CN103418346B

CN103418346B - 一种表面展示重组蛋白的工程酿酒酵母活细胞镉吸附剂

Info

Publication number: CN103418346B
Application number: CN201210160042.2A
Authority: CN
Inventors: 李鹏松; 陶虎春; 苏捷; 于太安; 彭智文
Original assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Huizhou Dayawan Julian Information Technology Co ltd
Priority date: 2012-05-22
Filing date: 2012-05-22
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2032-05-22
Also published as: CN103418346A

Abstract

本发明提供一种表面展示T68CadR重组蛋白的工程酵母活细胞镉吸附剂。所述T68CadR蛋白，由野生CadR蛋白去除N端的47个氨基酸和C端的21个氨基酸而来，并通过a-凝集素酵母细胞表面展示系统展示（锚定）于所述工程酵母细胞表面。所述工程酿酒酵母活细胞镉吸附剂，对水中的低浓度镉具有良好的去除效果，并且对镉具有一定的特异性。

Description

一种表面展示重组蛋白的工程酿酒酵母活细胞镉吸附剂

技术领域

本发明涉及一种酿酒酵母活细胞镉吸附剂，尤其涉及一种表面展示T68CadR重组蛋白的工程酿酒酵母活细胞镉吸附剂。

背景技术

镉是一种毒性很强的重金属，进入人体后形成累积性中毒，导致骨质疏松和肾衰竭。镉及含镉化合物主要应用于电池、电镀、颜料及合金等行业，随着工业发展，镉污染也日益严重。

目前除了含镉废水的方法主要是物理化学法和化学法。其中物理化学法包括膜分离法和离子交换法，这些方法虽然去除效果好，但成本较高，难以大规模应用。化学法主要分为中和沉淀法、硫化物沉淀法和铁氧体法。中和沉淀法和硫化物沉淀法工艺简单，但容易造成二次污染。铁氧体法不易控制，在工业上难以广泛应用。

以上方法在处理低浓度含镉废水时都具有成本高的缺点，而且缺乏对镉的特异性，难以对镉进行选择性回收。

发明内容

提供一种表面工程酿酒酵母活细胞镉吸附剂，对低浓度镉有良好的选择性去除效果。

所述工程酵母表面展示（锚定）了T68CadR蛋白。

所述T68CadR蛋白，由野生CadR蛋白去除N端的47个氨基酸和C端的21个氨基酸而来。

附图说明

图1是本发明实施例的质粒构建示意图。

图2是本发明实施例测得的镉去除率随时间的变化曲线图。

图3是本发明实施例测得的镉和锌的吸附量。

具体实施方式

本吸附剂的制备方法是：

1、T68CadR蛋白的设计

由于CadR蛋白的N端为DNA结合结构域，而C端的21个氨基酸也不行使镉结合的功能，这些氨基酸对于镉吸附功能来说是冗余序列，因此本发明去除了CadR蛋白N端的47个氨基酸和C端的21个氨基酸，从而设计出T68CadR蛋白。

2、质粒的转化

以寡核苷酸TN47-F和TC21-R为引物，恶臭假单胞菌基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应（PCR），扩增出具有5’和3’端分别具有EcoR I和Not I限制性酶切位点的T68CadR编码基因，将该基因片段克隆入载体pYD1，得到质粒pYD1-T68CadR（图1）。

3、酿酒酵母的转化

1）本发明采用酿酒酵母EBY100作为表面展示菌株，首先从YPD平板上挑取直径2-3mm的EBY100菌落，接入到10ml YPD液体培养基中，30℃恒温振荡培养16-18h；

2）将过夜培养的菌液接种于50ml YPD培养基中，调稀释至OD₆₀₀=0.4，继续30℃恒温振荡培养2-4h；

3）1800×g离心5min，弃上清后用40ml 1×TE重悬；

4）再次1800×g离心5min，弃上清后用2ml 1×LiAc/0.5×TE重悬，室温静置10min后即制成酵母感受态细胞；

5）取酵母感受态100μl，加入1μg质粒DNA及100μg人工处理的鲑鱼精子DNA并混合均匀，加入700μl 1×LiAc/40% PEG-3350/1×TE混合均匀，30℃ 180rpm恒温振荡培养30min；

