CN103487393B - 一种蛋白质快速定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白质快速定量方法，将目的蛋白与铁氧还蛋白rubredoxin的融合蛋白在宿主菌中表达，利用rubredoxin的吸收光谱特性，直接测定宿主菌裂解后的上清中融合蛋白的含量。该方法不仅可用于检测目的蛋白的可溶表达量，还可以用于筛选合适的蛋白表达条件，以及实时监测目的蛋白的表达情况。本发明方法定量准确，操作简便快速，成本低廉，且适用范围广泛，不受仪器和试剂限制。

Description

一种蛋白质快速定量方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质快速定量方法。

背景技术

将外源基因导入大肠杆菌并诱导其表达，是科学研究以及工业生产过程中获得目的蛋白的重要方法之一。该方法首先需要实验者去优化外源基因的表达条件，如选择合适的菌株、载体、表达温度等等，从而提高蛋白质的表达量并帮助其正确折叠，以获得较多的可溶性目的蛋白。另外，在蛋白质的表达过程中，我们需要在合适的时候收集细菌以提取蛋白。表达时间不足，或者表达时间过长导致的蛋白质的降解，都会降低目的蛋白的产率。为此，我们需要实时监测目的蛋白的表达情况。

一般情况下，为了获得不同条件下以及不同时间点时的表达情况，我们需要收集一定量的细菌，经破碎、离心后，将上清与沉淀分离，测定上清中目的蛋白的含量。但由于上清中还含有许多细菌本身表达的内源性蛋白，通常情况下我们需要进行分离后才能对目的蛋白进行定量。一种传统方法是取上清制备成样品进行蛋白质凝胶电泳，然后测定目的蛋白条带的大小以及灰度。但该方法比较耗时(约2h)，而且要用到一些有毒试剂。另外，细菌内的某些内源性蛋白可能会与目的蛋白的条带重合，从而造成干扰。我们也可以将目的蛋白从上清中提纯出来后再对其进行定量，但这种方法同样耗费大量时间和人力。

鉴于纯化和分离过程的复杂性，许多研究者致力于寻找更加直接和快速的蛋白质定量方法。如在蛋白上引入His标签，然后利用识别His标签的酶联抗体进行斑点杂交(dot-blotting)实验来检测蛋白质表达水平(Vincentelli,R.,S.Canaan,J.Offant,C.Cambillau and C.Bignon(2005)."Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format."Anal Biochem 346(1):77-84.)。或在目的蛋白上融合表达一段含双抗原表位的短肽，向细菌裂解后的上清中加入两种分别识别两种表位的单克隆抗体，两种抗体分别用相互之间可以发生荧光共振能量转移的两种荧光标签标记，通过检测均相时间分辨荧光(HTRF)信号的强弱来对蛋白质定量(Enomoto,K.,K.Uwabe,S.Naito,J.Onoda,A.Yamauchi,Y.Numata and H.Takemoto(2008)."A double epitope tag for quantification of recombinant protein usingfluorescence resonance energy transfer."Anal Biochem 380(2):249-256.)。或在C端加一半胱氨酸残基(cystope tagging)，蛋白质通过该残基上的巯基与荧光素标记的马来酰亚胺通过加成反应偶联在一起，然后利用流式细胞仪检测细胞内荧光强度(Jose,J.and S.von Schwichow(2004).""Cystope tagging"for labeling and detection of recombinant protein expression."AnalBiochem 331(2):267-274.)。还有研究者利用荧光偏振技术(fluorescence polarization，FP)，由于带有C-myc标签的蛋白与一种荧光素偶联的C-myc短肽竞争结合C-myc抗体时，会降低C-myc短肽-抗体复合物的荧光偏振信号，故可利用荧光偏振信号的减弱来指示目的蛋白含量(Sun,S.,L.H.Nguyen,O.Harold Ross,G.F.Hollis and R.Wynn(2002)."Quantitative analysisof c-myc-tagged protein in crude cell extracts using fluorescence polarization."Anal Biochem307(2):287-296.)。GFP等荧光蛋白也被用来监测蛋白质的表达情况，与GFP融合表达的目的蛋白自身的荧光特性可作为检测蛋白质含量的方法(Coleman,M.A.,V.H.Lao,B.W.Segelke and P.T.Beernink(2004)."High-throughput,fluorescence-based screening for solubleprotein expression."J Proteome Res 3(5):1024-1032；Omoya,K.,Z.Kato,E.Matsukuma,A.Li,K.Hashimoto,Y.Yamamoto,H.Ohnishi and N.Kondo(2004)."Systematic optimization of activeprotein expression using GFP as a folding reporter."ProteinExprPurif 36(2):327-332；Coutard,B.,M.Gagnaire,A.A.Guilhon,M.Berro,S.Canaanand C.Bignon(2008)."Green fluorescent proteinand factorial approach:an effective partnership for screening the soluble expression of recombinantproteins in Escherichia coli."Protein ExprPurif 61(2):184-190.)。

