CN103460052A - 纸质支持物和从其中回收生物材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于新生儿筛查的纸质支持物,所述纸质支持物用于生物材料的储存和进一步处理。本发明具体地涉及至少一个表面包被有化学品的纸质支持物,所述化学品提高生物材料从所述支持物的回收率。还描述了制备和使用所述纸质支持物的方法。
Description
发明领域
本发明涉及用于新生儿筛查的纸质支持物,特别地涉及可用于储存、回收和进一步处理生物材料例如生物制药药物的的纸质支持物。
发明背景
使用固体支持物例如滤纸来收集和分析人血液可回溯至1960年代早期,当时Robert Guthrie博士为检测苯丙酮尿症而使用干血斑(DBS)样本测定新生儿中的苯丙氨酸(Mei,J.等,2001;Journal of Nutrition,131:1631S-1636S)。这一收集血液的新应用引发了新生儿的群体筛查以检测可治疗的遗传代谢疾病。现在DBS用于筛查大量的新生儿代谢疾病已经40多年了。
DBS样本通过将来自静脉血或直接来自指尖或足跟针刺的全血点在固体支持物例如膜、玻璃纤维或纸上进行收集,使得这种方法特别适合样本从周边诊所运输到中心实验室。此外,包装在带有干燥剂的拉锁(zip-1ock)塑料袋中的DBS能够在室温下储存和运输,因此避免需要i)冷链储存和ii)快速专用运输。通过将血滴涂到吸收材料例如Whatman903新生儿STD纸上收集的DBS不受IATA危险物品规定(IATA Dangerous Goods Regulations)(附录Ⅱ,2005年3月)的管制。
其他用于收集、运输和储存用于婴儿和新生儿筛查目的的DBS和其他体液的固体纸质支持物包括:
1.Ahlstrom226
2.MunktellTFN(CE标记)
3.Toyo Roshi grade545Advantec Toyo,Tokyo(参见Elvers L等2007;J.Inherit Medtab Dis30,4,609)。
所有这些纸,例如Whatman903新生儿STD纸,由棉毛纤维构成。Whatman903新生儿STD纸和Ahlstrom226纸被划分为Ⅱ类医疗卫生器材。有潜力发展为用于婴儿和新生儿筛查目的的器材的固体纸质支持物包括由Macherey Nagel(例如MN818)、Reeve Angel(例如Doublering)和HahnemuhleGrade2292生产的那些固体纸质支持物。
DBS的消耗费用小于1美元/测试,而且与需要液体形态和专用运输条件的血浆相化,运输费用显著下降(Johannessen,A.等,2009;J AntimicrobialChemotherapy,64,1126-1129)。尽管实际测试费用保持未变,并且在中心实验室从DBS提取分析物包含一些额外的操作时间,但DBS和特别的固体纸质支持物的使用正越来越多地用于储存和/或分析生物材料例如核酸、蛋白质等。此外,DBS还被用于药物发现过程中,其中将候选的低分子量药物化合物注入测试动物,并监测血液中的浓度水平。
近年来,生物技术来源的重组蛋白、肽和基于抗体的药物以及用于基因治疗的反义寡核苷酸和DNA已发展成为主流的治疗药剂,并且现在构成临床开发下的化合物的主要部分。这些药剂通常被称为“生物技术药物”或“生物制药药物”,以将其与低分子量药物化合物区分。
生物技术药物和低分子量药物化合物的药物代谢和药代动力学(DMPK)分析很重要,因为DMPK分析对药物发现至关重要,其对候选药物可能如何被机体吸收、代谢和排出提供深入的了解。分析通常在药物发现阶段进行,并包括将目的化合物给予动物和测定生物液体中药物(或代谢物)浓度作为时间函数。这产生了有价值的信息,例如药物清除、生物利用度等,但是需要大量时间和资源(Beaudette,P.等,2004;J.ofChromatography B809,153—158)。
与通常在药物筛选程序中进行的DMPK分析有关的主要问题是明显缺乏合适的用于在分析前保持血液样本稳定性和完整性的储存介质。目前的方法使用在指定时间从给药的动物收集的血浆或全血。然而,这种方法有许多缺陷,包括涉及耗时步骤,其造成分析过程中的瓶颈。此外,对于时程实验,单只动物多次抽血是有限制的。这给高通量带来了限制并增加了动物的使用,其结果是较少的先导化合物能够得以开发。
