CN103417533A - Tpca-1作为stat3信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种TPCA-1的医药新用途——作为STAT3信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。细胞模型筛选实验和Western-Blot检测实验证明，TPCA-1具有良好的STAT3抑制活性，并且能有效抑制STAT3所调控的相关基因的表达，从而可以有效抑制STAT3信号依赖的肿瘤细胞的生长，因此，以TPCA-1为主要活性成分，采用药剂学上可接受的工艺和辅料，制备成各种剂型的基于STAT3为靶点的抗肿瘤药物，具有很好的开发前景。

Description

TPCA-1作为STAT3信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药应用领域，涉及一种 TPCA-1 的医药新用途——TPCA-1 作为 STAT3 信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

细胞中 JAK-STATs 信号对细胞信号的传导及各项生理活动至关重要，该家族信号的异常会导致众多疾病的发生，包括癌症和免疫相关疾病。JAKs (Janus Kinase) 家族包括JAK1, JAK2, JAK3 和 Tyk2 四个成员。而 JAKs 下游的 STATs (Signal transducer and activator of transcription) 家族包含 7 个成员 (STAT1-STAT6， 其中 STAT5A  和 STAT5B 有两个独立的基因编码)。在许多人类实体瘤及血液相关疾病中，通常 STATs 活性表现为异常，最常见的为 STAT3 过度活化（Bowman et al.,2000;Garcia and jove,1998;Yu et al.,2009）。

在众多 STAT3 异常活化的肿瘤细胞中，抑制 STAT3 信号能有效抑制细胞生长、诱导细胞凋亡和减少肿瘤细胞的转移 (Iwamaru et al.,2007;Rahaman et al.,2002)。如在神经胶质瘤 (Iwamaru et al.,2007;Rahaman et al.,2002))、乳腺癌(Garcia et al.,2001)、结肠癌 (Lin et al.,2011)、前列腺癌(Lee et al.,2004;Mora et al.,2002;Ni et al.,2000)，黑色素瘤 (Niu et al.,2002;Niu et al.,1999) 等细胞中，通过 STAT3 抑制蛋白表达、小干扰 RNA或特异性抑制剂来抑制 STAT3 活性，能显著下调 STAT3 下游相关基因，如 CyclinD1、Bcl-xl、c-Myc 和 Survivin 等，从而调节肿瘤细胞周期减缓细胞增殖，增加凋亡 (Weerasinghe et al.,2007;zhang et al.,2012)。作为 STATs 家族上游最重要的激酶，由于突变或其他原因引起的 JAKs 活性过高，持续激活下游蛋白（主要如 STATs 家族），与上述肿瘤疾病相关外，通常会与血液疾病、自身免疫疾病相关 (Baxter et al.,2005;James et al.,2550;Kralovics et al.,2005;Levine et al.,2005;Mullighan et al.,2009)。在这些相关的疾病中，抑制 JAK-STATs 信号将有效抑制和缓解该信号异常活化带来的疾病。

    TPCA-1 是由 Patricia L et al 于 2004 年合成的一种 IKKβ 的特异性抑制剂，它被证实可抑制 IKKs 介导的 NFκB 信号通路，TPCA-1 结构如下：

       

通过以 STAT3 为靶点的药物筛选细胞模型（见中国专利申请201110423004.7），发现 TPCA-1 能有效抑制筛药模型中的荧光素酶活性，经过进一步验证发现，TPCA-1 对 STAT3 信号有稳定的抑制效果，且在细胞水平具有高效低毒的抑制效果，能对 STAT3 信号依赖的细胞具有较好的抑制作用。因此，TPCA-1作为 JAK-STAT3 信号抑制剂，开发具有治疗由于 STAT3 持续活化造成的相关疾病的药物具有很大的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种 TPCA-1 的新用途——作为 STAT3 信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

下面通过细胞实验来说明 TCPA-1 对 STAT3 信号的抑制作用。

仪器：PerkinElmer Victor3 荧光/化学发光分析仪，Biorad 蛋白质电泳及转印系统，Biorad 荧光定量 PCR 分析仪。

试剂：RNA 反转录试剂盒购自 Promega 公司；IL-6 购自 Peprotech 公司；TPCA-1 购自 Sigma 公司；BAY11-7082 购自 Sigma；DMEM（高糖）及胎牛血清购自 Hyclone（Thermo 公司）；各种抗体购自 Cell Signaling Technology 公司；总 RNA 提取试剂盒购自天根公司；MTT 购自上海生工；protein G-beads 购自 Invitrogen。

