CN103417579B - 一种海参提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供海参提取物在制备治疗和预防老年痴呆症等神经退行性疾病制品中的应用，所要解决的技术问题是提供一种新型的用于改善老年痴呆症等神经退行性疾病的活性物质，其在充分改善治疗老年痴呆症等神经退行性疾病的同时，不会带来任何毒副作用。本发明的海参提取物及其纯化物可改善快速老化小鼠SAMP8的学习和记忆能力，可降低SAMP8小鼠脑组织的丙二醛含量，减少脂质过氧化。结果表明海参提取物具有制备治疗和预防神经退行性疾病制品的应用潜力。<!--1-->
Description
技术领域
本发明涉及海参提取物的一种新用途，具体的说是海参提取物预防、改善和治疗老年痴呆症等神经疾病在保健食品、功能性食品或药物研发中的用途。
背景技术
阿尔兹海默病（Alzheimer’sdisease,AD），又称老年性痴呆症，是一种常发生于老年人的原发性神经退行性疾病，临床表现为进行性记忆丧失和认知障碍。AD的发病与年龄密切相关，随着社会老龄化，老年人口的逐渐增多，患病率呈上升趋势。研究表明β-淀粉样肽（β-amyloidpeptide,Aβ）是阿尔兹海默病的特征性病理改变——老年斑的重要成分，由β-淀粉样前体蛋白（APP）代谢产生。
快速老化小鼠（SAM）是日本学者研究开发的与人类老化基本一致的自然快速老化系列模型动物。SAM分为快速老化的P品系和正常老化的R品系。P品系的特点是生长期过后快速出现的自然老化，并伴随老化产生与人类相似的老化病症，其中SAMP8以学习记忆障碍、认知功能低下及神经元退行性改变为特征，是目前研究老年性痴呆比较理想的自然发病模型。
海参为棘皮动物门海参纲循手目动物，在我国被视为佐膳佳品。海参是海洋中重要的食物和药物资源，海参体内还含有丰富的生理活性物质，如多糖、皂苷、多肽、脂质等，这些活性物质可用于治疗或辅助治疗某些疾病，如对神经衰弱、肺结核、阳痿、糖尿病、胃及十二指肠溃疡和再生障碍性贫血的治疗效果较为明显。但目前还没有来源于不同海参活性物质在AD方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供海参提取物在制备治疗和预防老年痴呆症等神经退行性疾病制品中的应用，所要解决的技术问题是提供一种新型的用于改善老年痴呆症等神经退行性疾病的活性物质，其在充分改善治疗老年痴呆症等神经退行性疾病的同时，不会带来任何毒副作用，从而弥补现有技术上的不足。
申请人在长期的研究中发现，海参的提取物能够有效的预防小鼠自然老化的问题，从而促成了本发明。
本发明提供了海参提取物的一种应用，即在制备用于治疗和预防神经退行性疾病制品中的应用；
所述的神经退行性疾病为老年痴呆症。
本发明所述的海参提取物，其制备方法如下：
将海参干燥粉碎，在粉碎的海参样品中加入乙醇进行超声辅助逆流提取，提取结束后进行过滤，过滤液进行减压浓缩得到浓缩液。浓缩液加入丙酮充分混合，-20℃放置进行沉淀，将沉淀减压浓缩去除有机溶剂，得到海参提取物。
所述的海参样品和乙醇的质量体积比g/ml优选为1:5；
所述的浓缩液与丙酮的体积比优选为1:4；
为了使海参提取物的效果更好，本发明采用硅胶柱层析方法对海参提取物进行了纯化，其操作方法如下：
首先将海参提取物用氯仿溶解，然后将海参提取物的氯仿溶液倒入活化的硅胶层析柱中，控制流速使海参提取物与硅胶进行充分地吸附。上样完成后，依次用氯仿和丙酮洗脱；丙酮洗完后，用氯仿置换柱中的丙酮；并进行氯仿-甲醇溶液洗脱，同时逐步增加甲醇浓度，收集洗脱液，以250mL为一个组分，TLC点板层析，并用碘和Dittmer试剂显色，收集纯化物组分的洗脱液，减压浓缩，即为海参提取物纯化物。
所述海参提取物的氯仿溶液的流速为1mL/min；
所述洗脱所用的氯仿和丙酮的体积与柱体积的比值优选为5:1。
上述的治疗和预防神经退行性疾病制品为功能性食品或药品。
