,2H),7.59-7.49(m,3H),6.98(dd,4H),2.17(s,3H)。
X.N-(联苯-2-基)-2-(N-(甲苯酰基)苯基磺酰氨基)乙酰胺
向N-(联苯-2-基)-2-溴乙酰胺(150mg,0.52mmol)和N-(4-甲苯酰基)苯磺酰胺(129mg,0.52mmol)在DMF(1.5mL)中的混合物中加入K2CO3(180mg,1.3mmol)。将所形成的混悬液加热至60°C达45分钟。将反应混合物倒入水(30mL)中，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(1×50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，用硅胶色谱法(15-40%EtOAc/Hex)纯化。将含有产物的级分合并并蒸发，得到71mg(31%)产物，为灰白色粉末：mp98-100°C,Rf0.27(25%EtOAc/Hex);1H-NMR(CDCl3)8.84(s,1H),8.48(d,1H),7.72-7.67(m,2H),7.62-7.59(m,2H),7.54-7.46(m,6H),7.46-7.28(m,2H),7.2-7.17(m,1H),6.90(d,2H),6.18(m,2H),4.16(s,2H),2.26(s,3H)。
Figure BDA00003157078700451
XI.N-(4-甲苯酰基)-4-氯苯磺酰胺
历经10分钟向于0°C的4-氯苯磺酰氯(5.1g,24mmol)和4-甲基苯胺(2.6g,24mmol)在二氯甲烷(24mL)中的溶液中加入三乙胺(3.4mL,24mmol)。除去冰浴，将混合物搅拌16小时。将混合物用二氯甲烷(100mL)稀释，将合并的溶液用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机溶液用MgSO4干燥，过滤并蒸发，将粗产物用硅胶色谱法(15-60%EtOAc/Hex)纯化。将含有产物的级分合并，蒸发并在高真空下干燥，得到6.8g(69%)产物，为褐色的油：1H-NMR(CDCl3)δ10.17(s,1H),7.71(d,2H),7.61(d,2H),7.04(d,2H),6.96(d,2H),2.19(s,3H)。
XII.N-(联苯-2-基)-2-(N-(4-甲苯酰基)-4-氯苯基磺酰氨基)乙酰胺
向N-(联苯-2-基)-2-溴乙酰胺(150mg,0.52mmol)和N-(4-甲苯酰基)-4-氯苯磺酰胺(153mg,0.52mmol)在DMF(1.5mL)中的混合物中加入K2CO3(180mg,1.3mmol)。将所形成的混悬液加热至60°C达45分钟。将反应混合物倒入水(30mL)中，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(1×50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，用硅胶色谱法(15-40%EtOAc/Hex)纯化。将含有产物的级分合并并蒸发，得到94mg(37%)产物，为白色微晶固体：mp159-177°C,Rf0.42(25%EtOAc/Hex);1H-NMR(CDCl3)δ8.77(s,1H),8.48(d,1H),7.71-7.59(m,2H),7.52-7.40(m,6H),7.38-7.32(m,1H),7.29-7.26(m,2H),7.19-7.15(t,2H),6.95-6.23(m,2H),4.13(s,2H),2.27(s,3H)。
本文所引用的所有出版物、专利申请、专利和其它文件通过引用的方式均被全文合并入本文。在矛盾的情况下，应当以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例是举例说明性的，不是限制性的。
鉴于上述公开内容，对所公开的化合物的显然的改变和本发明的替代选择的实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见的。所有这些显然的变体和替代选择都被认为在本文所述的发明的范围内。

Claims (29)