DBS需要少的血液体积,使得能够从一只动物连续取血,而不是从数只动物混合取血,这显著改善了DMPK和毒理动力学数据和评估的质量。对于“3R”(减少、优化和代替),DBS所需要的减少的血液体积(通常15-20μl/斑点)的伦理学益处在临床前药物研发中是显而易见的。测试动物的数量能够显著降低。此外,在幼年毒理学研究中非末端取血是可能的,当局正逐渐要求幼年毒理学研究作为儿科用药的安全生评估的—部分。调整的动物毒理学研究的另—优点是数据质量的提高。
因此,由于在药代动力学研究中迅速分析大量血液样本的需要的增长,DBS已经成为一个有吸引力的选择。对于作为DBS固体支持物的纸,以下的纸是合乎需要的:所述纸结合了令人满意的力学性能和在稳定状态下保存目的生物材料的能力,以这样—种方法致使其可在储存后经受进一步处理和/或分析。用于DMPK分析的这类纸的实例为被称为903新生儿样本收集纸的那些纸,以及例如在US专利号5,75,126和5,939,259中描述的称为FTA和FTA Elute的那些纸。
为了有效地下游处理和分析,目的分析物(例如内源蛋白质或生物技术药物)必须易于使用符合高通量处理的相对简单的技术从固体纸质支持物提取。
DBS和内源蛋白质检测的组合在科学文献中已有所描述。例如,囊性纤维化病(CF)的生物标志物免疫反应性胰蛋白酶(IT),Ryley等人在1981发表了来自DBS的内源性IT首次报道用于CF筛查(J.Clin,Pathol.34,906-910)。从那以后,使用来自新生儿的DBS,IT已经被常规用作CF指示物。许多商业化机构提供FDA批准的免疫测定试剂盒用于该应用。许多人简单地使用“纸内(paper-in)”的方法,其中含有DBS的纸孔片(punch)直接应用于免疫测定并在原位提取目的分析物。最近(Lindau-Shepard&Pass,2010,ClinicalChem.56,445-450)证实IT以两种不同的同工型存在。这些作者报道开发了一种基于混悬液(或纸内)阵列的免疫测定法用于诊断CF,其利用了IT的两种不同的同工型。所有这些基于蛋白质的研究在未包被的Guthrie卡(Whatman903纸)上进行。
自从匿名人类免疫缺陷(HIV)筛查开始,已经进行了超过120万份的DBS测试,用于在孕妇血液中的内源性抗-HIV抗体的血清学检测。
这些研究已经证实:i)证实关于血液和任何相关目的蛋白的长期储存的担忧是没有根据的;和ii)DBS中存在的血红素不干扰测定进行。
因此,生产为生物材料提供简单、稳定的储存介质的纸质支持物是合乎需要的,所述生物材料包括i)内源性部分和ii)生物制药或生物技术药物,所述纸质支持物在进一步处理中提供生物材料的高产率或回收率。本发明提出这些需求并提供提高从固体纸质支持物上的以DBS储存的生物样本中生物材料例如生物制药药物的回收水平的方法。
定义
本文所用术语“生物材料”意指如下定义的任何“生物分子”、“合成来源的生物分子”、“生物制药药物”或“细胞包组分”:
i)生物分子是由生命体产生的任何有机分子,包括大的多聚体分子例如蛋白质、多糖和核酸,以及小的低分子量分子例如初级代谢产物、次级代谢产物和天然产物。
ii)合成来源的生物分子是采用重组DNA技术产生或通过其他非生命的体外方法化学合成的如上文i)中定义的“生物分子”。
iii)生物制药药物(或“生物技术药物”)是生物技术来源的重组蛋白质、肽或基于抗体的药物,或用于基因治疗的反义寡核苷酸、蛋白质核酸(PNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。
iv)细胞组分是独特的、高度组织化的构成细胞和有机体的一种或多种物质。实例包括膜、细胞器、蛋白质和核酸。同时,细胞组分的大部分位于细胞本身内部,而一些可能存在于生物体的细胞外区域。
发明简述
根据本发明的第一方面,提供—种用于新生儿筛查的纸质支持物,其具有至少一个表面包被有提高生物材料从所述表面的回收率的化学品,其中所述化学品选自聚乙烯醇(PVA)、非离子去垢剂和二糖。
一方面,所述化学品是聚乙烯醇(PVA)。
另一方面,所述非离子去垢剂是Tween20。
又一方面,所述二糖是α-β-海藻糖。
一方面,所述纸质支持物是903新生儿STD纸。
根据本发明的第二方面,提供—种从纸质支持物回收生物材料的方法,包括以下步骤:
i)将上文所述的纸质支持物的表面与包含生物材料的样本接触;
