CN109925311A - 一种TPCA-1在Svv循环调控通路相关肿瘤精准防治中的用途 - Google Patents
一种TPCA-1在Svv循环调控通路相关肿瘤精准防治中的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109925311A CN109925311A CN201910228576.6A CN201910228576A CN109925311A CN 109925311 A CN109925311 A CN 109925311A CN 201910228576 A CN201910228576 A CN 201910228576A CN 109925311 A CN109925311 A CN 109925311A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- svv
- ikk
- cell
- tpca
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种IKKβ激酶抑制剂——TPCA‑1在肿瘤精准防治中的用途,TPCA‑1通过特异性地抑制IKKβ表达,从而阻断肿瘤组织中的Svv→IKKβ→NF‑κB→Svv循环调控通路,最终显著降低Svv的表达,进而抑制肿瘤的发生、进展;而Svv作为非常重要的原癌基因在几乎所有的肿瘤组织里持续高表达,Svv→IKKβ→NF‑κB→Svv循环调控通路广泛存在于多种肿瘤细胞中,所以TPCA‑1具有用于精准防治Svv→IKKβ→NF‑κB→Svv循环调控通路相关肿瘤的前景。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤的精准防治领域,具体涉及一种通过阻断肿瘤组织细胞中的Svv→IKKβ→NF-κB→Svv循环调控通路,最终显著抑制Svv表达的化合物—IKKβ 激酶特异性抑制剂TPCA-1,在Svv→IKKβ→NF-κB→Svv循环调控通路相关肿瘤精准防治中的用途。
发明背景
Survivin(Svv)的结构与功能特点:Svv的编码基因,BIRC5,位于人类染色体17q25,由三个内含子与四个外显子构成[29]。Svv是IAPs家族最小的成员,野生型Svv由142个氨基酸组成,在胞浆内通常以同源二聚体形式存在。多项研究表明,Svv可与多种内源性及外源性途径的凋亡调控因子相互作用,明显的抑制凋亡的发生。同时,Svv在维持细胞稳态中也扮演了重要的角色,具有多种功能,参与了促进细胞有丝分裂、细胞内信号转导、细胞存活以及促进肿瘤血管生成等多种过程,并可参与DNA损伤修复。此外,Svv还具有转录调控因子的功能,例如对线虫类模式生物C. elegans的研究显示,通过siRNA沉默人Svv的同族蛋白BIR-1,可降低dpy-7和hlh-1基因的表达[34];同样在两栖类模式生物非洲爪蟾中,人Svv的同族蛋白SIX,可与核受体/转录因子RXRα相互作用,调控下游基因的转录。
Svv在已分化的正常组织中几乎不表达,但在绝大多数的癌症组织中持续高表达,提示Svv很可能在肿瘤的发生、进展中起了重要作用。现有研究显示Svv主要参与了肿瘤细胞的凋亡与周期干预调控。比如在食管癌中表达具有以下特征:①在食管癌等多种高发肿瘤标本中其表达阳性率为46.3%-90.0%;②在正常组织中不表达,而在不典型增生和癌组织中逐渐増高;③随着肿瘤的发展其癌组织表达阳性率逐渐升高。类似的结果也在前列腺癌、卵巢肿瘤、膀胱癌、结直肠癌、胰腺导管癌等肿瘤的研究中得出。
