CN103446583A

CN103446583A - 一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体制剂

Info

Publication number: CN103446583A
Application number: CN2013100930097A
Authority: CN
Inventors: 林键; 包财; 裴树军; 章淑妹; 朱炜; 李胜峰
Original assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Current assignee: Baotai Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-03-21
Filing date: 2013-03-21
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2033-03-21
Also published as: CN103446583B

Abstract

本发明涉及一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，主要为液体含水药物制剂。所述液体含水药物制剂可增强含重组人抗TNF-α单克隆抗体等TNF-α拮抗剂抗体药物的稳定性，延长其在含水制剂中的保存周期。

Description

一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体制剂

技术领域

本发明涉及一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，主要为液体含水药物制剂，该制剂包含的一种成份可以为50mg/ml有效量的抗TNF-α人源抗体，58.75mg/ml己六醇，0.125mg/ml失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯，1.25mg/ml乙酸盐，pH值5.2。该制剂包含的另一种成份也可以为50mg/ml有效量的抗TNF-α人源抗体，12mg/ml己六醇，1mg/ml失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯，1.3mg/ml2-羟基丙羧酸，0.3mg/ml2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸钠，1.5mg/ml二水合磷酸二钠，0.9mg/ml二水合磷酸一钠，6.2mg/ml氯化钠，pH值5.2。该制剂在经过至少4次冻融循环后保存稳定性。主要保存治疗TNF-α相关的人抗体，可用于皮下或者静脉注射使用。

背景技术

类风湿关节炎(RA)是一种常见的关节炎，在人群中的发病率为0.3%～1%，如不及时治疗，可导致骨破坏和关节功能障碍。在RA发病中有多种促炎性细胞因子参与，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素如IL-1,IL-6,IL-8等。因此，抑制促炎性细胞因子的产生或阻断其作用，有望改善关节炎症反应。近年来许多新研究开发的生物制剂可通过阻断或下调炎性细胞因子的活性而达到控制病情的进展，如TNF抑制剂、抗IL-1抗体等，这些生物制剂的主要作用机制有：(1)针对细胞因子或其受体的单克隆抗体；(2)可溶性受体拮抗剂，即不包括跨膜成分和胞内功能区的细胞因子表面受体。该受体拮抗剂可与游离的细胞因子结合，抑制后者与细胞表面受体结合。可溶性受体拮抗剂的半衰期较短，可通过加人某些整合结构如IgG的Fc受体或聚乙烷基乙二醇(polyethylene glycol, PEG)而延长;(3)受体拮抗蛋白，为无生物活性的蛋白质，可与细胞因子竞争结合细胞表面的膜受体。受体拮抗蛋白必须结合90%以上细胞表面受体方认为有效。

目前认为,在诸多RA炎症反应的细胞因子中，TNF是最重要的促炎性细胞因子之一，TNF-α在RA病变的持续发展、局部炎症反应和组织损伤中均起着重要作用。RA中TNF-α和TNFR水平在血清、滑膜以及滑液中均显著升高，特别是病情严重和活动期患者。RA患者血清中TNF-α水平与关节损伤评分、红细胞沉降率(ESR)及贫血呈正相关。TNF-α还与RA患者体重减轻和疾病复发有关。TNF可作用于多种细胞，如促进巨噬细胞分泌炎性细胞因子和趋化因子，促进炎症反应。TNF-α的主要作用是：(1)诱导内皮细胞表达黏附分子和血管内皮生长因子(VEGF)，促进白细胞与血管内皮黏附、渗透，导致局部的炎症反应和血管VEGF生成；(2)作用于肝细胞，产生C反应蛋白(CRP);(3)在类风湿关节炎中TNF-α可分别作用于破骨细胞、滑膜细胞和软骨细胞，导致这些细胞的活化，产生金属蛋白酶、胶原酶、基膜溶解酶(stromelysin)及前列腺素E2（PGE2），进一步破坏软骨引起骨侵蚀、关节炎症和软骨破坏；(4)TNF-α还可促使滑膜细胞、巨噬细胞、纤维母细胞和软骨细胞产生IL-1,IL-8及TNF-α本身而加重组织损伤。因此，抑制TNF-α的作用对控制RA的病情和改善预后非常重要。

目前已被美国FDA批准的TNF-α抑制剂共有3种：可溶性受体拮抗剂-依那西普（Etanercept），人鼠嵌合抗体-英夫利昔单抗（Infliximab）和人源化单抗。Etanercept是重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，由II型TNF受体(p75)与IgG1的Fc部分组成二聚体;Infliximab是针对TNF的特异性IgG1单克隆抗体(由人Ig稳定区和鼠Ig可变区组成的嵌合体);人源化单抗也是特异性针对TNF的IgG1单克隆抗体(Ig的稳定区和可变区均为人源的)。TNF抑制剂的主要不良反应有注射部位反应、感染、肿瘤、淋巴增殖性疾病、神经脱髓鞘病变以及狼疮样综合征。

