CN103468584A

CN103468584A - 一种水霉菌丝的提取方法

Info

Publication number: CN103468584A
Application number: CN2013103611680A
Authority: CN
Inventors: 胡鲲; 叶鑫; 赵依妮; 袁海兰; 杨先乐
Original assignee: Shanghai Maritime University
Current assignee: Shanghai Maritime University; Shanghai Ocean University
Priority date: 2013-08-19
Filing date: 2013-08-19
Publication date: 2013-12-25

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，主要是涉及一种水霉菌丝的提取方法。具体步骤：菌株活化培养、菌株菌丝固体培养、液体菌丝体培养等。水霉菌的特征在于其包括寄生水霉（saprolegniaparasitica），保藏号为ATCC200013TM；多子水霉(saprolegniaferax)保藏于国家水生动物病原库。本发明的目的是通过对两种不同培养基上水霉菌的培养，得到一种可以在较短的时间内获取较多水霉菌丝的一种方法。

Description

一种水霉菌丝的提取方法

【技术领域】

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，是一种关于菌丝的提取方法。

【背景技术】

水霉科是一类水生真菌，广泛分布于淡水中，几乎感染所有的淡水鱼类和粘性鱼卵，对养殖业造成了巨大的经济损失。目前国内外对于水霉菌的研究主要集中在水霉病的症状描述，病原菌的鉴定，致病条件的探讨，防治方法的摸索以及一些分子水平方面的研究，而在分子实验中水霉菌丝样品的制备很是重要。因此，在开展分子实验时，最基本步骤需获得纯水霉菌丝，一种有效、简单的样品制备方法会使的研究工作更加顺利，研究成果更加可靠。为此特发明了一种水霉菌丝高效简易的提取方法。

中国专利文献CN1090717公开了一种人参真菌及其提取物的制备方法及人参真菌提取物用途。中国专利文献CN1075654公开了一种人含茯苓菌丝或其提取物的制剂及其制备方法。但是关于提取水霉菌丝的简易方法的专利目前还未见报道。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种适用于水霉菌丝的高效提取方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

（1）水霉菌的提取： 1）孢子悬液的制备

将水霉菌（寄生水霉和多子水霉）接种于放有无菌油菜籽的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，于 20 ℃ 恒温条件下培养直至油菜籽上长满菌丝；在六孔板中加入无菌水，将长满菌丝的油菜籽放入六孔板中；然后于 20 ℃ 恒温培养箱中培养，24小时后于显微镜下观察水霉菌丝孢子的释放情况，当孢子数量达到一定量以后，再将菜籽取出。

2）水霉菌丝的提取

在六孔板中加入沙氏葡萄糖液体培养基，置于 20 ℃ 恒温条件下培养直至长出菌丝；然后用无菌的镊子夹出菌丝，于无菌水中漂洗 3 ~ 4次，用无菌的滤纸吸取菌丝上的水，即为水霉菌丝。