然而，抗体的制备以及荧光标记等给检测带来新的成本，某些方法用到的仪器和试剂使得其适用性受限。另外，GFP蛋白在大肠杆菌中表达时易形成包涵体，从而影响目的蛋白的表达，作为一个融合标签其应用受到限制。

红素氧还蛋白(rubredoxin)是一种6KDa大小的含铁的蛋白质，当Fe为+2价时rubredoxin无色，当Fe为+3价时rubredoxin呈红色，此时它在380nm和491nm附近各有一个吸收峰。Rubredoxin自身在大肠杆菌中表达时可溶表达量很高，也可作为一种标签蛋白帮助目的蛋白表达，同时利用rubredoxin的颜色可以使融合蛋白的表达和纯化更加方便(Kohli,B.M.and C.Ostermeier(2003)."ARubredoxin based system for screening of protein expression conditions andon-line monitoring of the purification process."Protein ExprPurif 28(2):362-367.)。

发明内容

本发明的目的在于利用rubredoxin的吸收光谱特性，提供一种更加快速、准确、低成本、适用范围广泛、不受仪器和试剂限制的蛋白定量方法。该方法可用于检测目的蛋白可溶表达量，筛选合适的表达条件，以及实时监测目的蛋白的表达情况。

本发明的蛋白质定量方法，是将目的蛋白与红素氧还蛋白(rubredoxin)的融合蛋白在宿主菌中表达，利用rubredoxin的吸收光谱特性，直接测定宿主菌裂解后的上清中融合蛋白的含量，从而得到目的蛋白的可溶表达量。其中所述宿主菌优选为大肠杆菌。

本发明的蛋白质定量方法的实现需要将待测蛋白质与rubredoxin融合表达。

所述rubredoxin的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。rubredoxin的编码基因可以是序列表中SEQ ID No：2所示的DNA分子。当然，由于密码子的简并性，其它与SEQ IDNo：2所示核苷酸序列同源且编码相同氨基酸序列的DNA分子也可用于构建目的蛋白和rubredoxin的融合蛋白表达载体。

下面以大肠杆菌为宿主菌为例，说明本发明的蛋白质定量方法的依据和原理。

一、本发明的蛋白质定量方法依据以下发现：

1)氧化态rubredoxin在491nm附近有一吸收峰(图2A)，而且其在460-520nm范围内的吸光曲线近似为对称抛物线，在472nm和510nm处的吸光系数相同；

2)大肠杆菌裂解后得到的上清在460-520nm范围内的吸光曲线近似线性(图2B)，除非其表达某种在该区域有吸收峰的外源性蛋白或代谢产物；

3)当大肠杆菌裂解后得到的上清中含有rubredoxin或rubredoxin融合蛋白时，其在460-520nm范围内的吸光曲线由直线(图2C中DEF线)变为曲线(图2C中ABC线)。