 1、TPCA-1 对细胞因子介导的 STAT3 活性的抑制

使用 IL-6、IFNα 或 IFNγ 刺激细胞后检测 TPCA-1 对 STAT3 活性的抑制作用。HEK 293T 于10 cm 细胞于培养皿中生长至汇合度为 70% ~ 80%，加入 TPCA-1 预处理 2 h (2 μM)，同时以加入等量 DMSO 作为对照，IL-6 (50 ng/ml) 处理 2 h 或 IFNα  (5000 U/ml) 处理 30 min 或 IFNγ  (1500 U/ml) 处理 1 h后提取总蛋白。图 1为 Western-blot 检测 TPCA-1 对细胞因子介导的 STAT3 活性的抑制。图 1 的结果表明，TPCA-1 能有效抑制细胞因子激活的 STAT3 活性。

同样的方法，使用另一种 IKK-2 抑制剂 BAY11-7082 预处理 HEK-293T 细胞，使用上述三种细胞因子刺激细胞后提取总蛋白。图2 为 Western-blot 检测 BAY11-7082 对细胞因子 IL6、IFNα 或 IFNγ 介导的 STAT3 活性的作用。图 2显示，BAY11-7082 对细胞因子介导的 STAT3 活化无影响。

 2、TPCA-1 对 c-src 激酶介导的 STAT3 活性的抑制

    在 HEK293T 细胞中使用慢病毒载体稳定过表达 c-src 激酶，同时以 pLV 空载体作为对照, 当 HEK293T-src 细胞生长至汇合度为 70% ~ 80%，加入TPCA-1 (2 μM) 处理 2 h。图 3 结果显示，TPCA-1 处理可以强烈抑制 c-src激活的 STAT3。 

 3、TPCA-1 对 STAT3 所调控下游基因的转录抑制

    HEK293T 于 10 cm 细胞培养皿中生长至汇合度为 70% ~ 80%，加入TPCA-1 或 BAY11-7082 预处理 2 h (2 μM)，同时以加入等量 DMSO 作为对照，IL-6 (50 ng/ml) 处理 4 h 后提取总 RNA，反转录后，Real-time PCR 分析 TPCA-1 对细胞因子 IL-6 介导的 STAT3 下游基因 socs3 的转录抑制。图4的结果表明，使用TPCA-1预处理细胞后，IL-6 诱导的 STAT3 下游基因socs3 mRNA 水平明显低于 DMSO 和 BAY11-7082 预处理的细胞，证明 TPCA-1 可以特异性抑制由 STAT3 调控的下游基因的转录，且此抑制作用独立于其 IKK-2 拮抗活性。

 4、TPCA-1 结合于 STAT3 的 SH2 结构域并阻断其与上游激酶的结合 

    进一步研究表明 TPCA-1 通过与 STAT3 SH2 结构域结合而阻碍了上游激酶对 STAT3 的招募，进而抑制了 STAT3  活化。文献报道，MDA-MB-231 细胞含有组成型激活的 STAT3，其 STAT3 的活化是由 EGFR 直接介导的。当 MDA-MB-231 细胞于 10 cm 细胞培养皿中生长至汇合度为 70%~80% 时，加入 DMSO 或 TPCA-1 处理 24 h 后裂解细胞，取少量细胞裂解液以备 Western blot 分析，再将 5 μl STAT3 抗体和 20 μl protein G-beads 加入到剩余细胞裂解液中，4 °C 缓慢摇晃孵育过夜；免疫沉淀反应后，离心后小心吸去上清液，protein G-beads 用裂解缓冲液洗涤 3 遍，最后加入 20 μl 的 2 

 加样缓冲液，100 ℃ 煮沸 10 min。图 5 的结果表明，TPCA-1 能有效阻断 STAT3 与 EGFR 的结合。另外，通过分子对接实验（图 6）的结果显示，TPCA-1 与 STAT3 SH2  结构域具有较高的结合能力，并和 SH2 结构域中的 Glu594 形成一个氢键。 

 5、TPCA-1 对STAT3信号持续活化的细胞的抑制

    文献报道，EGFR 突变的非小细胞肺癌细胞中含有可持续活化的 STAT3，且活化的 STAT3 对此类肿瘤细胞的生长发挥着重要作用，HCC827 和 NCI-H1975 就属于这类细胞。

 HCC827 和NCI-H1975细胞于 10 cm 细胞培养皿中生长至汇合度为70% ~ 80%，更换新鲜完全培养基，加入 TPCA-1 处理 24 h (2 μM)，同时以加入等量 DMSO 作为对照，提取总蛋白，进行 Western-Blot 分析。结果见图 7。图 7 的结果表明，TPCA-1 能有效抑制 HCC827 和 NCI-H1975 的 STAT3 活性，STAT3 的下游基因如 cyclinD3、c-Myc、Survivn 也被抑制。