发明内容

本发明提供一种含水液体药物制剂，所述含水药物制剂包括重组人抗TNF-α单克隆抗体、缓冲液体系、渗透压调节剂、表面活性剂。所述重组人抗TNF-α单克隆抗体是通过基因工程手段，在CHO细胞中表达的，并且通过一系列标准的层析步骤纯化获得的。在制备抗体后，制备药物制剂。

本发明所开发的重组人抗TNF-α单克隆抗体制剂，其中所含的高浓度抗体蛋白更加稳定，更加耐受高温变化引起的聚集反应，因此本发明的抗体制剂可用于保存治疗TNF-α相关的人抗体，增强含重组人抗TNF-α单克隆抗体等TNF-α拮抗剂抗体药物的稳定性，延长其在含水制剂中的保存周期，对于治疗TNF-α相关疾病有重要意义。

附图说明

图1重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406两种制剂的对比研究（Optim1000研究结果）。

图2重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406两种制剂的影响因素试验（高温研究）。

图3重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406两种制剂的皮下注射与静脉注射比较。

图4A受试药物1406对实验小鼠tg197活体关节炎得分的影响。

图4B受试药物1406对实验小鼠tg197活体组织病理学得分的影响。

具体实施方式

具体而言，本发明所提供的制剂为pH4～8的液体含水药物，该制剂包括20～80mg/ml的抗体浓度，并且具有增强含重组人抗TNF-α单克隆抗体等TNF-α拮抗剂抗体药物的稳定性作用。本发明的制剂包括以下成分：能以高亲和力、低解离速度、高中和能力结合人hTNF-α的抗体；缓冲液，包括乙酸盐、2-羟基丙羧酸和磷酸盐缓冲液；渗透压调节剂，包括己六醇；表面活性剂，包括失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯；调节pH的氢氧化钠、氯化钠和注射用水。

在本发明的一种实施方案中，所述抗体在所述液体含水药物制剂中的浓度为大约20～80mg/ml。在另一种实施方案中，所述抗体在所述液体含水药物制剂中的浓度为大约50mg/ml。在另一种实施方案中，所述试剂具有高蛋白浓度，所述试剂不是光敏感的。

本发明还提供了含水的药用组合物，包括乙酸盐缓冲液、己六醇、失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯和注射用水，pH为大约4～8。所述多元醇是己六醇，所述表面活性剂是失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯。

本发明提供液体含水抗体制剂，所述制剂包括多元醇，以便调节液体体系的渗透压，稳定所述抗体。将所述多元醇添加到所述抗体中，其用量可以根据需要的所述制剂的等渗而改变。在本发明制剂的一种优选方案中，被作为渗透压调节剂用在所述制剂中的是己六醇。在本发明的优选方案中，己六醇的浓度为20～80mg/ml，优选浓度约为60mg/ml，具体为58.75mg/ml。在本发明制剂的另一种优选方案中，被作为渗透压调节剂用在所述制剂中的是己六醇。在本发明的优选方案中，己六醇的浓度为8～15mg/ml，最优选浓度约为12mg/ml。

本发明提供液体含水抗体制剂，所述制剂包括表面活性剂。典型的表面活性剂包括非离子表面活性剂，如失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯。表面活性剂能减少所述制备的抗体的聚集和/或减少颗粒在所述制剂中的形成和/或减少吸附。在本发明制剂的一种优选实施方案中，所述制剂以失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯为表面活性剂。在一种优选方案中，所述制剂包括大约0.1～0.5mg/ml的失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯，在另一优选实施方案中，在本发明的制剂中存在大约0.125mg/ml的失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯。在本发明制剂的另一种优选实施方案中，所述制剂以失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯为表面活性剂。在一种优选方案中，所述制剂包括大约0.5～2.0mg/ml失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯，在另一优选实施方案中，在本发明的制剂中存在大约1mg/ml的失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯。

本发明提供液体含水抗体制剂，所述制剂包括缓冲系统，以便将pH保持在大约4～大约8的范围。在本发明制剂的一种优选方案中，缓冲液系统为乙酸盐，在另一种实施方案中，pH范围为大约4.5～6.0，最优选实施方案的pH为5.0～5.2。在本发明制剂的另一种优选实施方案中，缓冲液体系为2-羟基丙羧酸和磷酸盐，在另一种实施方案中，pH范围为大约4.5～6.0，最优选实施方案的pH为5.2。

