CN103435472B - 一类高活性苯并异脱落酸类似物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的脱落酸类合成植物激素苯并异脱落酸(II)，其以外消旋体的形式或单一光活体的形式均具有很好的脱落酸类植物生长调节活性，其中R-体(化合物II-a)的活性优于天然脱落酸。它们可以作为脱落酸类合成植物激素在农业生产中应用。

Description

一类高活性苯并异脱落酸类似物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一类具有高生物活性的苯并异脱落酸类似物的合成方法与应用。

背景技术

脱落酸(I)是一种广泛存在于植物体内的植物激素，由Ohkuma于1963年首次从棉铃中分离得到，与植物离层形成、诱导休眠、抑制发芽、促进器官衰老和脱落以及增强抗逆性等密切相关，被誉为“植物抗逆因子”。

但是脱落酸在植物体内很容易代谢失活生成8'-羟基脱落酸，8'-羟基脱落酸非常不稳定，其在环化酶催化下发生分子内的Michael加成反应，关环生成活性很低的红花菜豆酸。

为了克服这一缺陷，人们设计合成了一系列抗代谢的脱落酸类似物，但遗憾的是只有少数具有较好的生物活性。本发明提供了一类结构新颖、生物活性高于脱落酸的苯并异脱落酸(II)。

发明内容

本发明的目的是提供一种结构新颖、高生物活性的苯并异脱落酸类似物。

本发明所提供的脱落酸类似物为苯并异脱落酸(II)。其合成路线如下：

化合物(II)表现出比脱落酸更好的生物活性。

在4种模式的生物活性试验中，化合物II-a的活性均优于天然脱落酸(+)-ABA。

本发明可以用下述的实例来作进一步说明，但不仅仅限于这些实例。

实施例1：化合物(II)的合成

第一步：2,2-二甲基-3,4-二氢萘-1(2H)-酮的制备

在燥干的250mL三口瓶中加入NaH(11.6g,0.34mol,70％)、四氢萘酮(10.0g,0.69mol)和150mL无水四氢呋喃，室温搅拌10分钟得到灰色悬浮液。然后滴加碘甲烷(11.1mL,178mmol)到上述悬浮液中，滴加完后加热到40℃反应30分钟，然后室温再继续搅拌反应3小时。反应结束后，缓慢滴加少量水淬灭，乙酸乙酯萃取(3×20mL)，合并有机相，饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩，浓缩液直接柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)，得到黄色油状液体2,2-二甲基-3,4-二氢萘-1(2H)-酮(11.3,95％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃,25℃)δ8.03(8.03,J＝9.01Hz,1H),7.47-7.42(m,1H),7.32-7.20(m,2H),2.98(t,J＝6.4Hz,2H),1.98(t,J＝6.4Hz,2H),1.21(s,6H)ppm.

第二步：2,2-二甲基-3,4-二氢萘-1,4-二酮的制备

在250mL单口瓶中加入2,2-二甲基-3,4-二氢萘-1(2H)-酮(8g,46mmol)、0.59g(2.3mmol)和过氧叔丁醇(59g,46ommol,70％)溶于100mL丙酮，室温搅拌24小时。反应结束后，加入饱和食盐水，乙酸乙酯萃取(3×20mL)，合并有机相，饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩，浓缩液直接柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝6:1)，得到黄色油状液体2,2-二甲基-3,4-二氢萘-1,4-二酮(5.62,65％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃,25℃)δ8.09-8.05(m,1H),8.03-8,00(m,1H),7.77-7.72(m,2H),2.94(s,2H),1.32(s,6H)ppm.¹³C NMR(75MHz,CDCl₃,25℃)δ201.1,196.1,134.8,134.3,133.8,133.6,127.4,126.0,51.9,45.4,25.7,25.6ppm.

第三步：(Z)-(1′-羟基-3′,3′-二甲基-4′-氧代-四氢萘酮基)-3-甲基戊-2-烯-4-炔-1-醇的制备

在50mL反应瓶中加入(Z)-3-甲基戊-2-烯-4-炔-1-醇(0.50g,5.2mmol),抽真空，通入氮气，置换三次。降温至-78℃，缓慢滴加丁基锂(4mL,10.4mmol,2.5mol/L)。滴加完毕，保持-78℃下反应1h,然后缓慢滴加2,2-二甲基-3,4-二氢萘-1,4-二酮(0.98g,5.2mmol)的无水THF溶液(8mL)。滴加完毕后保持-78℃下反应1h，然后让其在室温下反应12h。反应结束后，在反应液中加入饱和氯化铵溶液6mL，搅拌，分出有机层，水层用无水乙醚萃取(3×30mL),合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，浓缩液直接柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)得到黄色油状液体(Z)-(1′-羟基-3′,3′-二甲基-4′-氧代-四氢萘酮基)-3-甲基戊-2-烯-4-炔-1-醇(1.34g,91％)，低温放置后有白色固体析出。¹H NMR(300MHz,CDCl₃,25℃)δ8.02(d,J＝9.2Hz,1H),7.90(d,J＝8.9Hz,1H),7.63(t,J＝7.4Hz,1H),7.44(t,J＝7.6Hz,1H),5.94-5.89(m,1H),4.28(d,J＝6.6Hz,2H),2.94(d,J＝17.4Hz,2H),2.64(d,J＝17.4Hz,2H),1.91(d,J＝1.1Hz,3H),1.77(s,2H),1.21(s,3H),1.17(s,3H)ppm.¹³C NMR(75MHz,CDCl₃,25℃)δ197.1,144.0,136.6,134.4,130.1,128.7,127.1,126.9,120.1,94.3,85.9,74.7,61.2,48.5,41.5,25.0,23.1,22.9ppm.

