CN103436640A - 由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，制备步骤为：将以[→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为1.0%~15%的水溶液，在搅拌状态下加入0.1-1.0mol/L酸溶液，调节溶液的pH值到1.5-3.5，20-90°C恒温水浴下水解1-6小时；碱中和，醇沉，去除未降解的甘露糖主链；2000g-6000g离心10-30分钟，上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；用低压柱色谱进行分离，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即可。本发明简化了工艺操作并提高了寡糖的制备效率。
Description
技术领域
本发明涉及由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法。
背景技术
糖类化合物广泛存在于自然界，具有非常重要的生物活性，在许多生理和病理过程中扮演着十分重要的角色。在自然界发现的糖类化合物中，吡喃型寡糖分布广泛，其生物学研究及合成制备发展十分迅速。相对于吡喃型寡糖，呋喃型寡糖的研究滞后许多。有关呋喃型寡糖的生物合成过程和新陈代谢机制尚未得到完全的阐释；而有关呋喃型寡糖的制备则更为少见，且不成熟。
含呋喃型结构的寡糖主要来源于细菌、真菌、植物和原生动物等。这类寡糖是构成上述生命体的细胞壁糖肽、糖脂、糖蛋白等的重要生物分子，起到结构支撑和信息传递作用。呋喃型半乳糖最主要的存在形式是D-半乳糖，具有两种糖苷键构型，即α-和β-；其中，β-D-呋喃型半乳糖（β-D-Galf）分布于许多致病和非致病性的微生物以及一些多细胞生物中。
研究显示，分支杆菌的存活能力和致病性与β-D-Galf糖基密切相关；半乳呋喃糖基转移酶，有望成为治疗细菌感染的新靶点。含有β-D-Galf糖基的糖类化合物在革兰氏阴性菌中比较常见，这些糖基存在形式包括[→2)β-D-Galf(1→]、[→3)β-D-Galf(1→]、[→5)β-D-Galf(1→]和[→6)β-D-Galf(1→]。研究表明，曲霉属和青霉属真菌的胞外多糖中主要存在[→5)β-D-Galf(1→]连接的糖基侧链，而糖基主链一般由[→2) α-D-Manp(1→] 和[→6) α-D- Manp(1→]构成。此外，一些微型藻类中也含有β-D-Galf糖基的糖化合物。综上所述，β-D-Galf糖基寡糖的制备十分必要和有意义。
近些年，呋喃型寡糖的合成研究也有了一定的突破。一般是采用糖苷化反应将糖基片段连接起来，在采用选择性脱除保护基，进行下一步连接，即逐步增加糖链的长度。目前，有机合成的[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的最大聚合度仅为4。在寡糖合成的过程中，因涉及羟基的保护和脱保护、糖残基间的选择性连接以及因定位修饰遇到的立体构型等系列问题，其技术难度较大、得率低、合成成本高、安全性差。
发明内容
本发明针对以上不足之处，提供了一种由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，简化了工艺操作并提高了寡糖的制备效率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
A、多糖降解：将以[→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为1.0%~15%的水溶液，在搅拌状态下加入0.1-1.0 mol/L酸溶液，调节溶液的pH值到1.5-3.5，20-90 °C恒温水浴下水解1-6小时；
B、中和、浓缩：将上述溶液用碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
C、醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的醇，在4°C ——25°C下醇沉12小时，去除未降解的甘露糖主链；
D、离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在2000-6000g的条件下离心10-30分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
E、分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即可。
进一步的所述低压柱色谱分离以0.1-0.5mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Bio-Gel P4、Bio-Gel P6或Superdex 30为色谱柱填料。
进一步的所述酸为盐酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、甲酸、乙酸、抗坏血酸、草酸、柠檬酸、氯乙酸、三氯乙酸和三氟乙酸中的任一种；所述碱是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵或碳酸氢氨中的任一种；所述醇是甲醇、乙醇或异丙醇中的任一种。
本发明的有益效果是：
本发明采用酸降解法，得到具有不同聚合度的且性能结构稳定的[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖，此法只需要采用简单的无机酸或者有机酸降解即可得到系列寡糖混合物，该混合物再经简单的低压柱色谱分离，便可得到纯品寡糖单体，操作简单，大大简化了寡糖的制备工艺，且该法无三废污染，制备效率高；
本发明采用Bio-Gel P4、Bio-Gel P6或Superdex 30填料进行寡糖混合物分离，一次分离即可得到聚合度为2-10的[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖；
本发明采用碳酸氢铵作为流动相，克服了寡糖单体制备中后续除盐的困难，缩短了时间并提高了产品的品质和得率；
本发明克服了现有合成技术难以快速制备大量[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的困难，且所得寡糖的聚合度（2-10）较现有报道的合成的该类型的寡糖的聚合度（2-4）提高了一倍有余，为进一步开展寡糖及其衍生物的构效关系和分子机制研究、尤其是指导寡糖类新药的研究与开发方面，都具有重要的现实意义。
附图说明
图1为本发明制备[→5)β-D-Galf(1→] 半乳寡糖的低压柱色谱分离图；
图2为本发明制备所得四聚糖钠盐的电喷雾离子化质谱图及碎片归属；
图3为本发明制备所得五聚糖的一维核磁共振波谱图；
图4为本发明制备所得五聚糖的二维核磁共振波谱图；
图5为本发明制备所得半乳寡糖的结构通式；
图6所示是NMR实验得出A4的结构式。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述：
实施例1
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将以 [→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为1.0%的水溶液，在搅拌状态下加入0.1mol/L盐酸溶液，调节溶液的pH值到1.5，20°C恒温水浴下水解6小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用氢氧化钠碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的醇，在4°C 下醇沉12小时，去除未降解的甘露糖主链；
（4）离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在2000g的条件下离心30分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为1.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.1mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Bio-Gel P4为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
实施例2
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将以 [→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为7.0%的水溶液，在搅拌状态下加入0.55 mol/L硫酸溶液，调节溶液的pH值到2.5，55°C恒温水浴下水解3.5小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用氢氧化钾碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的乙醇，在14°C下醇沉12小时；
（4）离心、浓缩：：将上述醇沉后的溶液在3000g的条件下离心20分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为1.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.3mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Bio-Gel P6为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
实施例3