本发明还提供了含水的药用组合物，包括有效量的抗体成分；乙酸盐或者2-羟基丙羧酸和磷酸盐；包括己六醇；包括失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯；和注射用水，pH为大约4～8。所述抗体成分在液体状态下保质期为36个月。

本发明还提供了含水的药用组合物，包括有效量的抗体成分；乙酸盐或者2-羟基丙羧酸和磷酸盐；包括己六醇；包括失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯；和注射用水，pH为大约4～8。所述制剂在室温下可保存二个月，在2～8℃下保质期为36个月。冷冻本发明的制剂还可以用于进一步延长它的保质期。

本发明提供液体含水药物制剂，包括适合治疗用途的抗体，这种药物制剂便于施用，并且含有高蛋白浓度，主要用于治疗由TNF-α引起的病症。在一种实施方案中，所述药物制剂具有增强了的稳定性。在另一种实施方案中，本发明的制剂在经过至少4次冻融循环后是稳定的。在另一种实施方案中，所述抗体针对人TNF-α。在另一种实施方案中，所述抗体是重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406。

在本发明的另一种实施方案中，所述液体含水药物制剂包括抗体或其抗原结合部分，它是重组抗体或其抗原结合部分，它能抑制人TNF-α诱导的ELAM-1在人静脉内皮细胞上的表达。在另一种实施方案中，所述要求保护的制剂包括重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406。

本发明提供含水的药用制剂，包括有效量的抗体成分，缓冲液体系乙酸盐或者2-羟基丙羧酸和磷酸盐，渗透压稳定剂己六醇，表面活性剂失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯和注射用水，pH为大约4～8。在本发明的一种实施方案中，所述制剂是适合于进行单次皮下注射的，在另一种实施方案中，所述制剂是适合进行静脉注射，两者的药代基本保持一致。在本发明的一种实施方案中，所述抗体在所述液体含水药物制剂中的浓度为大约1～100mg/ml。

在本发明的优选实施方案中，所制试剂是装在管形瓶中的含有表1所示成分的0.8ml的溶液。其中制剂包含的一种成份可以为40mg有效量的hTNF-α抗体、47mg己六醇、0.1mg失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯、1mg乙酸盐，用于调节pH的氢氧化钠和注射用水。其中制剂包含的另一种成份可以为40mg有效量的hTNF-α抗体、9.6mg己六醇、0.8mg失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯、1.04mg 2-羟基丙羧酸、0.24mg 2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸钠、1.2mg二水合磷酸二钠、0.72mg二水合磷酸一钠、4.96mg氯化钠，用于调节pH的氢氧化钠和注射用水。

表1 A.重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406的A制剂成份列表

成分名称	用量	功能
			活性物质：抗体BAT1406	40mg	活性物质
己六醇	47mg	渗透压调节剂
			乙酸盐	1mg	缓冲液
失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯	0.1mg	表面活性剂
			氢氧化钠	0.02～0.04mg	pH调节剂
注射用水	补充至800ul	溶剂

表1 B.重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406的B制剂成份列表

成分名称	用量	功能
			活性物质：抗体BAT1406	40mg	活性物质
己六醇	9.6mg	渗透压调节剂
			失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯	10.8mg	表面活性剂
2-羟基丙羧酸	1.04mg	缓冲液
			2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸钠	0.24mg	缓冲液
二水合磷酸二钠	1.2mg	缓冲液
			二水合磷酸一钠	0.72mg	缓冲液
氯化钠	4.96mg	pH调节剂
			注射用水	补充至800ul	溶剂

综上而言，本发明提供液体含水药物，该制剂包含的一种成份可以为20～80mg/ml的抗体、20～80mg/ml己六醇、0.1～0.5mg/ml的失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯、乙酸盐缓冲液和注射用水，pH为4～8。最优选方案包括50mg/ml的抗体浓度、58.75mg/ml己六醇、0.125mg/ml的失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯、1.25mg/ml乙酸盐，pH为5.0～5.2，调节pH的氢氧化钠和注射用水（以下简称为A制剂）。该制剂包含的另一种成份可以为20～80mg/ml的抗体、8～15mg/ml己六醇、0.5～2mg/m失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯、0.8～2mg/ml 2-羟基丙羧酸、0.1～0.5mg/ml 2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸钠、1.0～2.0mg/ml二水合磷酸二钠、0.5～1.5mg/ml二水合磷酸一钠、5.0～8.0mg/ml氯化钠，注射用水，pH为4～8。最优选方案包括50mg/ml的抗体、12mg/ml己六醇、1mg/ml失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯、1.3mg/ml 2-羟基丙羧酸、0.3mg/ml 2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸钠、1.5mg/ml二水合磷酸二钠、0.9mg/ml二水合磷酸一钠、6.2mg/ml氯化钠，pH值5.0～5.2（以下简称为B制剂）。