κB 、IKKβ的结构与功能特点:NF-κB是一种胞浆/核双相分布的转录因子,静息状态时,NF-κB的p50-p65亚基与抑制因子IκB结合组成一个三聚体p50-p65-IκB,以无活性的状态存在于细胞浆中。在IκBs激酶(IKK)催化IκBs的丝氨酸残基磷酸化后,IκBs发生多泛素化而被蛋白酶体降解,从而使NF-κB从p50-p65-IκB复合体释放、活化,活化的NFκB转位到核内与其相关的DNA序列结合以诱导靶基因转录。NFκB参与对众多炎症因子的转录调控、分子免疫应答以及细胞的凋亡、分化和增生等重要生理病理过程。近年来大量研究表明,NFκB还与多种实体瘤的发生密切相关。
在NFκB活化过程中,IKK的激活是最重要的起始因素,是NFκB信号通路调控的关键环节。IKK可被高血糖、高游离脂肪酸、糖基化终末产物、感染等多种因素激活,进而活化NFκB,启动其下游基因转录。IKK是由一个调节亚单位IKK-γ和两个催化亚单位IKKα,IKKβ组成。IKKα和IKKβ属于丝/苏氨酸蛋白激酶,而IKKγ无催化活性。在经典的NFκB激活途径中,IKKβ的活化起到了非常重要的作用。IKKβ基因敲除实验证实小鼠在缺乏IKKβ情况下,受到炎症细胞因子刺激时,这些小鼠NFκB激活通路出现障碍,由此说明,IKKβ是诱导NFκB活化的主要激酶[15]。
κB对Svv的转录调控: NFκB可正调控Svv的表达。如在肾透明细胞癌RC3细胞系,激活NF-κB可上调Svv的表达;在射线抵抗的HER2(+) 乳腺癌细胞,诱导NFκB可激活Svv的表达并抑制凋亡;而在两种EBV阳性的NKTL淋巴瘤细胞系SNK-6和SNT-8,NFκB可诱导Svv的表达上调;在内皮细胞中,Svv/XIAP 可以通过NIK/TAK/TAX激活IKKβ和NFκB;在内皮前体细胞中存在Id1/PI3K/Akt/NF-κB/Svv 信号通路,Akt通过磷酸化IκB释放NFκB去上调Svv的表达。NFκB在其调控的下游靶基因启动子区具有识别与结合位点。
是IKKβ选择性抑制剂,分子式:C12H10FN3O2S,化学结构为
IC50为17.9 nM,对IKKα有22倍以上的选择性,对其它激酶则有超过550倍的选择性[48]。TPCA-1(3, 10, 或20 mg/kg,i.p., b.i.d.)预防性给药,导致小鼠体内胶原诱导性关节炎(CIA)的严重程度剂量依赖性降低。TPCA-1(10 mg/kg, i.p., b.i.d.)导致的显著降低的疾病严重程度和疾病发作的延迟与抗风湿药,etanercept(4 mg/kg, i.p.)每隔一天预防性给药的作用相当。TPCA-1 和etanercept-处理的小鼠爪子组织中,p65的细胞核定位,以及IL-1β,IL-6,TNF-α,和干扰素-γ的水平显著降低。此外,TPCA-1给药导致体内胶原诱导的T细胞增殖显著减少。TPCA-1以20 mg/kg,而不是3或10 mg/kg,i.p.,b.i.d.治疗性给药显著降低CIA的严重程度,etanercept以12.5 mg/kg, i.p.,每隔一天给药具有同样的效果。
由上可知,现有研究均提示Svv与肿瘤的发生、发展关系非常密切,但是:
(1)在一些肿瘤细胞中,NFκB可正向调控Svv转录,Svv是NFκB的下游靶基因。但是,这一正向调控机制是否在其它常见的肿瘤细胞中存在,它是否可能与Svv正向调控NFkB形成Svv→IKKβ→NF-κB→Svv的正向调控环路均未见报道。
(2)对于Svv作为转录因子的转录调控机制,以及它是如何保持自我表达从无到有、从弱到强并持续高表达的分子调控机制仍无肯定答案。
(3)未见将TPCA-1用于精准防治Svv→IKKβ→NF-κB→Svv正向调控环路相关肿瘤的研究报道。
发明内容
针对在多种肿瘤细胞中是否存在NF-κB正向调控Svv转录,是否可能与Survivin正向调控NFkB形成Svv→IKKβ→NF-κB→Svv的正向调控环路这一问题,我们在Hela细胞与食管鳞癌细胞中、在肺癌、食管永生化细胞、结直肠癌中,均观察到外源性Survivin可以明显提升内源性Svv的表达。得到了在食管、结直肠和肺鳞癌细胞中形成了Svv→IKKβ→NF-κB→Svv的正向调控环路的证据。由于Svv在多种肿瘤细胞里是主要的原癌基因,综合其他人的研究成果,我们认为Svv→IKKβ→NF-κB→Svv的正向调控环路广泛存在于多种肿瘤细胞中。
