CN103432594B - 一种核酸适配体制备治疗多发性骨髓瘤的药物或制品的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种核酸适配体制备治疗多发性骨髓瘤的药物或制品的用途，该核酸适配体为TY04，是一段含有83个碱基的单链DNA。其作用原理是该核酸适配体能呈现细胞特异性和序列特异性地与多发性骨髓瘤细胞表面蛋白类物质稳定结合，通过下调细胞周期运行相关蛋白cyclin B、CDK1、ERK1/2和γ-tubulin的表达，阻滞多发性骨髓瘤细胞周期的进程于G2/M期，从而抑制多发性骨髓瘤细胞增殖。目前，国内外核酸适配体应用于多发性骨髓瘤的治疗还未见报道。该核酸适配体的发现和应用将为治疗多发性骨髓瘤提供新的策略。

Description

一种核酸适配体制备治疗多发性骨髓瘤的药物或制品的用途

技术领域

本发明属于生物医学与临床医学技术领域，涉及一个与多发性骨髓瘤治疗相关的核酸分子在制备治疗多发性骨髓瘤的药物或制品上的用途。

背景技术

核酸适配体（aptamer）是通过模拟自然进化过程的人工筛选技术-指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选得到的具有识别功能的短的单链DNA或RNA分子，能通过折叠形成特定的三维结构与靶分子结合。其具有高亲和力、高特异性、无免疫原性、易合成、改造与标记、生物化学稳定性好、能可逆变性与复性、还能通过酶扩增、剪切等特性，特别是一些核酸适配子能特异性与其靶蛋白结合，抑制靶蛋白的功能活化，阻断细胞内的信号转导，使其在疾病靶向性治疗中显示出广阔的应用前景。目前，由Eyetch/Pfizer开发的靶向VEGF的核酸适配子-pegaptanib sodium（商品名Macugen）已获得FDA的批准，成功地用于治疗老年黄斑变性。在肿瘤治疗中，核酸适配子通过靶向VEGF抑制肿瘤血管生成，靶向蛋白激酶如Her-2、Her-3、Raf-1等阻断肿瘤细胞信号转导，靶向核仁蛋白阻止肿瘤细胞增殖，靶向人乳头瘤癌蛋白E7诱导肿瘤细胞发生凋亡等多种途径发挥肿瘤治疗作用，一些已进入临床试验，显示出卓越的疗效和广阔的应用前景。

细胞-SELEX（Cell-SELEX）是在SELEX基础上发展的一项新的细胞筛选技术，该技术筛选核酸适配体是以活细胞为筛选对象，不需要事先了解靶目标的分子特征，能确保目标分子保持天然构象，最大程度保留其生物功能，该技术不仅可用于确定某种疾病或细胞的生物标志物，而且也非常有利于获得具有治疗潜力的核酸适配体。

多发性骨髓瘤（mutiple myeloma,MM）是一种起源于浆细胞的血液系统恶性肿瘤，其特征表现为恶性浆细胞在骨髓内克隆性异常增殖。MM的发病率仅次于非霍奇金淋巴瘤，为第二大常见的造血系统恶性肿瘤，约占所有血液系统恶性肿瘤10%左右。目前，传统的化疗及造血干细胞移植等为临床常用的治疗手段，但是其治疗效果一直不佳，加之临床多药耐药的出现，使其治疗更为困难，患者的5年生存率仅40%左右，因此，临床上迫切需要采取新的方法和手段治疗MM患者，提高患者的生存期。核酸适配体TY04是用一种基于Cell-SELEX的方法筛选出来的核酸适配体。我们首次研究发现，TY04能特异性地显著抑制多发性骨髓瘤细胞株的增殖，而对正常淋巴细胞的生存活性没有影响。核酸适配体TY04对多发性骨髓瘤的治疗作用尚未见报道，其将为治疗多发性骨髓瘤提供新的策略。

发明内容

本发明的目的是提供一种核酸适配体TY04制备治疗多发性骨髓瘤的药物或制品的用途。

一种核酸适配体TY04的用途，所述的核酸适配体TY04的序列为SEQ ID NO.1，用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物或制品。