本发明的制剂在经过至少4次冻融循环后是稳定的。该含水药物制剂能够并且在室温下保存2个月，在2～8℃下保存36个月，在冷冻条件下可延长保质期。所述液体含水药物制剂主要用于治疗由TNF-α引起的病症。所述制剂不仅适合单次皮下注射，还适合进行静脉注射。所述液体含水药物制剂可增强含重组人抗TNF-α单克隆抗体等TNF-α拮抗剂抗体药物的稳定性，延长其在含水制剂中的保存周期。

实施例

以下实施例是对本发明的进一步阐明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。本发明引用的所有文献及专利收做本文参考。

实施例1：制剂的制备

本发明的A制剂中含水药物制剂是按照以下方法制备的。

用于所述制剂中的材料包括：己六醇、乙酸盐、失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯、氢氧化钠(以1M形式提供以便调节溶液的pH)、抗体物质、注射用水。

制备10L缓冲液

称量出以下重量的成分：587.5g己六醇、12.5g乙酸盐、1.25g失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯和注射用水。将氢氧化钠溶解在注射用水中使其成为1M的溶液。

将先前称好的成分溶解在大约90%的注射用水中制备缓冲液：己六醇、乙酸盐、失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯。业已证明，添加缓冲液成分的顺序并不会影响制剂质量，可随意选择。

在添加上述所有缓冲液成分之后，添加1M的氢氧化钠调节pH，最后添加最终体积的水，然后通过0.22um孔径，亲水性聚偏二氟乙烯的过滤膜，过滤膜可将缓冲液过滤到无菌容器中。所使用的过滤介质是过滤消毒的氨气。

制备20L制剂

然后将过滤的缓冲液添加到抗体浓缩物中。在制备所述抗体药物制剂之前在水浴中对所述抗体浓缩物进行解冻。在搅拌状态下添加所述缓冲液到含1.0kg总蛋白的抗体浓缩物，直到达到总溶液的最终重量。

然后按照上述方法，通过过滤对包含它的所有成分的制剂进行过滤，所不同的是所述制剂是通过两层无菌0.22μm的膜过滤器过滤的。在消毒之后，对所述试剂进行包装，以便在管形瓶或预先填充的注射器中使用。

技术人员还可以理解的是，本文所提到的重量和/或重量与体积比可以利用所述成分的公知的分子量换算成摩尔和/或摩尔浓度。本文所列举的重量是用于所述体积的。技术人员可以理解的是，在需要不同的制剂体积时，可以成比例地调整所述重量。例如16L、14L、12L、10L、5L制剂分别包括80%、70%、60%、50%、25%的所列举的重量。另一种制剂（B制剂）的制备方式同A制剂的制剂类似，所称取的药品和重量相对应即可。

实施例2：冻/融研究

制剂冻融实验-1：分别制备BAT1406抗体制剂（A、B制剂）的低浓度样品LOQ（1mg/mL）、中浓度样品MOQ（10mg/mL）、高浓度样品HOQ（100mg/mL）存放在-80℃冰箱中，反复冻融4次，考察四次冻融后样品的稳定性。样品分别稀释1×10⁶倍进行Elisa检测，每种稀释度的抗体分别加样5个孔，测定的回收率和精密度列于表2。

表2 重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406两种制剂的冻/融实验结果

结果表明BAT1406抗体制剂（A制剂）三个浓度的样品4次冻融后，其回收率范围为94.2～114.2%，精密度范围为10.4～22.5%，BAT1406抗体制剂（B制剂）三个浓度的样品4次冻融后，其回收率范围为93.4～113.2%，精密度范围为11.7～26.6%，说明抗体制剂在冻存条件下，反复冻融4次，其稳定性基本满足实验要求。