当然，本发明方法涉及的宿主菌并不局限于大肠杆菌，符合上述第(2)条的宿主菌均可应用于本发明。

二、本发明蛋白定量方法的计算原理如下：

参照图2C，当大肠杆菌裂解后的上清中含有rubredoxin融合蛋白时，在460-520nm范围的测得的吸收曲线为ABC。此时，假设将体系中的rubredoxin全部去除，则依据之前所述发现，体系的吸收曲线将下移到原来曲线的下方，并近似为一条直线，假设为DEF。

设上清中rubredoxin的物质的量浓度(也即融合蛋白或目的蛋白的物质的量浓度)为c，比色皿光路长度为l，rubredoxin在472nm、491nm和510nm的摩尔吸光系数分别为ε₄₇₂、ε₄₉₁和ε₅₁₀；x代表横坐标值，y代表纵坐标值，A代表吸光度。

A、B、C三点的纵坐标即为体系在472nm、491nm和510nm处的吸光值，即

y_A＝A₄₇₂

y_B＝A₄₉₁

y_C＝A₅₁₀

另外

x_A＝x_D＝472nm

x_B＝x_E＝491nm

x_C＝x_F＝510nm

y_D＝y_A－ε₄₇₂lc

y_E＝y_B－ε₄₉₁lc

由于rubredoxin蛋白的  ε₄₇₂＝ε₅₁₀，

即                    ｜ＡD｜＝｜ＣF｜

故                     AC//DF

于是AC和DF两直线斜率相等，即

k_AC＝k_DF＝k_DE

$\frac{y_A-y_C}{x_A-x_C}=\frac{y_D-y_E}{x_D-x_E}$

$\frac{y_A-y_C}{-38}=\frac{(y_A-{\mathrm{\ϵ}}_{472}\mathrm{lc})-(y_B-{\mathrm{\ϵ}}_{491}\mathrm{lc})}{-19}$

从而得到 $C=\frac{2A_{194}-A_{472}-A_{510}}{2({\mathrm{\ϵ}}_{491}-{\mathrm{\ϵ}}_{472})l}=\frac{\mathrm{\ΔA}}{2({\mathrm{\ϵ}}_{491}-{\mathrm{\ϵ}}_{472})l}$    ①

其中ΔA＝2A₄₉₁-A₄₇₂-A_5l0

三、所述定量方法的准确性验证

所述定量方法经标准加入法验证，具有较高的准确性。

以纯化好的rubredoxin-HREV107N-His为标准样品，其浓度由融合蛋白在280nm处的吸光值确定，向不含rubredoxin-HREV107N-His融合蛋白的大肠杆菌裂解后所得上清中加入分别加入不同浓度梯度的标准样品。利用所述定量方法测定其中融合蛋白的浓度，并与实际值相比。注：所述HREV107N为人类肿瘤抑制因子HREV107的N端结构域，此蛋白在460-520nm附近没有吸收峰。

图3中A为加入不同浓度标准样品的上清测得的吸光曲线；B为按照所述定量方法测得的浓度与实际浓度的比较结果，利用OriginPro 8程序进行线性拟合分析；C为各样品的SDS-PAGE电泳图。比较实际浓度与所测结果(图3B)，线性拟合得到的方程中斜率为0.997，Adj.R-Square为0.9992，表明所述定量方法具有很高的准确性。这是利用SDS-PAGE电泳法等难以实现的。

单独的rubredoxin蛋白以及其他rubredoxin融合蛋白亦被作为标准样品用于该方法的验证，测量结果同样准确，具体内容不复表述。

四、应用所述蛋白质定量方法时步骤如下：

1)构建目的蛋白与rubredoxin的融合蛋白的表达载体。根据需要，rubredoxin可以插入到目的蛋白的C端或N端，亦可以继续添加其他标签蛋白。但除rubredoxin外其他部分蛋白在460-520nm范围内不能有吸收峰。