3）对照组实验比较

对照组以PDA培养基培养菌丝，待菌丝长满平板时，即用镊子将培养基表面的菌丝夹取下来，先用生理盐水漂洗一次，然后再用无菌水清洗。

本发明优点在于：

1、菌丝更易获得。

2、菌丝量更多。单位位时间内沙氏葡萄糖液体培养基上获得两种水霉菌丝的重量是PDA固体培养基的 3 ~ 4 倍

3、操作更简易。获取相同重量的两种水霉菌丝在沙氏葡萄糖液体培养基上用的时间是是PDA固体培养基的 1/8 ~ 1/7 倍

【具体实施方式】

下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

一、材料和方法

1.1 实验材料

寄生水霉ATCC200013TM，购于美国标准生物品收藏中心；多子水霉（将发病鱼或鱼卵用 75% 酒精浸洗 3 次, 然后用无菌蒸馏水冲洗 6 次, 置于加有 100 mg/L 链霉素青霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上, 在 20 °C 恒温培养 24 h后立即在长出的菌落边缘放置无菌油菜籽, 在 20 °C恒温继续培养,待油菜籽上覆盖菌丝后将其取出并置于灭菌过滤河水中, 于 20 °C 培养直至游动孢子释放。无菌吸取 100 μL 孢子悬液至 PDA 平板上均匀涂布, 20 °C 恒温培养并切取单菌落琼脂块到 PDA平板上进行纯化培养, 于 4°C 保存待用），沙氏葡萄糖液体培养基、马铃薯葡糖糖琼脂培养基平板、无菌蒸馏水、六孔板、1mL 枪头，购于国药集团（上海）化学试剂有限公司；油菜籽粒，购于上海市古棕路菜市场；- 80 ℃ 恒温冰箱、生化培养箱，购于日本三洋公司；Ph = 5.6的沙氏葡萄糖液体培养基、镊子、油菜籽粒、滤纸、1 mL枪头在 1 x 10⁵Pa 高压湿热灭菌 20 min 后备用。

实施例 1

2、实验具体步骤

水霉菌的提取

2.1孢子悬液的制备

将水霉菌（寄生水霉和多子水霉）接种于放有无菌油菜籽的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，于 20 ℃ 恒温条件下培养直至油菜籽上长满菌丝；在六孔板中加入无菌水，将长满菌丝的油菜籽放入六孔板中；然后于 20 ℃ 恒温条件下培养箱中培养，36小时后于显微镜下观察水霉菌丝孢子的释放情况，当孢子数量达到一定量以后，再将菜籽取出。

2.2水霉菌丝的提取

在六孔板中加入沙氏葡萄糖液体培养基，置于 20 ℃ 恒温条件下培养直至长出菌丝；然后用无菌的镊子夹出菌丝，于无菌水中漂洗 3 ~ 4 次，用无菌的滤纸吸取菌丝上的水；将菌丝放入无菌的 1.5 mL EP管中，置于 – 80 ℃ 低温冰箱中保存即可。

实施例 2

3、实验步骤

水霉菌的提取

3.1孢子悬液的制备（同2.1）

3.2水霉菌丝的提取

在六孔板中加入马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基（PDA），置于 20 ℃ 恒温条件下培养直至长出菌丝；然后用无菌的镊子夹出菌丝，于无菌水中漂洗 3 ~ 4 次，用无菌的滤纸吸取菌丝上的水；将菌丝放入无菌的 1.5 mL EP管中，置于 – 80 ℃ 低温冰箱中保存即可。

二、结果与讨论

1.1 表一相同培养时间下液体基培养与PDA固体培养基获得菌丝重量的比较

结果：由表一看出在相同的时间内两种水霉菌丝在沙氏葡萄糖液体培养基上获得菌丝的重量远大于在固体PDA培养基上获得的菌丝的重量，说明沙氏葡萄糖液体培养基上获得菌丝的数量大，且提取比较容易。

1.2表二液体基培养与PDA固体培养基获得等量菌丝（1g）所需时间的比较

结果：由表二看出相同的实验条件不同培养基上培养的两种水霉菌在获得相同重量的菌丝时，沙氏葡萄糖液体培养基上所用的时间最短，相比固体PDA培养基，菌丝的提取也方便。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1. 一种水霉菌丝的提取方法，包括以下步骤：

A）孢子悬液的制备：

将水霉菌（寄生水霉和多子水霉）接种于放有无菌油菜籽的培养基平板上，20℃培养，待水霉菌丝长满油菜籽。

2.然后将长满水霉菌丝的油菜籽置于盛有无菌水的六孔板中，于 20℃ 恒温培养箱中培养2 - 3天；当孢子数量达到 10⁴ /mL个时，取出油菜籽。

3.B）菌丝的提取：

在上述孢子悬液中加入液体培养基，于 20 ℃ 恒温培养箱中直至长出水霉菌丝团，取出菌丝团于无菌水中漂洗，用无菌滤纸吸干菌丝团表面的水，即为水霉菌丝。

4. 根据权利要求1所述的水霉菌丝的制备方法，其特征在于：所述步骤A中所述的固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

5.根据权利要求1所述的水霉菌丝的制备方法，其特征在于：所述步骤B中所述的液体培养基为沙氏葡萄糖液体培养基。

6.根据权利要求1所述的水霉菌丝的提取方法，其特征在于：所述的水霉菌丝是寄生水霉和多子水霉。