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将以 [→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为15%的水溶液，在搅拌状态下加入1.0 mol/L亚硫酸溶液，调节溶液的pH值到3.5，90°C恒温水浴下水解1小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用氢氧化铵碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的异丙醇，在25°C下下醇沉12小时；
（4）离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在4000g的条件下离心15分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为1.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.5mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Superdex 30为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
实施例4
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将以 [→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为1.0%的水溶液，在搅拌状态下加入0.1mol/L硝酸溶液，调节溶液的pH值到1.5，20°C恒温水浴下水解6小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用碳酸氢氨碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的甲醇，在4°C下醇沉12小时；
（4）离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在6000g的条件下离心10分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为1.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.1mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Bio-Gel P4为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
实施例5
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将以[→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为15%的水溶液，在搅拌状态下加入1.0 mol/L亚硝酸溶液，调节溶液的pH值到2.5，90 °C恒温水浴下水解1小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用氢氧化钾碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的乙醇，在4°C下醇沉12小时；
（4）离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在2000g的条件下离心30分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为1.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.5mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Bio-Gel P6为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
实施例6
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将以 [→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为7.0%的水溶液，在搅拌状态下加入0.55mol/L甲酸溶液，调节溶液的pH值到1.5，60°C恒温水浴下水解5小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用氢氧化钠碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的异丙醇，在室温下醇沉12小时；
（4）离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在6000g的条件下离心10分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为1.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.4mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Superdex 30为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
实施例7
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将以 [→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为6%的水溶液，在搅拌状态下加入1.0 mol/L乙酸溶液，调节溶液的pH值到1.5，50°C恒温水浴下水解3小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用氢氧化钾碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的甲醇，在10°C下醇沉12小时；
（4）离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在4000g的条件下离心15分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为1.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.5mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Bio-Gel P4为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
实施例8
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将以[→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为1.0%的水溶液，在搅拌状态下加入0.1mol/L抗坏血酸溶液，调节溶液的pH值到3.5，20°C恒温水浴下水解6小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用氢氧化钠碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的甲醇，在4°C下醇沉12小时；
（4）离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在3000g的条件下离心20分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为2.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.1mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Bio-Gel P4为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
实施例9
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将以[→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度7.0%的水溶液，在搅拌状态下加入0.55 mol/L草酸溶液，调节溶液的pH值到2.5，55°C恒温水浴下水解3.5小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用氢氧化钾碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的乙醇，在14°C下醇沉12小时；
（4）离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在6000g的条件下离心10分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为1.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.3mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Bio-Gel P6为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
实施例10
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将以[→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为15%的水溶液，在搅拌状态下加入1.0 mol/L柠檬酸溶液，调节溶液的pH值到3.5，90°C恒温水浴下水解1小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用氢氧化铵碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的异丙醇，在25°C下醇沉12小时；