6）加入88μl DMSO并混合均匀，42℃水浴热激7min；

7）10000×g离心30s，弃上清，用1ml 1×TE重悬菌体，取100μl菌液涂于选择性SD/-trp平板，30℃恒温培养48h。

4、T68CadR蛋白的表面展示

1）接种新鲜的酿酒酵母转化子于含有2％葡萄糖的YNB-CAA液体培养基中，30℃恒温振荡培养过夜至OD600为2-5；

2）1800×g离心5min，弃上清，使用含有2％半乳糖的YNB-CAA培养液重新悬浮菌体沉淀，调OD₆₀₀值为0.5~1.0；

3）20℃恒温振荡培养24h后，即完成T68CadR蛋白的表面展示。

下面以镉吸附实验为例，考察所述活细胞吸附剂对镉的吸附特性：

取成功表面展示T68CadR蛋白的菌液，调OD₆₀₀=4.0；1800×g离心5min，弃上清；先后用1×TE和50mM HEPES（pH 8.0）洗菌体各一遍，弃上清；用相同体积的Cd（II）浓度为1mg/L的50mM HEPES重悬菌体沉淀；30℃ 220rpm恒温振荡培养吸附2h；10000×g 离心1min，取上清；上清用1%硝酸溶液稀释10倍后用ICP-MS检测镉浓度。

镉去除率用如下公式计算：

镉去除率=[(c₀-c_s)/c₀]×100%

其中c₀为镉的初始浓度，c_s为吸附实验后上清中的镉浓度。

图2所示为本发明实验中活细胞镉吸附剂对镉的去除率随时间的变化曲线图。展示T68CadR蛋白的工程酿酒酵母菌株EBY100/pYD1-T68CadR在吸附实验2h后对镉的去除率为(95.62±0.85)%，而未展示T68CadR的EBY100 的镉去除率仅为(65.18±0.74)%。

如图3所示，在锌和镉的初始浓度均为1.0mg/l的情况下，本发明所构建的EBY100/pYD1-T68CadR活细胞吸附剂与对照组EBY100相比对镉的吸附量增加了59.88%，对锌的吸附量降低了23.93%。说明本发明实施例所构建的酵母活细胞吸附剂对镉具有特异性吸附的特性。

本发明实施例中培养基和缓冲液配制方法如下：

YPD固体培养基（1L）：

成分：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖。

配制方法：

1、将10g酵母提取物和10g蛋白胨（Peptone）溶解于900ml水中，加入20g琼脂，121℃灭菌20min，冷却至55~60℃；

2、加入100ml 20%葡萄糖，混匀后立即倒板。

SD/-trp培养基：

成分：0.67% YNB（含硫酸铵，不含氨基酸），2%葡糖糖，0.01%亮氨酸（leucine），1.5%琼脂（agar）。

配制方法：

1、将6.7g YNB和15g琼脂溶解于900ml去离子水中，121℃灭菌20min，冷却至55~60℃；

2、加入100ml 20%的葡糖糖溶液（已灭菌消毒）；

3、加入10ml 10mg/ml的亮氨酸溶液（已灭菌消毒）；

4、倒平板，冷却凝固后4℃保存。

YNB-CAA培养基：

成分：0.67% YNB（含硫酸铵，不含氨基酸），2%葡糖糖（glucose）或半乳糖（galactose），0.5%酪蛋白氨基酸（Casamino acids）。

配制方法：

1、将6.7g YNB和5g酪蛋白氨基酸溶解于900ml去离子水中；

2、 121℃灭菌20min，灭菌结束冷却至55~60℃，加入100ml 20%的葡萄糖或半乳糖溶液；

3、室温或4℃保存。

1×TE：

组成浓度：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH=8.0

配制量：500ml

配制方法：

1、取pH=8.0的1M Tris-HCl Buffer 5ml，pH=8.0的0.5M EDTA 1ml；

2、加入约400ml dd H₂O均匀混合；

3、将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存。

本发明中T68CadR的编码序列见核苷酸序列表。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种工程酿酒酵母活细胞镉吸附剂，其特征在于，利用a-凝集素酵母细胞表面展示系统将去除N端47个氨基酸和C端21个氨基酸的野生CadR蛋白展示于所述酿酒酵母的细胞壁表面。