第四步：(1E,3Z)-(1′,4′-羟基-3′,3′-二甲基-四氢萘酮基)-3-甲基戊-2-烯-4-炔-1-醇的制备

100mL史莱克瓶中加入(Z)-(1′-羟基-3′,3′-二甲基-4′-氧代-四氢萘酮基)-3-甲基戊-2-烯-4-炔-1-醇(0.95g,3.3mmol)，抽真空，氮气置换三次。然后加入40mL无水THF，冰浴冷却下，缓慢滴加Red-Al试剂(4.6mL,3.6mol/L,16.7mmol)。滴加完后，保持冰浴下反应15min,然后40℃下反应6h。停止反应，在反应液中缓慢滴加5mL水，并用饱和食盐水洗涤反应液，得到水层用无水乙醚萃取(3×15mL)。合并有机层，无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，浓缩液直接柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得到黄色油状液体(1E,3Z)-(1′,4′-羟基-3′,3′-二甲基-四氢萘酮基)-3-甲基戊-2-烯-4-炔-1-醇(0.68g,71％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃,25℃)δ7.55-7.52(m,1H),7.44-7.41(m,1H),7.33-7.26(m,2H),6.30(d,J＝15.6Hz,1H),6.02(d,J＝15.6Hz,1H),5.52(t,J＝6.9Hz,1H),4.84(t,J＝6.9Hz,1H),4.08(d,J＝6.4Hz,2H),2.07-2.00(m,2H),1.83(s,3H),1.04(s,3H),0.99(s,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃,25℃)δ140.5,138.1,135.6,135.2,128.1,128.0,127.6,127.3,127.2,126.6,78.8,66.6,58.0,43.8,39.0,25.0,22.5,20.4.

第五步：苯并异脱落酸的合成

在100mL干燥的三口瓶中，加入(1E,3Z)-(1′,4′-羟基-3′,3′-二甲基-四氢萘酮基)-3-甲基戊-2-烯-4-炔-1-醇(0.5g,1.74mmol)，溶于30mL二氯甲烷中。然后加入戴斯马丁氧化剂(0.88g,2.1mmol)。室温搅拌0.5小时后，加入少量的饱和Na₂S₂O₄水溶液，终止反应。再依次加入CHCl₃、NaHCO₃，搅拌10分钟后，分出有机相，水相用CHCl₃萃取(3×20mL)。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤三次，无水硫酸钠干燥、浓缩，得到黄色液体。在50mL干燥的三口瓶中，加入上述黄色液体、2-甲基-2-丁烯(2.38g,34mmol)、NaClO₂(1.85g,85％,17.4mmol)、NaH₂PO₄·2H₂O(1.08g,6.96mmol)和20ml(t-BuOH:H₂O＝3:1)，加完后室温反应10分钟。乙酸乙酯萃取(4×20mL)，合并有机相，饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，浓缩液直接柱层析(石油醚:乙酸乙酯:醋酸＝1:1:0.1％)，得到黄色粘稠的半固体苯并异脱落酸(0.45g,两步产率86％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃,25℃)δ8.04-7.99(m,1H),7.78(d,J＝16.0Hz,1H),7.58-7.52(m,2H),7.43-7.37(m,1H),6.42(d,J＝16.0Hz,1H),5.73(s,1H),2.78(d,J＝17.2Hz,1H),2.61(d,J＝17.2Hz,1H),2.03(d,J＝0.9Hz,3H),1.09(s,3H),1.06(s,3H)ppm.¹³C NMR(75MHz,CDCl₃,25℃)δ197.5,170.6,151.8,145.7,139.3,134.5,130.9,128.3,128.2,127.2,126.7,117.6,78.3,49.7,41.1,24.3,23.4,21.4ppm.HRMS(m/z)C₁₅H₁₈NaO₄计算值:323.12593；测量值:323.12538.苯并异脱落酸II通过手性制备HPLC实现II-a与II-b的分离。II-a：

实施例2：苯并脱落酸类似物的生物活性

1.拟南芥种子萌发和幼苗生长

样品配制：(±)-ABA和测试药剂溶液的配制：精确称量一定量的(±)-ABA和测试药剂，分别溶于1mL无水甲醇中，得到10mM的母液，于-20℃下避光保存。用移液枪移取一定量的母液，用蒸馏水稀释到所需浓度。