制剂冻融实验-2：将药物制剂（A、B制剂）从冷冻状态转变成液体状态循环4次，评估蛋白浓度为50mg/ml的BAT1406抗体药物的冻融表现。表3表示在有和没有表面活性剂的条件下，制剂（A、B制剂）分别从-80℃或-20℃开始评估4次快速和慢速冷/融循环的效果的实验结果。结果表明BAT1406抗体药物制剂可以解冻/冷冻至少4次，而对化学物理化学特性或者生物活性不产生任何有害的作用。结果还表明了添加表面活性剂，有助于BAT1406抗体药物的物理化学特性的改善，表现为无论是快慢速或快速冻/融循环，都具有较少数量的只有在显微镜下才能看到的颗粒；体外中和TNF试验亦表明其生物学活性未受影响。活性检测方法参考Anthony Meager的方法（参见Anthony Meager. Measurement of cytokines by bioassays:Theory and application.Methods,2006;38:237-252；Human antibodies that bind human TNF-α,专利号：6090382），具体方法如下：取对数生长期的L-929，接种于96孔板中，8000 cells/孔/100ul。第2天，用含10%FBS和rhTNF-α（浓度1ng/ml）的培养基稀释1406抗体、hIgG阴性对照组（起始浓度为0.75ug/ml，以1/3稀释浓度往下稀释，每个浓度设2个复孔，共设立10个梯度）。混匀，室温下共孵育30分钟后，再加入5ug/ml的放线菌素D，使其浓度达到0.2ug/ml。混匀，把上述混合物加到L-929细胞中，100ul/孔（终体积为200ul/孔，抗体、rhTNF-α和放线菌素D对应终浓度减半），37℃/5%CO2培养箱中培养24小时。24小时后，将板中的培养基甩掉，加入新鲜培养基100ul/孔，加入10ul/孔的CCK-8，37℃、5%CO2培养箱中继续培养4小时，OD450读数。计算1406抗体的ED50。

表3A 重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406的制剂A冻/融实验结果

+=具有失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯的制剂

-=没有失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯的制剂

表3B 重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406的制剂B冻/融实验结果

+=具有失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯的制剂

-=没有失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯的制剂

实施例3：室温条件下稳定性考察

室温稳定性研究-1：制备BAT1406抗体制剂（A、B制剂）的低浓度样品LOQ（1mg/mL）、中浓度样品MOQ（10mg/mL）、高浓度样品HOQ（100mg/mL），置于室温条件下保存2个月，样品分别稀释1×10⁶倍进行Elisa检测，每种稀释度的抗体分别加样5个孔，测定的回收率和精密度结果见表4，结果表明BAT1406抗体制剂（A制剂）低、中、高三个浓度的制剂样品室温放置2个月，回收率范围为80.2～97.9%，精密度为8.3～14.1%。BAT1406抗体制剂（B制剂）低、中、高三个浓度的制剂样品室温放置2个月，回收率范围为81～94.8，精密度为7.1～14.1%。说明抗体制剂在室温中可稳定存放2个月，日间准确度及精密度满足实验要求。结果见表4.

表4 重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406两种制剂的室温条件下2个月稳定性考察

室温稳定性研究-2：将50mg/ml BAT1406抗体制剂（A、B制剂）保存在室温下，进行体外TNF中和试验（L-929生物活性检测），稳定性研究时间周期为60天，每个样品重复3次。结果见表5，结果表明两种制剂下BAT1406抗体的生物活性基本保持不变。

表5 重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406两种制剂的室温下活性检测结果

实施例4：长期活性保存活性检测

将50mg/ml BAT1406抗体制剂（A、B制剂）保存在4℃冰箱中，进行L-929生物活性检测，时间周期为36个月，每个样品重复3次。结果见表6。结果表明本发明的制剂至少有36个月的保质期。

表6 重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406两种制剂的长期保存活性检测结果

实施例5：微生物研究

需要对药物制剂（A、B制剂）进行微生物研究，以便确定所述制剂是否能支持微生物生长。通过用微生物（例如，金黄色葡萄球菌，ATDD-NO.:6538p,白色念球菌，ATDD-NO.:10231，黑曲霉，ATDD-NO.:16404，环境分离物）在低水平（NMT100cfu/ml）下直接接种所述无菌制剂，然后检查接种过的制剂的总体微生物生长。评价的指标主要有显微镜下微生物的数目以及浊度的变化，其中，浊度的缺乏是没有总体生长的指标，并且在14天之后在接种的容器中检测。另外，从这些容器中不能重新分离到微生物。表7表明，如果在室温20-25℃保存14天，所述制剂不支持微生物生长。

表7 重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406两种制剂的微生物检测

-=浊度不变

实施例6：制剂对比研究

百奥泰生物科技（广州）有限公司开发的重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406的A制剂配方（0.8ml）包括50mg/ml的BAT1406抗体，58.75mg/ml己六醇，0.125mg/ml的失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯，1.25mg/ml乙酸盐，注射用水，pH5.2。B制剂配方为（0.8ml）包含BAT1406抗体40mg，氯化钠4.93mg，二水合磷酸一钠0.69mg，二水合磷酸二钠1.22mg，2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸钠0.24mg，2-羟基丙羧酸1.04mg，己六醇9.6mg，失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯0.8mg，注射用水，pH5.2。