1.在哺乳动物中抑制病毒感染的方法，其包括施用有效量的至少一种具有式I的结构的化合物和药物上可接受的载体或赋形剂，
Figure FDA00003157078600011
其中：
Ar1和Ar2独立地是一价的芳基或杂芳基，其可以是未被取代的或被至多5个取代基取代，所述取代基选自卤素、氨基、脒基、胍基、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、酰胺基、磺酰氨基、疏基、烷基硫基、芳基硫基、异羟肟酸酯基、硫代酰基、烷基磺酰基和氨基磺酰基；
R1是一价的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其可以是未被取代的或另外被选自以下的取代基中的任意一个取代：环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、酰胺基、磺酰氨基、疏基、烷基硫基、芳基硫基、异羟肟酸酯基、硫代酰基、烷基磺酰基和氨基磺酰基；
R2和R3独立地选自氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基和酰基氨基；
R4选自氢、一价的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基和杂环烷基；并且其中
R2和R3可以连接形成碳环或杂环；
如果R2和R3不同，对映体可以是(R)-或(S)-构型，或者外消旋化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的化合物有效抑制病毒进入宿主细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的药学上可接受的载体或赋形剂选自粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、润湿剂、助悬剂、乳化剂、非水性介质和防腐剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的化合物有效抑制流感感染。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的流感是鸟流感。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的鸟流感是H5N1亚型。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的化合物有效抑制埃博拉病毒感染。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的化合物有效抑制水泡性口炎病毒感染。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述的组合物通过选自皮内、透皮、肌内、腹膜内、静脉内或口服的途径被施用。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的组合物被口服施用。
12.权利要求11的方法，其中所述的口服施用选自片剂、明胶胶囊、微囊和液体制剂。
13.组合物，其包含式I的化合物：
其中：
Ar1和Ar2独立地是一价的芳基或杂芳基，其可以是未被取代的或被至多5个取代基取代，所述取代基选自卤素、氨基、脒基、胍基、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、酰胺基、磺酰氨基、疏基、烷基硫基、芳基硫基、异羟肟酸酯基、硫代酰基、烷基磺酰基和氨基磺酰基；
R1是一价的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其可以是未被取代的或另外被选自以下的取代基中的任意一个取代：环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、酰基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、酰胺基、磺酰氨基、疏基、烷基硫基、芳基硫基、异羟肟酸酯基、硫代酰基、烷基磺酰基和氨基磺酰基；
R2和R3独立地选自氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基和酰基氨基；
R4选自氢、一价的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基和杂环烷基；并且其中
R2和R3可以连接形成碳环或杂环；
如果R2和R3不同，对映体可以是(R)-或(S)-构型，或者外消旋化合物；和药学上可接受的载体或赋形剂；
并且其中所述的组合物在哺乳动物中有效抑制病毒感染。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的化合物有效抑制病毒进入宿主细胞。
15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的药学上可接受的载体或赋形剂选自粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、润湿剂、助悬剂、乳化剂、非水性介质和防腐剂。
16.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的化合物有效抑制流感感染。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述的流感是鸟流感。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述的鸟流感是H5N1亚型。
19.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的化合物有效抑制埃博拉病毒感染。
20.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的化合物有效抑制水泡性口炎病毒感染。
21.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的药学上可接受的载体或赋形剂选自粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、润湿剂、助悬剂、乳化剂、非水性介质和防腐剂。
22.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的化合物有效抑制流感感染。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述的流感是鸟流感。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述的鸟流感是H5N1亚型。
25.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的化合物有效抑制埃博拉病毒感染。
26.权利要求13所述的组合物抑制流感感染的用途。
27.权利要求13所述的组合物在制备用于治疗或预防流感感染的药剂中的用途。
28.权利要求13所述的组合物抑制埃博拉病毒感染的用途。
29.权利要求13所述的组合物在制备用于治疗或预防埃博拉病毒感染的药剂中的用途。
CN201180053724.7A 2010-09-13 2011-09-13 病毒进入哺乳动物细胞的抑制剂 Pending CN103491956A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38221510P 2010-09-13 2010-09-13
US61/382,215 2010-09-13
PCT/US2011/051389 WO2012037119A2 (en) 2010-09-13 2011-09-13 Inhibitors of viral entry into mammalian cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103491956A true CN103491956A (zh) 2014-01-01

Family

ID=45832198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180053724.7A Pending CN103491956A (zh) 2010-09-13 2011-09-13 病毒进入哺乳动物细胞的抑制剂