本发明的海参提取物及其纯化物可改善快速老化小鼠SAMP8的学习和记忆能力，可降低SAMP8小鼠脑组织的丙二醛含量，减少脂质过氧化。结果表明海参提取物具有制备治疗和预防神经退行性疾病制品的应用潜力。
附图说明
图1：海参提取物及其纯化物对SAMP8小鼠学习能力影响的数据图；
图2：海参提取物及其纯化物对SAMP8小鼠脑组织中丙二醛含量影响图。
具体实施方式
以下结合实施例来详细说明本发明。
实施例1海参提取物及其纯化物的制备
1、材料与方法
海参经干燥后，将样品粉碎，取样品10kg，95%乙醇溶液50L超声辅助逆流提取4h。过滤后，减压浓缩至500mL，加入2L丙酮充分混合，-20℃放置24h，收集沉淀，减压浓缩去除有机溶剂，得到海参提取物。
首先将海参提取物用氯仿溶解，然后将海参提取物的氯仿溶液倒入活化的硅胶层析柱中，控制流速1mL/min使海参提取物与硅胶进行充分地吸附。上样完成之后，依次用5倍柱体积的氯仿和丙酮洗脱；丙酮洗完后，用氯仿置换层析柱中的丙酮；并进行氯仿-甲醇溶液洗脱，同时逐步增加甲醇浓度，收集洗脱液，以250mL为一个组分，TLC点板层析，并用碘和Dittmer试剂显色，收集了纯化物组分的洗脱液，减压浓缩，即为海参提取物纯化物样品。
采用Lowry法来测定海参提取物及纯化物的蛋白含量，Folch法测定总脂含量，气相色谱法测定脂肪酸组成。
结果表明海参提取物的蛋白质含量为8%，脂质含量为65%，海参提取物中含有大量的不饱和脂肪酸，其中二十碳五烯酸（EPA）的含量达总脂肪酸含量的47.1%。海参提取物纯化物的蛋白质含量为0.1%，磷脂含量为96%，其中二十碳五烯酸（EPA）的含量达总脂肪酸含量的57.8%。
表1：海参提取物的脂肪酸组成
实施例2：海参提取物及其纯化物对SAMP8小鼠学习、记忆能力的影响
1、材料与方法
1）样品制备
海参提取物及其纯化物的制备方案与实施例1相同。
2）实验动物及分组
健康雄性1月龄SAMP8小鼠30只，SAMR1小鼠10只，体重（28±2）g，由动物中心提供。小鼠适应性喂养1周后，将SAMP8小鼠按体重随机分为三组：模型组、喂食海参提取物组和喂食纯化物组，每组10只，并以相同条件下的SAMR1小鼠为对照组。饲料参照AIN-93G啮齿动物饲料配方进行改良，海参提取物组和纯化物组分别添加0.5%的海参提取物或纯化物。所有小鼠均至于SPF环境中饲养：室温23±2℃、相对湿度50-60%、12:12h明暗，8:30am给光。
3）实验方法
实验小鼠连续喂养3个月后进行Morris水迷宫测试。Morris水迷宫主要由两部分组成，即内含平台的圆形水池和记录装置。水池直径130cm，高50cm，水温控制在（22±1）℃。在水池边缘等距离依次标有东（E）、南（S）、西（W）、北（N）4个方向，据此将水池氛围四个象限。平台直径9cm，高29cm，水深30cm。迷宫上方安有摄像机，并和计算机连接，自动录入小鼠游泳轨迹并进行分析。测试内容包括定位航行试验和空间探索实验。
定位航行试验：测试时平台置于W象限，小鼠分别从E，S，W，N4个位置面对池壁放入水池，记录其在60s内找到平台所用的时间（逃避潜伏期），如果小鼠在60s内未找到平台，则由实验者用手牵引其至平台上，停留10s，逃避潜伏期记为60s，两次实验间隔20s，历时6天。
空间探索试验：上述实验第七天撤除平台，小鼠从平台所在象限的对位象限面对池壁入水，使小鼠在无平台情况下寻找记忆中的平台，记录其在60s的游泳轨迹，并记录其停留在原平台所在象限的时间及穿越原平台的次数。
4）数据统计
所有数据利用SPSS17.0统计软件进行ONEWAYANOVA分析，数据均以表示，以P<0.05表示有统计学差异。
实验结果如下：
各组六天的平均逃避潜伏期比较，见图1。SAMP8模型对照组的逃避潜伏期明显长于SAMR1正常对照组，说明同一种系的快速老化小鼠的学习记忆能力比正常老化小鼠弱。经过6天的训练，SAMP8小鼠的学习能力比较缓慢，海参提取物组和纯化物组的潜伏期随着训练天数的增加而缩短，且纯化物组的潜伏期更短，说明海参提取物和纯化物对小鼠学习能力均有改善作用，纯化物效果优于海参提取物。