2)将构建好的表达载体转入宿主菌，培养宿主菌并表达融合蛋白。

3)表达一定时间后收集宿主菌并裂解，离心，取上清。裂解菌的方法例如：取一定量菌液，离心取沉淀用适宜融合蛋白的缓冲溶液重悬，然后超声破碎。亦可使用细菌裂解液等其他裂解方法。

4)向上清中加入过量双氧水(双氧水的终浓度例如0.06％)，将rubredoxin全部转化为氧化态，充分反应后利用紫外-可见分光光度计测460-520nm范围内上清的吸收曲线，记录A₄₇₂、A₄₉₁和A₅₁₀，计算ΔA。

5)将ΔA带入公式①计算融合蛋白浓度，从而得到目的蛋白的可溶表达量。

五、本发明所述蛋白质定量方法相对于已知技术具有以下优势：

1)定量准确，不受其他蛋白质、核酸等物质的干扰，且可直接计算得到融合蛋白的物质的量浓度，此浓度更能准确反映出蛋白的表达情况。

2)操作简便，速度快。样品制备过程方便，只需简单处理后测定吸收光谱即可，可以实时获得蛋白质的表达情况。

3)成本低廉，无毒无污染。所述定量方法除了需要少量双氧水，无需任何贵重或有毒试剂，亦不产生任何有毒废物。另外，所述定量方法所涉及主要仪器包括分子生物学实验室常备的超声破碎仪以及紫外可见分光光度计，无需其他特殊或贵重仪器。

4)可应用性强。体现在两点：其一，所述rubredoxin是一个性质稳定表达很好的蛋白质，分子量很小，对目的蛋白基本无干扰，作为标签蛋白具有广泛的应用范围；其二，所述定量方法所涉及的实验在所有有能力进行蛋白质表达实验的实验室均可轻松完成。

5)依据所述蛋白质定量方法，借助相应仪器如多通道分光光度计，可以建立一套高通量蛋白质表达条件筛选系统。

附图说明

图1是红素氧还蛋白(rubredoxin)结构图(A)和氧化态rubredoxin的紫外-可见吸收光谱(B)。

图2显示了本发明蛋白定量方法的原理，其中：A.氧化态rubredoxin在460-520nm范围内吸光曲线；B.大肠杆菌裂解后得到的上清在460-520nm范围内的吸光曲线；C.本发明蛋白定量方法的计算原理示意图，其中ABC是表达有rubredoxin融合蛋白的大肠杆菌裂解后的上清的吸光曲线，DEF是将其中的rubredoxin去除后得到的假想线。

图3是通过标准加入法验证所述蛋白质定量方法的准确性的结果，其中：A是向不含rubredoxin的大肠杆菌裂解液上清中加入一系列浓度梯度的rubredoxin-HREV107N-His标准样品后测得的吸光曲线；B是依据各吸光曲线计算所得浓度与实际浓度之间的比较结果；C是各样品的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳结果图。

图4是本发明实施例一筛选fam96A蛋白质表达条件的实验结果，其中A.采用SMT3和GST两种标签蛋白帮助fam96A表达，在不同培养温度和培养时间取样品利用本发明所述定量方法测量蛋白的表达情况；B.相同样品的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳结果；图中1～4分别是SMT3-fam96A-rubredoxin-His融合蛋白在35℃/3h，35℃/6h，25℃/6h和25℃/12h培养条件下的表达情况；5～8分别是GST-fam96A-rubredoxin-His融合蛋白在35℃/3h，35℃/6h，25℃/6h和25℃/12h培养条件下的表达情况。。

图5是本发明实施例二对rubredoxin-HREV107N-His蛋白表达情况的实时监测结果，其中：A显示了融合蛋白rubredoxin-HREV107N-His在35℃条件下蛋白可溶表达量m(mg/L)随时间的变化；B为各样品的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳结果图。