ii)干燥纸质支持物表面上的样本;
iii)储存纸质支持物;和
iv)从所述表面提取生物材料。
一方面,步骤iii)包括在15-40℃的温度范围内储存纸质支持物。优选温度在20-30℃的范围内。另一方面,根据生物材料的热稳定性,将纸质支持物储存在较低的温度。
样本的性质取决于生物材料的来源。例如,所述来源可以是来自一定范围的生物有机体,包括但不限于病毒、细菌、植物和动物。优选所述来源是哺乳动物或人类受试者。对于哺乳动物和人类来源,样本可以选自组织、细胞、血液、血浆、唾液和尿液。
另一方面,所述生物材料选自生物分子、合成来源的生物分子、细胞组分和生物制药药物。
又一方面,所述生物材料是生物制药药物。
根据本发明的第三方面,提供—种制备上文所述的纸质支持物的方法,包括将纸质支持物的至少一个表面用提高生物材料从所述表面的回收率的化学品的溶液包被,其中所述化学品选自聚乙烯醇(PVA)、非离子去垢剂和二糖。
一方面,所述化学品选自聚乙烯醇(PVA)、Tween20和α-β-海藻糖。
根据本发明的第四方面,提供上文所述的纸质支持物在提高生物材料从其中的回收率中的用途。
一方面,所述生物材料是生物制药药物。
附图简述
图1表示从施加到各种纸质基质上的干血斑中外源加入的IL-2的回收率。
图2表示从施加到包被有各种化学品的903新生儿STD纸上的干血斑中外源加入的IL-2的回收率。
发明详述
重组IL—2±载体(R&D Syshems;分别为目录号202-IL-CF-10μg;批次AE4309112和目录号202-IL-10μg;批次AE4309081)以50pg或100pg/μl溶解于不含钙和镁的Dulbecco’s PBS(PAA;目录号H15-002,批次H00208-0673),EDTA抗凝的人、兔或马血(TCS BiOsciences)。
将等份试样(1μl包含0、50或100pg IL-2)施加于下列GE Healihcare滤纸:903新生儿STD卡,目录号10538069,批次6833909W082;DMPK-A卡,目录号WB129241,批次FT6847509;DMPK-B卡,目录号WB129242,批次FE6847609和DMPK-C卡,目录号WB129243,批次FE6847009。在室温和环境湿度下过夜使样本干燥。
用合适大小的Harris Uni-core打孔器(Sigma,目录号Z708860-25ea,批次3110)从各纸质类型打取孔片(直径3毫米)。将单个孔片放入源自人IL-2Quantikine ELISA(R&D Systems,目录号D0250,批次273275)的IL—2微孔板的单独孔中。这些板由小鼠抗IL-2单克隆抗体包被。使用Quantikine试剂盒提供的测试缓冲液(100μl)将IL-2蛋白从纸孔片上洗脱。所有后续步骤都按照Quantikine试剂盒提供的说明书使用“纸内”的方法(直接将纸孔片置入测定缓冲液中并原位直接洗脱分析物)进行。测定完成,使用Thermo ElectronCorporation,Multiskan Ascent在450nm监测微孔板的光密度。通过与已知IL-2浓度的标准曲线比较数值确定IL-2的回收率。对于每一单独的实验制作新的IL-2标准曲线。
另外的实验包括903新生儿STD卡在数种化学溶液(如下文所述)中饱和浸泡之后,将加有IL-2的血液施加到所述卡上。
使用的化学品
下文给出化学品及其来源的列表。
聚乙烯醇(Sigma;目录号P8136,批次039k0147)。
聚乙烯亚胺,含50%于水中(Fluka,目录号P3143,批次29k1492)。
菊粉,含1%于水中(Sigma,目录号12255-100g,批次079F7110)。
Tween20,含1%于水中(Sigma,目录号P7949-100ml,批次109k01021)。
α-β-海藻糖,10mg/ml(Sigma,目录号T0299-50mg,批次128k1337)。
聚乙二醇1000,含1%于水中(Biochemika,目录号81189,批次1198969)。
聚乙二醇200,含1%于水中(Fluka,目录号81150,批次1384550)。
实验结果