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9212134B2 (zh)
EP (1) EP2616073A4 (zh)
JP (1) JP5906244B2 (zh)
CN (1) CN103491956A (zh)
AU (1) AU2011302295B2 (zh)
CA (1) CA2810702A1 (zh)
WO (1) WO2012037119A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109988086A (zh) * 2019-04-04 2019-07-09 三峡大学 一种小分子抑制剂azin30及其在制药中的应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015171558A2 (en) * 2014-05-05 2015-11-12 Lycera Corporation BENZENESULFONAMIDO AND RELATED COMPOUNDS FOR USE AS AGONISTS OF RORγ AND THE TREATEMENT OF DISEASE
JP6838004B2 (ja) 2015-06-11 2021-03-03 リセラ・コーポレイションＬｙｃｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＲＯＲγのアゴニストとしての使用及び疾患の治療のためのアリールジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジンスルホンアミド及び関連化合物
US10829440B2 (en) 2015-06-12 2020-11-10 Brown University Antibacterial compounds and methods of making and using same
US20200277251A1 (en) * 2017-06-22 2020-09-03 Brown University Novel antibacterial compounds and methods of making and using same
JP2020050635A (ja) * 2018-09-28 2020-04-02 国立大学法人北海道大学 フィロウイルスの細胞侵入阻害活性を有するビアリールスルフォンアミド誘導体
WO2020074403A1 (en) * 2018-10-08 2020-04-16 Universität Zürich Appetite-modulating molecules
US11555010B2 (en) 2019-07-25 2023-01-17 Brown University Diamide antimicrobial agents

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1473157A (zh) * 2000-11-10 2004-02-04 ֮����ҩ��ʽ���� 酰胺衍生物
CN1678314A (zh) * 2002-08-27 2005-10-05 默克专利有限公司 作为raf－激酶抑制剂的甘氨酸酰胺衍生物
US20090088420A1 (en) * 2007-04-12 2009-04-02 University Of Southern California Compounds with hiv-1 integrase inhibitory activity and use thereof as anti-hiv/aids therapeutics
CN100502879C (zh) * 2006-07-20 2009-06-24 复旦大学 一种化合物在制备抗艾滋病药物中的应用
CN101516867A (zh) * 2006-08-19 2009-08-26 贝林格尔.英格海姆国际有限公司 具有止痛作用的芳基磺酰胺
US20100216852A1 (en) * 2006-06-16 2010-08-26 Ausubel Frederick M Methods for screening antimicrobial and antiviral compounds and uses thereof
WO2011046646A2 (en) * 2009-07-10 2011-04-21 Microbiotix, Inc. Inhibitors of filovirus entry into host cells

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1064289A1 (en) 1998-03-18 2001-01-03 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic signal transduction inhibitors, compositions containing them
MXPA05008106A (es) * 2003-02-18 2005-09-21 Pfizer Inhibidores del virus de la hepatitis c, composiciones y tratamientos que los emplean.
EP2411529A4 (en) 2009-03-27 2012-09-19 Zacharon Pharmaceuticals Inc MODULATORS OF BIOSYNTHESIS OF N-BOUND GLYCANS
FR2962649A1 (fr) 2010-07-19 2012-01-20 Conservatoire Nat Arts Et Metiers Traitement d'une pathologie liee a un effet excessif du tnf par un compose de benzene sulfonamide