本发明的TY04是特异性靶向多发性骨髓瘤的核酸适配体，具有核酸适配体通用的特点，如：高亲和力、高特异性、无免疫原性、无毒性等。核酸适配体TY04对不同的多发性骨髓瘤细胞株增殖有特异性的抑制作用，TY04能呈现剂量依赖性抑制多发性骨髓瘤细胞株MM.1S的增殖（IC50值为3.89μM），而对正常人永生化B淋巴细胞未见明显影响；TY04对多发性骨髓瘤MM.1S细胞的作用具有序列特异性；荧光核酸适配体TY04与多发性骨髓瘤MM.1S细胞有显著的结合，且随着浓度的增大结合强度增加；经鉴定核酸适配体TY04与MM.1S细胞结合的物质部分为细胞膜上的蛋白质；核酸适配体TY04能影响MM.1S细胞周期的进程，阻滞细胞周期在G2/M期，从而导致肿瘤细胞增殖紊乱而死亡；核酸适配体TY04降低了细胞中cyclin B、CDK1、ERK1/2和γ-tubulin蛋白的表达量。综上，TY04对多发性骨髓瘤治疗活性的发现，将有助于丰富临床治疗MM的手段和方法，有助于具有自主知识产权的靶向性治疗MM的核酸类新药的开发。

本发明的主要优点和有益效果

核酸适配体具有高亲和力、高特异性、分子量小、易修饰、低毒性和无免疫原性等特点。核酸适配体TY04能抑制多种多发性骨髓瘤细胞株（H929、KM3、OPM2）的增殖，进一步研究发现TY04能与多发性骨髓瘤MM.1S细胞结合，并特异性地抑制多发性骨髓瘤细胞株MM.1S的增殖，同等情况下其对正常淋巴细胞的生长没有影响，表明核酸适配体TY04作用多发性骨髓瘤细胞株具有序列和细胞特异性，进一步的研究发现核酸适配体TY04阻滞MM.1S细胞周期于G2/M期，降低MM.1S细胞中cyclin B、CDK1、ERK1/2和γ-tubulin蛋白的表达量，上述结果显示TY04是一种新的治疗多发性骨髓瘤的候选制剂。本发明对多发性骨髓瘤的治疗具有靶向特异性的重大意义。

附图说明

图1为采用CCK-8检测核酸适配体TY04对不同多发性骨髓瘤细胞株和正常人永生化B淋巴细胞存活率的影响；

图2为不同浓度的核酸适配体TY04对多发性骨髓瘤细胞株MM.1S和正常人永生化B淋巴细胞增殖的影响；

图3为不同浓度的ssDNA library（文库对照）和核酸适配体TY04对多发性骨髓瘤MM.1S细胞增殖的影响，显示核酸适配体TY04抑制MM.1S细胞增殖具有序列特异性；

图4显示核酸适配体TY04与多发性骨髓瘤MM.1S细胞能特异结合；

图5显示核酸适配体TY04与多发性骨髓瘤MM.1S细胞的结合强度强于文库对照与MM.1S细胞的结合强度；

图6显示多发性骨髓瘤MM.1S细胞与核酸适配体TY04的结合稳定性检测；

图7显示多发性骨髓瘤MM.1S细胞与核酸适配体TY04的结合部位检测；

图8为核酸适配体TY04与多发性骨髓瘤MM.1S细胞表面结合物质类型的鉴定；

图9为检测核酸适配体TY04处理多发性骨髓瘤MM.1S细胞后细胞周期变化情况；

图10为核酸适配体TY04对多发性骨髓瘤MM.1S细胞周期和细胞增殖相关蛋白表达变化的影响。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