MS培养基(100mL)：0.44g MS519，3.0g蔗糖和0.9g琼脂溶于100mL蒸馏水。

在配制培养基时，先将MS和蔗糖溶于蒸馏水，用KOH(2N)调节溶液pH值为5.8-6.0。分装,每瓶75mL，再准确称量0.67g琼脂加入到各瓶中，盖上封口膜并用橡皮筋固定。放入高温灭菌锅，于121℃下灭菌15分钟。冷却到不烫手，加入定量的药剂母液，然后倒板，得到含有不同浓度药剂的MS培养基。

种子萌发实验：将拟南芥种子用10％的84消毒液灭菌30分钟，无菌水漂洗7次，用1000μL枪头小心点播50粒种子于含有各种药剂(每种药剂设置不同浓度，每个浓度3个重复)的MS培养基上。点好种子的培养基密封后于4℃避光春化，春化48小时后移放入智能光照培养箱中(温度：22℃；光照强度：1200LX；光周期：光照/黑暗＝16小时/8小时)，垂直生长。不添加任何药剂的作为空白对照。24小时后每12小时统计一次种子的萌发数。按公式(1)计算抑制率和48小时后的IC₅₀.

抑制率＝((空白种子萌发数-药剂处理种子萌发数)/空白种子萌发数)×100％  (1)

幼苗生长实验：将拟南芥种子用10％的84消毒液灭菌30分钟，无菌水漂洗7次，用1000μL枪头小心点播种子于MS培养基上(4排，每排约20粒种子)。培养基密封后于4℃避光春化，春化48小时后移放入智能光照培养箱中(温度：22℃；光照强度：1200LX；光周期：光照/黑暗＝16小时/8小时)，垂直生长5天；选取根长相近的幼苗转移至含有测试药剂的培养基上垂直生长(每种药剂设置不同浓度，每个浓度3个重复)，标注好起始根长。7天后测量根长的伸长量。按公式(2)计算抑制率和IC₅₀.

抑制率＝((空白根伸长量-药剂处理种子根伸长量)/空白根伸长量)×100％  (2)

2.莴苣种子萌发实验：

选取饱满的莴苣种子，用10％的84消毒液灭菌30分钟，蒸馏水漂洗7次。将(±)-ABA和测试药剂配制成所需浓度的溶液1mL，消毒的种子在药液中浸泡24小时。浸种后，用蒸馏水冲洗种子3-5次，滤纸吸干表面残余水分。取干净培养皿，放置2层滤纸，加入2mL蒸馏水润湿。用牙签均匀将50粒经药剂浸泡过的莴苣种子排在滤纸上，封口膜密封，放入智能光照培养箱中(温度：25℃；光周期：光照/黑暗＝0小时/24小时)。蒸馏水浸泡的作为空白对照。12小时、24小时各统计一次种子的萌发率。按公式(1)计算抑制率和24小时后的IC₅₀.

3.小麦胚萌发实验

选取饱满的小麦种子，用10％的84消毒液灭菌30分钟，蒸馏水漂洗7次。消毒后的小麦种子用蒸馏水浸泡24小时，使其充分吸水膨胀。吸水膨胀后的小麦种子，用镊子和刀片将小麦胚小心分离切下，去除残留的胚乳和种皮。将分离出的小麦胚移入到置有两层滤纸的培养皿内(三个重复，每个重复10粒种子)。用移液枪准确量取2mL(±)-ABA、测试药剂，封口膜密封，放入智能光照培养箱中(温度：30℃；光周期：光照/黑暗＝24小时/0小时)。蒸馏水作为空白对照。12小时、24小时各统计一次种子的萌发率。按公式(1)计算抑制率和24小时后的IC₅₀.

4.水稻幼苗生长

选取饱满的水稻种子，用10％的84消毒液灭菌30分钟，蒸馏水漂洗7次。消毒后的水稻种子用蒸馏水浸泡24小时，使其充分吸水膨胀。吸水膨胀后的水稻种子置于铺有滤纸的培养皿中，加入蒸馏水至刚浸没种子，放入智能光照培养箱中(温度：30℃；光周期：光照/黑暗＝24小时/0小时)萌发2天。将萌发2天后的水稻植株移入到玻璃试管中，在试管中加入2mL(±)-ABA和测试药剂，封口膜密封，放入智能光照培养箱中(温度：30℃；光周期：光照/黑暗＝24小时/0小时)生长，蒸馏水作为空白对照，7天后统计第二片子叶的长度。按公式(3)计算抑制率和IC₅₀.

抑制率＝((空白第二片子叶长度-药剂处理第二片子叶长度)/空白第二片子叶长度)×100％         (3)

表5化合物II和ABA的生物活性对比(IC₅₀，μM)

可见，化合物II在各项生物活性测试中均高于脱落酸，具有更好的生物活性。

Claims (3)

1.一类高活性苯并异脱落酸类似物(II)，其结构式为：

II为外消旋体或单一的对映异构体，即R-体和S-体。

2.权利要求1中所示化合物的合成方法，其合成路线为:

3.权利要求1中所示化合物以其外消旋体或单一光活体R-体或S-体为活性成分制成的制剂或混剂作为植物生长调节剂的应用。