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1473157A (zh) * 2000-11-10 2004-02-04 ֮����ҩ��ʽ���� 酰胺衍生物
CN1678314A (zh) * 2002-08-27 2005-10-05 默克专利有限公司 作为raf－激酶抑制剂的甘氨酸酰胺衍生物
US20100216852A1 (en) * 2006-06-16 2010-08-26 Ausubel Frederick M Methods for screening antimicrobial and antiviral compounds and uses thereof
CN100502879C (zh) * 2006-07-20 2009-06-24 复旦大学 一种化合物在制备抗艾滋病药物中的应用
CN101516867A (zh) * 2006-08-19 2009-08-26 贝林格尔.英格海姆国际有限公司 具有止痛作用的芳基磺酰胺
US20090088420A1 (en) * 2007-04-12 2009-04-02 University Of Southern California Compounds with hiv-1 integrase inhibitory activity and use thereof as anti-hiv/aids therapeutics
WO2011046646A2 (en) * 2009-07-10 2011-04-21 Microbiotix, Inc. Inhibitors of filovirus entry into host cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMINE O. NOUEIRY ET AL.: "Identification of Novel Small-Molecule Inhibitors of West Nile Virus Infection", 《JOURNAL OF VIROLOGY》, vol. 81, no. 21, 30 November 2007 (2007-11-30), pages 11992 - 12004, XP002716950, DOI: doi:10.1128/JVI.01358-07 *
WILLIAM E. SEVERSON ET AL.: "High-Throughput Screening of a 100,000-Compoud Library for Inhibitors of Influenza A Virus(H3N2)", 《JOURNAL OF BIOMOLLECULAR SCREENING》, 23 September 2008 (2008-09-23), pages 879 - 887 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109988086A (zh) * 2019-04-04 2019-07-09 三峡大学 一种小分子抑制剂azin30及其在制药中的应用
CN109988086B (zh) * 2019-04-04 2021-06-18 三峡大学 一种小分子抑制剂azin30及其在制药中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2616073A2 (en) 2013-07-24
JP2014500232A (ja) 2014-01-09
WO2012037119A3 (en) 2014-03-27
US20130331456A1 (en) 2013-12-12
EP2616073A4 (en) 2015-02-18
WO2012037119A2 (en) 2012-03-22
AU2011302295A1 (en) 2013-03-21
JP5906244B2 (ja) 2016-04-20
US9212134B2 (en) 2015-12-15
AU2011302295B2 (en) 2015-08-20
CA2810702A1 (en) 2012-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103491956A (zh) 病毒进入哺乳动物细胞的抑制剂
US10918623B2 (en) Methods of treating influenza
Russell Acid-induced membrane fusion by the hemagglutinin protein and its role in influenza virus biology
Pattnaik et al. Entry inhibitors: efficient means to block viral infection
US20090053263A1 (en) Inhibitors of Enveloped Virus Infectivity
KR20100028017A (ko) 아레나바이러스와 관련된 감염증을 포함하는 출혈열 바이러스를 치료하기 위한, 설포닐 세미카르바지드, 카르보닐 세미카르바지드, 세미카르바지드 및 우레아, 이의 약제 조성물, 및 방법
CN103958475B (zh) 杂芳基异羟肟酸衍生物及其在治疗、减轻或预防病毒疾病中的用途
Ju et al. Discovery of C-1 modified oseltamivir derivatives as potent influenza neuraminidase inhibitors
WO1997028802A1 (en) Inhibition of viral replication
JP6415568B2 (ja) Ａ型インフルエンザｒｎａ依存性ｒｎａポリメラーゼの低分子阻害剤
Gaisina et al. Optimization of 4-aminopiperidines as inhibitors of influenza A viral entry that are synergistic with oseltamivir
Hussein et al. Identification of entry inhibitors with 4-aminopiperidine scaffold targeting group 1 influenza A virus
Upla Integrin-mediated entry of echovirus 1
AU2015255306A1 (en) Inhibitors of viral entry into mammalian cells
Zhao et al. Broad-spectrum respiratory virus entry inhibitors
CA2881967C (en) Inhibitors of protein phosphatase-1 and uses thereof
Bortz III Antiviral Therapeutics Exploit Entry-Related Structural Changes in the Ebola Virus Glycoprotein
Zmora Activation of the influenza virus hemagglutinin by type II transmembrane serine proteases
Gopal et al. Targeting Molecular and Cellular Mechanism of Influenza A Virus
Bonavia et al. Antibody targeting of TSG101 on influenza-infected cells
Shoemaker Mechanisms of Ebolavirus entry
Qing Distinct Roles for Carbohydrate and Protein Receptors in Coronavirus Infection
Cheng Development of Live-Attenuated Arenavirus Vaccines
Devaraj By Santhana Gowri Thangavelu Devaraj 2009
Hoffmann et al. Molecular insights into modulation of host innate immune response by viral proteins of RNA viruses SARS-CoV, HCV and Influenza virus

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1192148

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140101

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1192148

Country of ref document: HK