本发明的目的是:
探寻能阻断肿瘤细胞中Svv→IKKβ→NF-κB→Svv循环调控通路、并最终显著抑制Svv表达,具有用于存在Svv→IKKβ→NF-κB→Svv循环调控通路肿瘤精准防治前景的化合物。
本发明具体技术内容:一种TPCA-1在Svv循环调控通路相关肿瘤精准防治中的用途,TPCA-1通过特异性地抑制IKKβ表达,从而阻断肿瘤组织中的Svv→IKKβ→NF-κB→Svv循环调控通路,最终显著降低Svv的表达。
优选地,所述肿瘤是肿瘤细胞中存在Svv→IKKβ→NF-κB→Svv循环调控通路的肿瘤,外源性Svv明显提升肿瘤细胞内源性Svv表达的同时,也增高IKKβ的表达量;而IKKβ抑制剂在降低肿瘤细胞中IKKβ表达的同时,也显著降低内源性Svv的表达量。
本发明有益效果:(1)外源性Svv通过IKKβ上调内源性Svv蛋白水平,存在Svv→IKKβ→NF-κB→Svv正向调控环路。
(2)IKKβ 激酶特异性抑制剂TPCA-1通过抑制肿瘤细胞Svv→IKKβ→NF-κB→Svv循环调控通路中的IKKβ,达到了最终降低Svv表达的目的,具有用于相关肿瘤精准防治的前景。
附图说明
图1为3×flag-Survivin的PCR扩增
图2为GV-219载体双酶切电泳图
图3为PCR鉴定重组质粒电泳图
图4为Western Blot检测CMV-MCS-3flag-Survivin-SV40-Neomycin质粒的表达
图5为在ECA109细胞中,外源性Svv通过IKKβ上调内源性Svv蛋白水平
图6为SPC-A-1细胞中转染Flag-Survivin重组质粒对Survivin、IKKβ、NF-κB p65在蛋白水平表达的影响。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步介绍本发明的实施及所具有的有益效果,目的在于帮助阅读者更好理解本发明的实质和精神,不能构成对本发明实施范围的限定。
实施例1
在食管鳞癌ECA-109细胞株中,我们观察到外源性Svv通过IKKβ上调内源性Svv蛋白水平。具体表现为:
1、外源性Svv明显提升内源性Svv的表达(图5b);
2、IKKβ特异性抑制剂TPCA-1则降低了内源性Svv的表达量,同时qPCR检测Svv mRNA水平下调了70%(图5a)。
具体实验方法如下:
1.3×flag-Survivin-GV-219质粒构建、转化、抽提及测序
1.1.3×flag-Survivin,3×flag-p107引物设计与扩增
(1)根据GenBank中Survivin(HM625836.1,GI:30436781)编码序列设计PCR引物,并且在上游引物5’端引入XhoI酶切位点,下游引物5’端引入KpnI酶切位点,设计引物在Survivin cDNA前添加3×flag标签识别序列,产物预计长度544bp;(2)根据GenBank中(BC032247.1,GI:2159524)p107编码序列设计PCR引物,并且同样在上游引物5’端引入XhoI酶切位点,下游引物5’端引入KpnI酶切位点,设计引物在p107 cDNA前添加3×flag标签识别序列,产物预计长度3162bp。
扩增条件:98℃ 5 min;98℃ 10s,55℃ 10s,72℃ 90s,30个循环;72℃ 8 min。反应体系如下:ddH2O 32.5 μL,5×PS Buffer 10μL,dNTP MIX 4μL,上游扩增引物1 μL,下游扩增引物1 μL,模板(cDNA)1 μL,Prime STAR HS DNA polymerase 0.5 μL。
和XhoI分别双酶切质粒和PCR扩增产物