具体实施方式

下面结合附图，通过两个具体实施例进一步阐释本发明。

实施例一是利用本发明的蛋白质定量方法筛选fam96A蛋白最适合的表达条件；实施例二是利用本发明的蛋白质定量方法实时监测融合蛋白rubredoxin-HREV107N-His的表达情况。

所述fam96A与HREV107N为实施例中所选目的蛋白，它们以及实施例中涉及到的其他蛋白质、载体、菌株等，仅用于说明本发明，并不限定本发明的应用范围。本发明所涉及方法适用于其他任何在460-520nm没有吸收峰的蛋白质的表达。Rubredoxin可融合在目的蛋白的N端或C端，亦可添加其他的帮助目的蛋白表达或纯化的标签蛋白，所添加的其他标签在460-520nm亦当没有吸收峰。

实施例中，如实验具体条件未注明，请参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著)所述常规实验条件，或者仪器、试剂供应商所提供的条件。常规质粒构建所涉及的PCR、酶切、连接等实验，以及蛋白质表达所涉及的转化、细菌培养、诱导等实验为本领域研究人员所熟悉，具体实验细节在本发明中不再做详细描述，亦可参照《分子克隆实验指南》。

实施例一：目的蛋白fam96A表达条件的筛选

Rubredoxin基因序列可通过合成一系列引物进行重叠片段PCR反应得到。所用引物序列如下：

Rub_F1：5’-GGAATTCCATATGAAAAAATACACCTGCACCGTTTGCGGTTACATCTACAACCCGGAAGA-3’(SEQ ID No：3)

Rub_R2：5’-GAAGTCGGTACCCGGGTTAACACCGTTGTCCGGGTCACCGTCTTCCGGGTTGTAGA-3’(SEQ ID No：4)

Rub_F3：5’-CCCGGGTACCGACTTCAAAGACATCCCGGACGACTGGGTTTGCCCGCTGTGCGGTG-3’(SEQ ID No：5)

Rub_R4：5’-CCGCTCGAGTTCTTCAACTTCTTCGAACTGGTCTTTACCAACACCGCACAGCGGGCA-3’(SEQ ID No：6)

其中CATATG与CTCGAG分别为NdeI与XhoI限制性酶切位点。将重叠PCR所得片段通过这两个酶切位点插入pET-21a载体，可得pET-21a-rubredoxin-His质粒。即获得rubredoxin的基因序列。

fam96A是与染色体分离过程相关的一种人源蛋白质。fam96A单独在大肠杆菌中表达时可溶表达量较低。本发明构建了pET-21a-SMT3-fam96A-rubredoxin-His与pPGH-fam96A-rubredoxin-His两种载体，并利用本发明蛋白质快速定量方法对其表达条件进行了筛选。发现利用pPGH-fam96A-rubredoxin-His载体与BL21表达菌株，在35℃表达6h是一合适的表达条件。具体步骤如下：

1)构建pET-21a-SMT3-fam96A-rubredoxin-His与pPGH-GST-fam96A-rubredoxin-His表达载体。

所述pET-21a-SMT3-fam96A-rubredoxin-His以商业载体pET-21a为基础构建而成，其中：所述SMT3为酵母中泛素化蛋白类似蛋白，是一种帮助蛋白可溶表达的标签蛋白；rubredoxin部分相应核苷酸序列和氨基酸序列参照序列表中SEQ ID No：1和SEQ ID No：2。

SMT3与fam96A之间，以及fam96A与rubredoxin之间各有一段linker(连接肽)，其核苷酸序列依次为：

linker1：5’-CCATGGGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGGATCC-3’(SEQ ID No：7)；

linker2：5’-GAATTCCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTATCGAT-3’(SEQ ID No：8)。