当IL-2溶解于EDTA抗凝血中时,903和DMPK-C卡促进该细胞因子的回收率为45-55%,而从DMPK-A和B卡只有2-3%被回收(见表1和图1)。903和DMPK-C卡是基础纸,没有被任何化学品浸泡或包被,而DMPK-A和B卡分别被促进蛋白质、微生物和细胞变性和失活的化学品的专有混合物包被。这些卡被设计为利于核酸的运输和长期储存。因此,使用DMPKA和B卡时发现的低IL-2回收水平实际上可能是存在这些变性试剂和所用的基于ELISA的抗体检测系统的反映。ELISA检测系统要求洗脱的IL-2显示完整的天然结构。
表1-从施加到各种纸质类型的干血斑中外源加入的11-2的回收率。对每种纸质类型,P-值比较±载体。载体的存在对IL-2的回收率没有显著影响(p-值>0.05)。
不考虑所用的纸质类型,当IL-2溶解于PBS中时,没有发现该细胞因子的回收(数据未显示)。在未加IL-2时观察到的IL-2回收水产与本底水平基本相同,这表明EDTA抗凝血中含有的内源性IL-2的量可忽略不计(数据未显示)。
数种化学品用于饱和浸泡903新生儿STD卡,与未浸泡的纸相比,其中的一些呈现出促进提高的IL-2回收水平(p-值<0.05)。对于903新生儿STD卡(表2和图2),与对应的未浸泡的纸所观察到的~45%相比较,化学品例如聚乙烯醇(PVA)、Tween20和α-β-海藻糖促进IL-2回收率平均值升高为>55%。用下列化学品包被903新生儿STD纸对IL-2回收水平具有可忽略不计的影响:聚乙烯亚胺(PED、菊粉、聚乙二醇1000(PEG1000)和聚乙二醇200(PEG200)。
化学品 | IL-2回收率(%) | p-值 |
未浸泡 | 44.9±6.5 | n/a |
聚乙烯醇(PVA) | 62.6±11.2 | <0.05 |
聚乙烯亚胺(PEI) | 41.8±6.0 | >0.05 |
菊粉 | 50.4±7.6 | >0.05 |
Tween20 | 67.1±9.0 | <0.05 |
α-β-海藻糖 | 54.8±8.6 | <0.05 |
聚乙二醇1000(PEG1000) | 42.5±9.1 | >0.05 |
聚乙二醇200(PEG200) | 433±11.0 | >0.05 |
表2-从施加到包被有各种化学品的903新生儿STD纸上的干血斑中外源加入的IL-2的回收率。该表来自2项独立实验(n=6)。P-值比较来自浸泡的纸与未浸泡的903纸的数值。
虽然描述了本发明优选的说明性实施方案,但是本领域技术人员将会认识到本发明可用所述仅用于说明性目的而不是限制性的实施方案之外的其他实施方案实施。本发明仅由所述权利要求限定。
Claims (14)
1.一种用于新生儿筛查的纸质支持物,其具有至少一个表面包被有提高生物材料从所述表面的回收率的化学品,其中所述化学品选自聚乙烯醇(PVA)、非离子去垢剂和二糖。
2.权利要求1的纸质支持物,其中所述化学品是聚乙烯醇(PVA)。
3.权利要求1的纸质支持物,其中所述非离子去垢剂是Tween20。
4.权利要求1的纸质支持物,其中所述二糖是α-β-海藻糖。
5.权利要求1-4中任一项的纸质支持物,其中所述支持物是903新生儿STD纸。
6.—种从纸质支持物回收生物材料的方法,包括以下步骤:
i)将前述权利要求中任一项的纸质支持物的表面与含有生物材料的样本接触;
ii)干燥在所述纸质支持物的所述表面上的所述样本;
iii)储存所述纸质支持物;和
iv)从所述表面提取所述生物材料。
7.权利要求6的方法,其中步骤iii)包括在15-40℃的温度范围内储存所述纸质支持物。
8.权利要求6或7的方法,其中所述样本选自组织、细胞、血液、血浆、唾液和尿液。
9.权利要求6-8中任一项的方法,其中所述生物材料选自生物分子、合成来源的生物分子、细胞组分和生物制药药物。
10.权利要求6-9中任一项的方法,其中所述生物材料是生物制药药物。
11.一种制备权利要求1-5中任一项的纸质支持物的方法,包括将纸质支持物的至少一个表面用提高生物材料从所述表面的回收率的化学品的溶液包被,其中所述化学品选自聚乙烯醇(PVA)、非离子去垢剂和二糖。
12.权利要求11的方法,其中所述化学品选自聚乙烯醇(PVA)、Tween20和α-β-海藻糖。
13.权利要求1-5中任一项的纸质支持物在提高生物材料从其中的回收率中的用途。
14.权利要求1-5中任一项的纸质支持物在提高生物制药药物从其中的回收率中的用途。
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