核酸适配体TY04是采用一种基于Cell-SELEX的方法，采用恶性血液肿瘤细胞作为筛选对象，经过24轮筛选出来能特异与恶性血液肿瘤细胞结合的核酸适配体。TY04的合成步骤大致如下:(1)合成单链DNA：依照TY04的序列顺序,通过DNA合成仪(PolygenDNA-Synthesizer)合成，(2)DNA脱保护：用氨水和甲胺（1：1）脱保护后，然后把DNA溶解在TEAA溶液当中；(3)DNA纯化：通过高效液相色谱仪（HPLC）纯化；（4）DNA干燥：通过离心浓缩干燥；（5）溶解测定浓度备用：待DNA完全干燥后，溶于相应的溶液中（如灭菌水），岛津UV-2450PC测定浓度后备用。

实施例1

为了明确核酸适配体TY04对多发性骨髓瘤细胞株的增殖是否有影响，我们采用CCK-8的方法分别检测了4μM的TY04处理多发性骨髓瘤多种细胞株（MM.1S，H929，KM3，OPM2）和正常人永生化B淋巴细胞（供试细胞的浓度均为1×10⁵个/ml左右）96h后的相对存活率。通过三次独立重复实验后，发现经TY04处理后正常人永生化B淋巴细胞和不同的多发性骨髓瘤细胞（MM.1S，H929，KM3，OPM2）的相对存活率（%）分别为：144±13.81，47.72±5.7，69.42±15.1，58.23±0.65，57.08±4.24。与正常人永生化B淋巴细胞相比，TY04能导致多发性骨髓瘤各株细胞的存活率显著较低，具有统计学差异（P＜0.05）（见图1，一般而言在细胞水平IC50值在10μM以内，都有抗肿瘤开发潜力）。进一步采用CCK-8检测不同浓度的核酸适配体TY04（0，0.5，1.0，2.0，4.0μM）处理多发性骨髓瘤MM.1S细胞（供试细胞的浓度为3×10⁵个/ml左右）和正常人永生化B淋巴细胞（供试细胞的浓度为1×10⁵个/ml左右）96h后的生长情况，通过三次独立重复实验后，结果如图2所示，显示TY04能呈现剂量依赖性抑制多发性骨髓瘤细胞株MM.1S的增殖，而对正常人永生化B淋巴细胞的存活未见明显影响。TY04作用MM.1S细胞的IC50值为3.89μM，低于10μM，符合抗肿瘤药物开发潜力。不同浓度TY04对MM1.S的增殖抑制作用与对正常人永生化B淋巴细胞作用效果相比均存在显著差异，浓度越高，抑制效果越好；有统计学意义（P＜0.05）。

实施例2

为了明确TY04抑制MM.1S的增殖是否具有序列特异性，我们进一步检测了不同浓度的ssDNA文库和TY04（0，0.5，1.0，2.0，4.0μM）处理多发性骨髓瘤MM.1S细胞（供试细胞的浓度为3×10⁵个/ml左右）96h后的生长情况。通过三次独立重复实验后，数据经统计学分析，结果如图3所示，表明与TY04相比较，ssDNA文库对多发性骨髓瘤MM.1S细胞的增殖没有影响，进一步说明核酸适配体TY04对多发性骨髓瘤MM.1S细胞具有序列特异性。

实施例3

为了明确核酸适配体TY04与多发性骨髓瘤MM.1S细胞的结合情况，将带有FITC荧光标记的核酸适配体TY04以不同浓度（0，25，125，250，500nM）与多发性骨髓瘤MM.1S细胞（供试细胞的浓度为1×10⁶个/ml左右）进行孵育后，经流式细胞仪检测TY04与MM.1S细胞表面的结合情况。结果如图4所示，荧光核酸适配体TY04与多发性骨髓瘤MM.1S细胞有显著的结合，且随着浓度的增大结合强度增加。为了检测核酸适配体TY04与多发性骨髓瘤MM.1S细胞的结合是否具有特异性，将带有FITC荧光标记的ssDNA文库以不同浓度（0，25，125nM）与多发性骨髓瘤MM.1S细胞进行孵育后，经流式细胞仪检测TY04与MM.1S细胞表面的结合情况，以荧光适配体TY04的结合作为对照组。结果如图5所示，与相同浓度下的适配体TY04和MM.1S细胞有明显结合相比，ssDNA文库与MM.1S细胞无结合，表明适配体TY04与MM.1S细胞的结合具有特异性。