（4）离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在2000g的条件下离心30分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为1.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.5mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Superdex 30为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
实施例11
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将以[→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为1.0%的水溶液，在搅拌状态下加入0.1mol/L氯乙酸溶液，调节溶液的pH值到1.5，20°C恒温水浴下水解6小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用碳酸氢氨碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的甲醇，在4°C下醇沉12小时；
（4）离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在6000g的条件下离心10分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为1.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.1mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Bio-Gel P4为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
实施例12
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将 [→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为15%的水溶液，在搅拌状态下加入1.0 mol/L三氯乙酸溶液，调节溶液的pH值到1.5，90 °C恒温水浴下水解1小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用氢氧化钾碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的乙醇，在4°C下醇沉12小时；
（4）离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在2000g的条件下离心30分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为2.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.5mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Bio-Gel P6为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
实施例13
由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，包含有如下步骤：
（1）多糖降解：将以[→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为7.0%的水溶液，在搅拌状态下加入0.55mol/L三氟乙酸溶液，调节溶液的pH值到3.5，60°C恒温水浴下水解5小时；
（2）中和、浓缩：将上述溶液用氢氧化钠碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
（3）醇沉：将上述将上述浓缩后的溶液加入将上述浓缩后溶液4倍体积的异丙醇，在室温下醇沉12小时；
（4）离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在2000g的条件下离心30分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
（5）分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，所述色谱柱的规格为1.6cm×90cm，所述低压柱色谱分离以0.4mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Superdex 30为色谱柱填料，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即得九种[→5)β-D-Galf(1→]寡糖的理论分子量依次为342.1、504.2、666.3、828.4、990.5、1152.6、 1314.7、1476.8和1638.9道尔顿。
上述实施例中所制得的寡糖是一种由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖，所述半乳寡糖的聚合度为2-10，所述分子通式为C6n+12H10n+22O5n+11, 式中n=0-8，结构通式如图5所示。
将上述实施例中制备的寡糖采用串联质谱法验证分子量及结构，如图2所示，可见聚合度为4的寡糖一级质谱显示[M+Na]+峰（图2A），二级质谱碎片如图2B所示，二级质谱碎片的归属如图2C所示），该结果证明所得寡糖的分子量及结构的正确性。
同时将上述实施例中制备的寡糖采用一维核磁共振波谱（1H-NMR，13C-NMR，如图3所示）可见在13C-NMR图谱中端头碳的化学位移分别为107.02和105.69，均属于典型的β-D-呋喃型半乳糖的信号峰；进一步的二维核磁共振波谱（1H，1H-NMR，HMQC和NOESY，如图4所示）验证了所得寡糖的结构：在HMQC图谱中在异头氢和异头碳的信号相关区域，A和B的H1(5.01和4.99 ppm)均与处于107.02 ppm处的信号相关，而C的H1(4.88 ppm)和处于还原端的105.69 ppm处的信号相关；A和B信号的H-2(3.98 ppm)与其C-2信号 (81.21 ppm) 相关，C信号的H-2(3.86 ppm)与其C-2信号 (82.58 ppm)相关；A和B信号的H-3与其C-3信号 (76.40 ppm) 相关，C信号的H-3(3.91 ppm)与其C-3信号 (76.40 ppm)相关；A的 H-4(3.96 ppm)与其C-4信号(81.21 ppm)相关，B的 H-4(3.96 ppm)与其C-4信号(81.21 ppm)相关，C的 H-4(3.86 ppm)与其C-4信号 (82.58 ppm)相关；A的 H-5(3.73 ppm)与其C-5信号(70.01 ppm)相关，B的 H-5(3.75 ppm) 与其C-5信号(75.56 ppm)相关，C的 H-5(3.68 ppm)与其C-5信号(71.90 ppm)相关；A、B和C的H-6(3.59 ppm)都和C-6(60.94 ppm)相关。
NOESY图谱得出糖环内部的H-H相关信号，例如：B的H1与H2、B的H1与H3、B的H2与H3、B的H4和H5、B的H3与H6；更为重要的是，糖环之间的相关信号A的H1与B的H5，以及B信号之间的H1和H5之间的相关信号通过该方法也可得到归属。经NMR实验得出A4的结构式如图6所示。
Claims (3)
1.由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，其特征在于：包含有如下步骤：
A、多糖降解：将以[→5)β-D-Galf(1→]糖基为侧链，以甘露聚糖为主链的多糖配制成质量浓度为1.0%~15%的水溶液，在搅拌状态下加入0.1-1.0 mol/L酸溶液，调节溶液的pH值到1.5-3.5，20-90 °C恒温水浴下水解1-6小时；
B、中和、浓缩：将上述溶液用碱中和至pH值到7.0，将中和后的溶液浓缩至糖的质量浓度为10.0%；
C、醇沉：将上述浓缩后的溶液加入浓缩后溶液4倍体积的醇，在4°C ——25°C下醇沉12小时，去除未降解的甘露糖主链；
D、离心、浓缩：将上述醇沉后的溶液在2000-6000g的条件下离心10-30分钟，将离心获得的上清液除醇并浓缩至原体积的五分之一；
E、分离、检测、收集：将上述浓缩后的溶液用低压柱色谱进行分离，用示差折光检测器进行检测，按洗脱峰合并收集，去除流动相，冷冻干燥即可。
2.根据权利要求1所述的由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，其特征在于：所述低压柱色谱分离以0.1-0.5mol/L的碳酸氢铵水溶液为流动相，用Bio-Gel P4、Bio-Gel P6或Superdex 30为色谱柱填料。
3.根据权利要求1所述的由[→5)β-D-Galf(1→]糖基组成的半乳寡糖的制备方法，其特征在于：所述酸为盐酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、甲酸、乙酸、抗坏血酸、草酸、柠檬酸、氯乙酸、三氯乙酸和三氟乙酸中的任一种；所述碱是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵或碳酸氢氨中的任一种；所述醇是甲醇、乙醇或异丙醇中的任一种。
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