(1)GV219载体双酶切。反应条件37℃,2 h;反应体系:KpnI 1 μL,XhoI 1 μL,10×Kbuffer 2 μL,Vector(GV219)3μL,ddH2O 13 μL。(2)PCR扩增产物的双酶切。反应条件:37℃,2h。反应体系:KpnI 1 μL,XhoI 1 μL,10×K buffer 2 μL,DNA 5 μL,ddH2O 11 μL。
连接3×flag-Survivin基因,3×flag-p107基因和GV-219载体
(1)16℃过夜,反应体系:GV-219vector 1 μL,3×flag-SurvivinDNA 3 μL,10×T4DNALigase buffer 1 μL。T4DNA Ligase 1 μL,ddH2O 4 μL。产物交换入线性化表达载体,PCR鉴定引物,PCR鉴定重组克隆,PCR预期阳性转化因子产物844bp;(2)16℃过夜,反应体系:GV-219vector 1 μL,3×flag-p107DNA 3 μL,10×T4DNA Ligase buffer 1 μL,T4DNA Ligase1 μL,ddH2O 4 μL。产物交换入线性化表达载体,PCR鉴定引物,PCR鉴定重组克隆,PCR预期阳性转化因子产物1017bp。
1.4 质粒转化至E.coli DH5α感受态细菌
将含有50 μL感受态细胞的EP管放置于冰上进行解冻,待完全解冻后将细胞悬浮,加2.5 mL连接液后混匀,放置冰上30 min,然后置于42℃水浴进行热激50~60s后,在转至冰上2 min,加200 μL不含AMP抗生素的LB液体培养基,37℃ 220 rpm振荡培养1 h。然后,涂布于含氨苄霉素的LB培养平板上(含IPTG/X-gal),37℃正向放置1 h,颠倒培养过夜,次日挑取LB培养板上的白色单克隆菌落(挑取4个克隆菌落,分别命名为a1,a2,a3,a4)至含有氨苄霉素的LB液体培养基(6~7mL)中,置37℃、200~300 rpm,振荡培养过夜。(2)送菌液测序以鉴定目的基因连接的正确性。(3)用质粒试剂盒抽提质粒双酶切鉴定。
质粒DNA的提取
15 mL离心管中加入6~7 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基,并在Agar固体培养基的菌落中,挑取单个白色单克隆菌接种于LB液体培养基中,于37℃恒温孵育箱内培养13~16h,(1)取过夜培养的菌液,5000 rpm离心5 min收集菌体,(2)在沉淀中加入250 μL BufferP1,将菌体彻底悬浮。(3)加入250 μL Buffer P2,立刻温和颠倒离心管8次,室温静置2min。(4)加入350 μL Buffer P3,立刻温和颠倒离心管8次混匀。(5)13000 rpm离心15 min,将上清移入吸附柱,13000 rpm离心30秒,掉到收集管中的液体。(6)加入500 μL WashSolution,13000 rpm离心30秒,掉到收集管中的液体。(7)重复步骤(6)一次。(8)空吸附柱于13000 rpm离心1 min.(9)将吸附柱放入一个高压过的1.5 ml EP管中,在吸附膜中央加入50 μL Elution Buffer,室温静置1 min后,离心1 min。将得到的质粒DNA溶液用于后续实验或者放置于-20℃进行保存。
质粒测序
所构建质粒DNA序列的准确性需经过测序鉴定,测序公司为上海生工生物工程有限公司。
质粒浓度测定
(1)取2 μL抽提好的质粒DNA,加入98 μL ddH2O,混匀;(2)将ddH2O作为空白对照,在波长260 nm、280 nm处调节紫外分光光度计的读数为0;(3)将配置好的质粒稀释液,在波长260 nm、280 nm处测定吸光值;(4)记录吸光度值,然后计算求得质粒的浓度。
2.细胞培养