实施例4

将1ml多发性骨髓瘤MM.1S细胞（供试细胞的浓度为1×10⁶个/ml左右）在不同孵育条件下（4℃和37℃）与的FITC标记的荧光核酸适配体TY04（250nM）进行结合实验，以未结合细胞作为对照，经流式细胞仪检测细胞荧光信号强度。结果如图6显示，在4℃和37℃的条件下，多发性骨髓瘤MM.1S细胞与荧光核酸适配体TY04的结合强弱没有差异，说明核酸适配体与MM.1S细胞结合稳定，不受温度的影响。为观察TY04与MM.1S细胞的结合部位进一步将250nM FITC荧光标记的核酸适配体TY04与多发性骨髓瘤MM.1S细胞分别在4℃和37℃条件下孵育，制片后在荧光显微镜下观察，如图7，在4℃和37℃条件下，适配体TY04分布在MM.1S细胞膜上和胞质中。

实施例5

多发性骨髓瘤MM.1S细胞培养至对数生长期，将1ml MM.1S细胞（供试细胞的浓度为1×10⁶个/ml左右）用0.05%胰酶和0.1mg/mL蛋白酶K分别处理2min和10min后；加FBS中和酶后，Washing Buffer洗两遍；接着用250nM的TY04分别在冰上MM.1S细胞共孵育50min后，Wash Buffer洗涤后，经流式细胞仪检测荧光强度并分析结果。结果见图8，结果显示，用胰酶和蛋白酶K处理细胞后，核酸适配体TY04与MM.1S细胞的结合明显减少。结果说明核酸适配体TY04通过一部分能被胰酶或蛋白酶K消化而失去活性的蛋白与MM.1S细胞结合。

实施例6

用4μM核酸适配体TY04处理MM.1S细胞96h后（供试细胞的浓度为3×10⁵个/ml左右），收集一定数量细胞。经离心洗涤后，弃上清；加入100μL破膜剂，混匀孵育1min；再直接加入1mL PI染色液，混匀。流式细胞仪检测后细胞周期分析软件分析结果。结果见图9和表1，经过4μM核酸适配体TY04处理MM.1S细胞96h后，相对于未处理组，MM.1S细胞周期分布发生变化，G1/G0期和S期的细胞百分率减少，而G2/M细胞的百分率增加，说明细胞周期被阻滞在G2/M期。

表1：核酸适配体TY04处理MM.1S细胞后的细胞周期分布变化

实施例7

为了对核酸适配体TY04作用于MM.1S细胞的作用机制进行更进一步的研究，我们检测了细胞周期和细胞增殖相关的蛋白表达。4μM的核酸适配体TY04作用多发性骨髓瘤MM.1S细胞96h后，离心收集细胞，经固定、透膜后，分别与cyclin B、CDK1、ERK1/2和γ-tubulin蛋白孵育，再经流式细胞仪检测相应蛋白的荧光强度的变化，以未处理的细胞作为对照组。结果如图10所示，经过核酸适配体TY04处理后MM.1S细胞中各相应蛋白的面积峰左移，平均荧光强度降低，说明核酸适配体TY04降低了MM.1S细胞中cyclin B、CDK1、ERK1/2和γ-tubulin蛋白的表达量。

结论：

1）核酸适配体TY04能抑制多种多发性骨髓瘤细胞株的增殖。

2）核酸适配体TY04能与多发性骨髓瘤MM.1S细胞特异性的结合，其结合的物质部分为蛋白质，结合的部位为细胞膜和细胞质。

3）核酸适配体TY04通过阻滞多发性骨髓瘤MM.1S细胞周期于G2/M期而抑制细胞增殖。

4）核酸适配体TY04通过下调多发性骨髓瘤MM.1S细胞周期运行相关蛋白cyclin B、CDK1、ERK1/2和γ-tubulin的表达而阻滞细胞周期的运行。

Claims (1)

1.一种核酸适配体TY04的用途，其特征在于，所述的核酸适配体TY04的序列为SEQ IDNO.1，用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物或制品。