使用超低量蛋白分析系统（Optim1000）仪器进行百奥泰生物科技（广州）有限公司开发的重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406的制剂研究，其检测原理为使用266nm和473nm的散射光峰用于计算蛋白质分子聚集能力Tagg值，中间的荧光光谱（350nm/330nm）是266nm光源激发后，蛋白质发射的全光谱的荧光光谱，用于计算蛋白质分子的变性温度Tm值。散射光计算方式主要是光强度为指标，内源荧光计算方式以荧光光谱强度和最大发射波长漂移为指标。当抗体蛋白质分子处于溶液中时，通常芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe会处于蛋白质分子的内部疏水区，当分子空间结构变化时，暴露在亲水极性环境中，由于温度和溶剂淬灭作用，一般特征荧光强度降低，最大发射峰位红移，荧光强度和红移的变化程度可用来衡量蛋白质分子发生去折叠或变性的程度。通过使用Avacta公司的超低量蛋白分析系统（Optim1000）仪器进行两种制剂比较，结果（见图1）表明A制剂处方的蛋白质分子聚集能力Tagg为69.4℃，变性温度Tm为70℃；B制剂处方的蛋白质分子聚集能力Tagg为61.2℃；变性温度Tm为66.9℃。两者的Tagg温度相差8℃，Tm相差3℃，证明A制剂处方下重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406蛋白可能更加稳定，更加耐受温度变化引起的聚集反应。

通过影响因素试验（高温研究）对两种制剂进行比较，分别在设定温度55℃，相对湿度25%的条件下，对50mg/ml的两种制剂进行对比研究，在第0、1、2、3、6、9天共六次分别取样并采用非还原蛋白电泳法考察目的蛋白结构变化情况，从而判断相同的抗体在不同制剂条件下的蛋白聚集情况。结果表明（见图2）A制剂处方下（对应为lane4、8、12、16、20、24）的目标蛋白发生产品聚合和降解情况都少于其他配方，包括B制剂处方（对应lane 2、6、10、14、18、20），并始终无多聚体出现。证明A制剂处方下重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406蛋白可能比B制剂处方下更加稳定。

实施例7：皮下注射与静脉注射比较

分别对SD大鼠进行A制剂和B制剂的皮下注射和尾静脉注射，比较两种制剂在SD大鼠体内的药物代谢情况。首先，称量动物体重（平均重量100g/只），按32mg/kg计算每只大鼠所需要的抗体量，每只大鼠注射量约为3.2mg抗体（每组给药方式3只SD大鼠，合共12只大鼠）。然后，注射抗体前，先剪SD大鼠尾部取0h的血液，-80℃冻存备用。其次，注射抗体后，在1h、4h、24h、48h、72h、96h、7day、9day、11day、13day、15day、22day、29day、36day、43day分别剪SD大鼠尾部取血样，-80℃冻存备用。然后通过ELISA检测血液中抗体浓度，对数据进行平均并分析，从而评价药物在不同制剂条件下使用不同的注射方式（皮下和静脉）的差别。结果表明（见图3）重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406蛋白在两种制剂条件下，对SD大鼠进行皮下注射或者静脉注射，BAT1406蛋白的药物代谢情况基本保持一致。证明两种制剂除了可以进行皮下注射，还可能适用于静脉注射。

实施例8：重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406蛋白序列

一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体为重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406，是通过基因工程手段，在CHO细胞中表达的，并且通过一系列标准的层析步骤纯化获得的。BAT1406属于IgG抗体，分子量为148kDa，由2条IgG1^z,a重链和2条κ轻链组成。每条重链含有451个氨基酸，分子量为49kDa，其重链氨基酸序列如表8；每条轻链含有214个氨基酸，分子量为24kDa，轻链氨基酸序列如表9。

表8 重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406重链氨基酸序列

＞BAT14O6-heavy chain-45laa

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTTDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTTSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYTSDIAVEW/ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

表9 重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406轻链氨基酸序列

＞BATt406-lightChain-2l4aa

DIQNITQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDYATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

实施例9：重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406的表达和纯化

参照Wood et al.,J Immunol.145:3011(1990)等的方法，特异性结合TNF-α的单克隆抗体抗TNF-α抗体在CHO细胞表达。含抗体基因的表达载体用常规的分子生物学方法构建（Molecular Cloning），以CHO-k1细胞(ATCCCCL61)的一种衍生细胞系作为宿主细胞表达。高产稳定细胞系的构建过程简单描述如下：宿主细胞悬浮生长于CD-CHO培养基（Gibco,CA），取处于对数生长期的宿主细胞离心，重悬于新鲜的CD-CHO培养基，计数并调节细胞密度到1.43×10⁷个/毫升，取600ul上述细胞悬液加入电击杯，然后加入已线性化的质粒40ug，(用移液枪吸打使细胞与质粒混合均匀。用Bio-rad电转仪电击转化，仪器参数设定为：电容：960uFD,电压：300V。通常电击时间为15-20毫秒为正常。把电击后的细胞立即重悬于37℃预热的CD-CHO培养基)，每孔100ul分装于96孔板，2-3天后加入等量的筛选培养基(CD-CHOmedia+50uMMSX)。测定96孔板细胞培养上清来测定抗体的表达水平。表达水平较高的克隆从96孔板转移到24孔板，待细胞生长到一定数量，把细胞转入6孔板，使每孔5ml培养基含2×10⁵个细胞，测定细胞的抗体产量和产率。通常20-30个克隆被转到摇瓶做进一步评价。最后5-8个表达量最高的克隆进行亚克隆和进一步的表达检测。收获料液，通过低速离心使细胞和培养基分离，把离心上清高速离心进一步澄清。用蛋白A亲和纯化和离子交换纯化，使用的介质分别是GE公司生产的Mab Select SuRe和Capto S。