 使用 TPCA-1 长时间处理 HCC827 和 NCI-H1975 细胞以及乳腺癌MDA-MB-468 细胞，以 EGFR 野生型且 STAT3 活性较低的 A549 细胞作为对照：将 A549、HCC827、NCI-H1975 和 MDA-MB-468 细胞接种于 96 孔板（10,000 个/孔），细胞贴壁过夜后，换分别含有 0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10 μM 的 TPCA-1 的完全培养基处理细胞，处理 72 h 后，加入 20 μl 5 mg/ml MTT 母液，37℃ 孵育 4 h 后测定吸光值（n=3，三次独立重复试验）。图 8 为 TPCA-1 对 A549、HCC827 、NCI-H1975 和 MDA-MB-468 细胞的抑制效果。图 8 的结果显示，TPCA-1 对 STAT3 信号依赖的 HCC827、NCI-H1975 和 MDA-MB-468 细胞有更强的生长抑制作用。

上述细胞模型筛选实验和 Western-Blot 检测实验证明，TPCA-1 具有良好的 STAT3 抑制活性，并且能有效抑制 STAT3 所调控的相关基因的表达，从而可以有效抑制 STAT3 信号依赖的肿瘤细胞的生长，因此，以 TPCA-1 为活性成分，用于制备基于 STAT3 为靶点的抗肿瘤药物：以TPCA-1 为活性成分，采用药剂学上可接受的工艺和辅料，制备成各种剂型的靶向药物，如各种口服制剂和注射剂等。

附图说明

图 1为TPCA-1对细胞因子激活的 STAT3 的抑制。

图 2为BAY11-7082 对细胞因子激活的 STAT3 的作用.

图 3为TPCA-1 对 c-src 激活的 STAT3 的抑制。

图 4为Real-time PCR 检测 TPCA-1 对由 IL-6 诱导的 socs3 的转录抑制。

图 5为免疫共沉淀检测 TPCA-1 对 STAT3–EGFR 相互结合的阻断。

图 6为分子对接技术检测 TPCA-1 结合于 STAT3 的 SH2 结构域。

图 7为TPCA-1 抑制肿瘤细胞中组成型活化的 STAT3 活性及其下游基因的表达。

图 8为TPCA-1 特异性抑制 STAT3 持续活化的肿瘤细胞的增殖。

具体实施方式

下面具体实施例对TPCA-1作为活性成分，在制备基于STAT3为靶点的抗肿瘤药物中的应用作进一步说明。

实施例1、TPCA-1片剂的制备

    配方： TPCA-1（纯度大于95%）           20.0g

             填充剂                                              180.0g

             崩解剂                                               10.0g

             黏合剂                                                6.0g

             润滑剂                                                3.0g

             共计                                                  200.0g

工艺：按制备片剂的常规工艺制成片剂1000片，每片含TPCA-1钠盐20mg。

实施例2：TPCA-1胶囊的制备

    配方：TPCA-1（纯度大于95%）                50.0g

            填充剂                                                    85.0g

            黏合剂                                                     5.0g

            润滑剂                                                    10.0g

            共计                                                      200.0g

    工艺：按制备胶囊剂的常规工艺制成1000粒，每粒胶囊含TPCA-1钠盐50mg。

实施例3、TPCA-1注射液的制备

    配方：TPCA-1钠盐（纯度大于95%）          100.0g

               枸橼酸                                                        1.0g

               枸橼酸钠                                                     0.5g

               氯化钠                                                       18.0g

               注射用水                                                   2000ml

    工艺：按制备注射剂的常规工艺操作，共制成2ml的注射剂1000支，每支TPCA-1钠盐100mg。

   上述各实施例中的填充剂、崩解剂、 黏合剂、润滑剂等辅料均为药剂学上最常规的辅料。

Claims (7)

1.TPCA-1 作为 STAT3 信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

2.如权利要求1所述TPCA-1作为 STAT3 信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤为具有持续活化 STAT3信号的肿瘤细胞。

3.如权利要求2所述TPCA-1作为 STAT3 信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述具有持续活化 STAT3信号的肿瘤细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞。

4.如权利要求1所述TPCA-1作为 STAT3 信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤为由于细胞因子激活引起的 STAT3信号持续活化的肿瘤细胞。

5.如权利要求4所述TPCA-1作为 STAT3 信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述细胞因子为由 c-src 激活的STAT3活化肿瘤细胞。

6.如权利要求2所述TPCA-1作为 STAT3 信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述由 c-src 激活的STAT3活化肿瘤细胞为肺癌细胞、白血病细胞。

7.如权利要求1～6所述TPCA-1 在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：以 TPCA-1 为活性成分，采用药剂学上可接受的工艺和辅料，制备成各种剂型的抗肿瘤药物。

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