其中CCATGG、GGATCC、GAATTC以及ATCGAT分别为NcoI、BamHI、EcoRI和ClaI限制性酶切位点。

它们对应氨基酸序列依次分别为：

Linker1：PWGGSGGGSGLEVLFQGPGS(SEQ ID No：9)；

Linker2：EFLEVLFQGPGGSGGGSGID(SEQ ID No：10)。

其中LEVLFQGP为PreScission蛋白酶酶切位点。

His为含有六个组氨酸的pET-21a载体所带亲和标签，它与rubredoxin之间为XhoI限制性酶切位点。

所述pPGH-GST-fam96A-rubredoxin-His载体以商业载体pGEX-6p-1为基础构建而成，fam96A的N端与GST融合标签以PreScission蛋白酶酶切位点相连；C端序列与pET-21a-SMT3-fam96A-rubredoxin-His中fam96A的C端序列相同。

载体具体构建原理和方法为本领域研究人员所熟悉，不再赘述。

2)将以上两种重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21表达菌株。

3)35℃条件下，在3mL LB培养基中培养已转入重组质粒的BL21大肠杆菌，经12h后转入40mL LB培养基进行扩大培养。

4)菌液OD值达到0.8时加入0.4mM IPTG以及0.7mM FeCl₃。将菌液分成两份，分别在35℃和25℃诱导蛋白表达。

5)在3h和6h时各收集3mL35℃条件下诱导的菌液；在6h和12h各收集3mL 25℃条件下诱导的菌液。8000g离心1min，弃上清，用150μLTris-HCl缓冲溶液(50mMTris，50mMNaCl，pH＝8.0)重悬。冰浴，超声2-3min，于4℃环境中12000g离心3min。冰浴，取上清液加入1μL 10％双氧水，充分反应后利用紫外-可见分光光度计测上清在460-520nm范围内的吸收曲线。计算上清中融合蛋白的浓度，结果如图4A所示。

6)用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析以上所得上清样品，结果如图4B所示。

将图4A和B的结果进行比较，可以看出，本方法以及SDS-PAGE均可用于筛选蛋白质表达条件，且两种方法得到的结果一致。相比之下，本方法可以直接测定出上清中目的蛋白的物质的量浓度，据此可进一步推算一定体积菌液中可收获的目的蛋白量。SDS-PAGE电泳法则只能根据不同条带的灰度做半定量的比较和估算，且受宿主内源性蛋白的影响而定量不准确；另外，灰度反映的是融合蛋白的总量，比较带有不同融合标签的目的蛋白表达情况时还要考虑它们分子量的不同。

实施例二：rubredoxin-HREV107N-His融合蛋白表达情况的实时监测

1)构建pET-21a-rubredoxin-linker-HREV107N-His融合蛋白表达载体所述表达载体以商业载体pET-21a为基础构建而成。

HREV107N为人肿瘤抑制因子HREV107的N端1-125位氨基酸残基区域。

Linker的核苷酸序列为：

5’-CCATGGGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGGATCC-3’(SEQ ID No：7)

其中CCATGG与GGATCC分别为NcoI和BamHI限制性酶切位点。

对应氨基酸序列为：PWGGSGGGSGLEVLFQGPGS(SEQ ID No：9)

其中LEVLFQGP为PreScission蛋白酶酶切位点。

2)将以上重组质粒转化入大肠杆菌BL21表达菌株。

3)35℃条件下，在3mL LB培养基中培养已转入重组质粒的BL21大肠杆菌，经12h后转入50mLLB培养基进行扩大培养。

4)菌液OD值达到0.8时加入0.4mM IPTG以及0.7mM FeCl₃，诱导蛋白表达。在此之前收集3mL菌液，8000g离心1min，弃上清，用150μLTris-HCl缓冲溶液(50mMTris，50mMNaCl，pH＝8.0)重悬。冰浴，超声2-3min，于4℃环境中12000g离心3min。冰浴，取上清液加入1μL 10％双氧水，充分反应后利用紫外-可见分光光度计测上清在460-520nm范围内的吸收曲线。