实施例10：重组抗体BAT1406的生物学活性研究

药理学研究主要进行了重组人抗TNF-α单克隆抗体在体外药效试验和体内动物模型的药效学研究。其中体外试验主要进行下面几个方面的药效学检测：与TNF的结合能力，抗体特异性、对TNF与受体结合的竞争性，对TNF-α生物学活性的抑制作用以及细胞毒实验等。以抗体特异性结合为例，比较重组人抗TNF-α单克隆抗体与TNF-α的特异性结合能力。具体实验方法如下：首先用PBS将rhTNF-α、rhTNF-β或者rmTNF-α稀释成50ng/50μl，将稀释好的rhTNF-α、rhTNF-β或者rmTNF-α加到微量96孔酶标板中，50μl/孔，4℃过夜。次日用含3%BSA的PBS封闭，100μl/孔，置37℃2小时。弃上清后，然后往对应孔中分别加入不同浓度的重组人抗TNFα单抗BAT1406和人IgG（抗体终浓度为60.75ug/ml，3倍稀释，10个梯度，复孔），37℃下作用2小时。弃上清后，PBST洗板5次，拍干。然后以1：10000加入羊抗人AP二抗，50μl/孔，37℃2小时。弃上清后，PBST洗板8次，加入PNPP显色液，50μl/孔。OD405读数，作标准曲线。结果表明不同浓度的重组人抗TNFα单抗,BAT1406对rhTNF-α有特异性结合并呈现浓度梯度结果，结果保持一致；但是不同浓度的重组人抗TNFα单抗BAT1406对rhTNF-β或者rmTNF-α没有特异结合。阴性对照人IgG对rhTNF-α、rhTNF-β或者rmTNF-α都没有特异结合，证明了BAT1406只与rhTNF-α结合（IC50=3×10^-9M），而不与rhTNF-β和rmTNF-α结合。

动物体内药效学评价主要进行了急性动物模型和慢性动物模型。其中急性动物模型为D半乳糖敏感小鼠和rhTNF-α诱导的家兔发热模型。以腹腔注射1μg rhTNF-α+20mg D-半乳糖胺的小鼠为研究模型，研究重组人抗TNF-α单抗BAT1406拮抗rhTNF-α和D-半乳糖胺的毒性作用，验证了重组人抗TNF-α单克隆抗体注射液具有拮抗1μg rhTNF-α+20mg D-半乳糖胺的毒性作用，提高小鼠存活率的作用。根据rhTNF-α诱导的家兔发热基础体温值变化的模型，实验表明重组人抗TNF-α单抗BAT1406具有拮抗rhTNF-α诱导的兔体温升高作用。

慢性动物模型为人可溶性TNF转基因鼠（Tg197）自发性多发性关节炎模型。利用Tg197（稳定表达sTNF）转基因小鼠模型，可进行重组人抗TNF-α单抗BAT1406的体内药效评价。本研究采用的注射方式是腹腔注射，腹腔内注射的给药方案的确定主要是参考了其他抗TNF-α单克隆抗体在tg197小鼠试验中的历史数据，转基因小鼠分为5组(G1-G5)，每组含不同年龄和性别的8只小鼠。为了防治关节炎，在形成关节炎之前，从第三周开始，按10ul/g体重的用量，每周注射两次实验品，到第十周为止。为控制病变开始时的组织病理学状态，另增加一对照组转基因小鼠（4只），该组在第一次用药前处死。所有动物在第十周都处死，收集血清和踝关节。血清贮存于-80℃以便做进一步分析，踝关节用于病理学评估。关节炎病变程度采用评分系统，组织病理学评估采用病理学评分系统。实验结果表明实验产品BAT1406在3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg的剂量范围内，大部分符合Tg197关节炎病理学和活体抑制效果的典型药剂应答。10mg/kg和30mg/kg剂量的BAT1406在活体组织病理学的关节炎病理学和组织病理学上都具有很好的抑制效果，统计学上无差异，所获得的分数都比治疗前低，可证明BAT1406抗体在tg197关节炎模型上有治疗效果（见图4）。