撤去平台后，与SAMP8小鼠比较，海参提取物组和纯化物组小鼠在Morris水迷宫经过平台所在象限的停留时间明显延长，穿越原平台次数明显增多（表1），且纯化物组的小鼠经过平台所在象限的停留时间最长，穿越原平台次数也多于海参提取物组，说明海参提取物和纯化物均可改善SAMP8小鼠的空间记忆能力，且纯化物的效果好于海参提取物。
表2海参提取物及其纯化物对SAMP8小鼠记忆能力的影响（M±SD）
与SAMR1对照组比较，#P<0.05；与SAMP8组比较，*P<0.05
实施例3：海参提取物及其纯化物对脑组织丙二醛含量的影响
1、材料与方法
1）样品制备
海参提取物及其纯化物的制备方案与实施例1相同。
2）实验动物和分组
实验所需动物和分组方案与实施例2相同。
3）实验方法
实验小鼠连续喂养4个月后断头处死，立即取出脑组织，匀浆，4℃4000rpm离心15min，取上清。利用丙二醛检测试剂盒测定各组小鼠脑组织中丙二醛的含量。
4）数据统计
所有数据利用SPSS17.0统计软件进行ONEWAYANOVA分析，数据均以M±SD表示，以P<0.05表示有统计学差异。
5）实验结果
丙二醛的含量是老化损伤模型的重要氧化指标。SAMP8脑组织中丙二醛的含量明显高于SAMR1小鼠，而喂食海参提取物和纯化物后，可明显降低SAMP8小鼠脑组织中的丙二醛的含量，且纯化物组的效果更为明显。
上述结果表明，海参提取物可改善快速老化小鼠SAMP8的学习和记忆能力，降低脑组织的丙二醛含量；海参提取物经硅胶柱层析后得到其纯化物，纯化物对快速老化小鼠SAMP8的学习和记忆能力以及脑组织的丙二醛含量的效果均优于海参提取物。由此说明，海参提取物可治疗和预防老年痴呆症。
Claims (8)
1.海参提取物在制备用于治疗和预防神经退行性疾病制品中的应用，其特征在于，所述的海参提取物，其制备方法如下：将海参干燥粉碎，在粉碎的海参样品中加入乙醇进行超声辅助逆流提取，提取结束后进行过滤，过滤液进行减压浓缩得到浓缩液；浓缩液加入丙酮充分混合，-20℃放置进行沉淀，将沉淀减压浓缩去除有机溶剂，得到海参提取物。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的神经退行性疾病为老年痴呆症。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的海参样品和乙醇的质量体积比为1:5。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述浓缩液与丙酮体积比为1:4。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的海参提取物进行了纯化，其操作方法如下：首先将海参提取物用氯仿溶解，然后将海参提取物的氯仿溶液倒入活化的硅胶层析柱中，控制流速使海参提取物与硅胶进行充分地吸附。上样完成之后，依次用氯仿和丙酮洗脱；丙酮洗完后，用氯仿置换柱中的丙酮；并进行氯仿-甲醇溶液洗脱，同时逐步增加甲醇浓度，收集洗脱液，以250mL为一个组分，TLC点板层析，并用碘和Dittmer试剂显色，收集纯化物组分的洗脱液，减压浓缩，即为制备的纯化物。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于所述海参提取物的氯仿溶液的流速为1mL/min。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述洗脱所用的氯仿和丙酮的体积与柱体积的比值优选为5:1。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的治疗和预防神经退行性疾病制品为功能性食品或药品。
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