5)每隔1h收集3mL菌液，按4)中所述方法制备样品进行分析，计算融合蛋白浓度c，并进一步计算相同条件下在1L LB培养时可获得的可溶蛋白量。结果如图5A所示。

6)用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析以上所得上清样品，结果如图5B所示。

将图4A和B的结果进行比较，可以看出本方法与SDS-PAGE方法所得结果具有一致性。但SDS-PAGE电泳法分析一批样品需要两个小时左右，而本方法在十几分钟内即可完成，能够真正做到实时监测。

SDS-PAGE蛋白凝胶电泳法是一种使用广泛的分析蛋白质表达情况的传统方法。如果要比较不同条件下目的蛋白的表达量，只能通过测定蛋白胶上的目的蛋白条带的大小和灰度进行估算，而且，大肠杆菌内源性表达的与目的蛋白处于同一位置的蛋白会对该方法造成干扰。比较不同大小的蛋白表达情况时还要考虑它们的分子量。另外，该方法操作复杂，需要用到一些有毒试剂。

本发明所涉及蛋白质定量方法则可以很方便地直接测得上清中目的蛋白的物质的量浓度。测定准确、速度快，而且成本低廉、操作简便、没有污染。不仅适用于一般科研和生产过程中蛋白质表达条件的筛选，同时在多通道分光光度计等仪器帮助下，可建立一套高通量的蛋白质表达条件筛选系统。

另外，正因为本发明所涉及蛋白质定量方法步骤简单，从收集样品到得到结果，十几分钟内即可完成，因此可用于实时监测蛋白质的表达情况，这是SDS-PAGE蛋白凝胶电泳法所难以实现的。

Claims (10)

1.一种蛋白质定量方法，包括以下步骤：

1)构建待测目的蛋白与红素氧还蛋白的融合蛋白的表达载体，所述表达载体表达的蛋白质除红素氧还蛋白外在460-520nm范围内均没有吸收峰；

2)将构建好的表达载体转入宿主菌，培养宿主菌并表达融合蛋白，其中所述宿主菌除红素氧还蛋白外所表达的外源性蛋白和代谢产物在460-520nm范围内没有吸收峰；

3)表达一定时间后收集宿主菌并裂解，离心，取上清；

4)向上清中加入双氧水，将红素氧还蛋白全部转化为氧化态，充分反应后利用紫外-可见分光光度计测460-520nm范围内上清的吸收曲线，记录472nm、491nm和510nm处的吸光度值A₄₇₂、A₄₉₁和A₅₁₀，计算

ΔA＝2A₄₉₁-A₄₇₂-A₅₁₀

5)将ΔA带入下述公式计算出融合蛋白浓度c，从而得到待测目的蛋白的可溶表达量：

$c=\frac{\mathrm{\ΔA}}{2({\mathrm{\ϵ}}_{491}-{\mathrm{\ϵ}}_{472})l}$

其中，l是测量吸光度所用比色皿的光路长度，ε₄₉₁与ε₄₇₂分别为红素氧还蛋白在491nm和472nm处的摩尔吸光系数。

2.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。

3.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，所述红素氧还蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

4.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，步骤1)所述融合蛋白中，红素氧还蛋白连接在目的蛋白的C端或N端。

5.如权利要求4所述的蛋白质定量方法，其特征在于，所述融合蛋白中目的蛋白与红素氧还蛋白之间的连接肽序列如序列表中SEQ ID No：9或SEQ ID No：10所示。

6.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，步骤1)所述融合蛋白中除红素氧还蛋白外还融合了其他标签蛋白。

7.如权利要求6所述的蛋白质定量方法，其特征在于，所述其他标签蛋白是His标签蛋白。

8.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，步骤1)构建融合蛋白表达载体的出发载体是pET-21a或pGEX-6p-1。

9.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，步骤3)用超声破碎或加裂解液的方法裂解菌。

10.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，步骤4)双氧水终浓度为0.06％。