Claims

1.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于：

一种液体含水药物制剂，其包含

（1）20～80mg/ml有效量的抗TNF-a人源抗体，

（2）20～80mg/ml己六醇，

（3）0.1～0.5mg/ml失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯，

（4）0.5～2.5mg/ml乙酸盐，

（5）注射用水，

（6）pH约为4～8，

其中抗TNF-a人源抗体为重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406。

2.权利要求1中，抗TNF-a人源抗体浓度为40～60mg/ml，优选为50mg/ml。

3.权利要求1中，己六醇浓度为55～65mg/ml，优选为58.75mg/ml。

4.权利要求1中，失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯浓度为0.1～0.2mg/ml，优选为0.125mg/ml。

5.权利要求1中，乙酸盐浓度为1.0～2.0mg/ml，优选为1.25mg/ml。

6.权利要求1中，pH值为5.0～5.4，优选为5.2。

7.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于：

一种液体含水药物制剂，其包含

（1）50mg/ml有效量的抗TNF-a人源抗体，

（2）58.75mg/ml己六醇，

（3）0.125mg/ml失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯，

（4）1.25mg/ml乙酸盐，

（5）注射用水，

（6）pH约为5.2，

其中抗TNF-a人源抗体为重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406。

8.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于：

一种液体含水药物制剂，其包含

（1）20～80mg/ml有效量的抗TNF-α人源抗体，

（2）8～15mg/ml己六醇，

（3）0.5～2.0mg/ml失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯，

（4）0.8～2.0mg/ml2-羟基丙羧酸，

（5）0.1～0.5mg/ml2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸钠，

（6）1.0～2.0mg/ml二水合磷酸二钠，

（7）0.5～1.5mg/ml二水合磷酸一钠，

（8）5.0～8.0mg/ml氯化钠，

（9）注射用水，

（10）pH约为4.0～6.0，

其中抗TNF-α人源抗体为重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406。

9.权利要求8中，抗TNF-α人源抗体浓度为40～60mg/ml，优选为50mg/ml。

10.权利要求8中，己六醇浓度为11～13mg/ml，优选为12mg/ml。

11.权利要求8中，失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯浓度为0.8～1.2mg/ml，优选为1.0mg/ml。

12.权利要求8中，2-羟基丙羧酸浓度为1.0～1.5mg/ml，优选为1.3mg/ml。

13.权利要求8中，2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸钠浓度为0.2～0.4mg/ml，优选为0.3mg/ml。

14.权利要求8中，二水合磷酸二钠浓度为1.2～1.8mg/ml，优选为1.5mg/ml。

15.权利要求8中，二水合磷酸一钠浓度为0.8～1.0mg/ml，优选为0.9mg/ml。

16.权利要求8中，氯化钠浓度为6.0～6.5mg/ml，优选为6.2mg/ml。

17.权利要求8中，pH值为4.8～5.5，优选为5.2。

18.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于：

一种液体含水药物制剂，其包含

（1）50mg/ml有效量的抗TNF-α人源抗体，

（2）12mg/ml己六醇，

（3）1mg/ml失水聚氧乙烯(20)山梨糖醇油酸酯，

（4）1.3mg/ml2-羟基丙羧酸，

（5）0.3mg/ml2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸钠，

（6）1.5mg/ml二水合磷酸二钠，

（7）0.9mg/ml二水合磷酸一钠，

（8）6.2mg/ml氯化钠，

（9）注射用水，

（10）pH约为5.2，

其中抗TNF-a人源抗体为重组人抗TNF-α单克隆抗体BAT1406。

19.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于如权利要求1～18中，所述抗体针对TNF-α。

20.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于如权利要求1～18中，所述抗体或其抗原结合部分，能结合人TNF-α，并且是重组人抗TNF-α单克隆抗体或其抗原结合部分。

21.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于如权利要求1～18中，主要用于制备治疗其中由TNF-α引起的病症的药物。

22.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于如权利要求1～18中，不仅适合于进行皮下注射，还适合进行静脉注射，药代基本保持一致。

23.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于如权利要求1～18中，该制剂能够增强含重组人抗TNF-α单克隆抗体等TNF-α拮抗剂抗体药物的稳定性，延长其在含水制剂中的保存周期。

24.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于如权利要求1～18中，该制剂能够并且在室温下保存二个月。

25.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于如权利要求1～18中，该制剂在2-8℃下保存36个月。

26.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于如权利要求1～18中，该制剂在冷冻条件下延长保质期。

27.一种治疗TNF-α相关疾病的人抗体的制剂，其特征在于如权利要求1～18中，该制剂在至少4次冻融循环后保存稳定性。