2.1细胞复苏 从液氮罐中取出一支ECA109细胞冻存管,套上PE手套,迅速置于37℃水浴箱中直至完全融化,用75%的医用酒精对冻存管表面进行擦拭。迅速将细胞悬液加入到20mL 1640完全培养基中混匀,接种到2个10 cm直径的细胞培养皿中,十字摇匀法摇匀后,置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48 h,次日观察细胞的形态。
细胞换液配制新鲜1640完全培养基(含10%胎牛血清,1%的青/链霉素双抗),细胞换液前,提前将1640完全培养基置于37℃、5% CO2的培养箱中预热。换液时,移液枪轻轻吸去旧的完全培养基,并轻轻加入10mL新鲜配制的完全培养基,置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
细胞传代实验开始之前取出所有需要的培养液及试剂,提前放置于生物安全柜内预热至室温备用。镜下观察ECA109细胞状态,当细胞达到70%~80%的汇合率时进行传代培养。从培养皿中轻轻吸去旧的培养基,无菌的PBS缓冲液清洗2遍。加入1 mL 胰蛋白酶,缓慢倾斜培养皿,使胰蛋白酶完全覆盖细胞表面。显微镜下观察细胞形态,当细胞变圆开始脱落时(1~3 min),立即加入5 mL新鲜完全培养基。缓慢吹打细胞,并收集细胞至5 mL无菌离心管中,1000 rpm离心5 min。细胞沉淀用完全培养基重悬并计数,按照4×104/ml的密度进行传代,于37℃、5% CO2培养箱中培养。
细胞冻存将过滤后的胎牛血清、1640全培养基和DMSO以 6:3:1 的比例混合配制成冻存液。对细胞培养皿上进入对数生长期的细胞进行消化,消化结束后加入1640完全培养基终止消化,1000 rpm,离心5 min使细胞沉淀。将前面配好的冻存液加入细胞中,柔和的吹打细胞沉淀使其悬浮,通过冻存管进行分装,每管1ml,写上细胞名称和日期。细胞冻存的方法:第一步4℃ 40 min、第二步-20℃ 60 min、第三步-80℃过夜,最后用液氮将冻存管长久保存;另外也可以采用第一步 4℃30 min,再放入到壁厚 1 cm 以上的泡沫塑料盒,并且进行密封处理。第二步-80℃冰箱 24 h 以上,最后小心放入液氮罐冷冻储存。后者一般使用于中期保存。
细胞准备将ECA109细胞进行传代,取两只 60 mm 直径的培养皿(含有无抗性培养基),一般按照1×105~2×105 /cm 2 的比例重新进行接种,放入37℃、5% CO2的温箱保持培养24 h。
细胞电转仔细观察细胞形态确定细胞没有长满或者处于静止期,转染时应等到细胞长至85%-90%汇合度时即可开始。(1) 弃取旧的培养基,用2 mL的PBS清洗细胞表面后,弃掉。(2)取1.5 mL胰酶放入培养瓶中,放置37 ℃、5% CO2培养箱进行消化3 min后,立即加入1 ml新鲜1640完全培养基。缓慢吹打细胞,并收集细胞至15 ml无菌离心管中,1000 rpm离心5 min。(3)弃去上清液,加入无菌的PBS将细胞悬浮,1000 rpm离心5 min。(4)弃去上清液,加入Opti-MEM转染液将细胞悬浮,1000 rpm离心5 min。(5)弃去上清液,加入Opti-MEM转染液将细胞悬浮。(6)用移液枪吸取400 μL的Opti-MEM细胞悬浮液和相对应的质粒加入到电转杯中。(7)用电转移进行电转。(8)电转后离心将上清液弃取,加入新的1640全培养基,置于六孔板中。(4)转染后置于温箱(37 ℃、5%CO2 )中继续培养,大概24 h细胞即可将培养皿底部长满。在温箱培养期间,每过12 h需要换一次培养液。
3.蛋白抽提与检测
3.1细胞裂解/细胞核蛋白抽提 (1)将培养皿中原有的旧培养液弃去,加入预冷的 PBS溶液轻轻洗涤两遍后将PBS 弃去。(2)将冰上预冷的IP裂解缓冲液加入到细胞中(六孔板,每孔300 μL),冰上孵育5 min并定期混匀。(3)将细胞裂解液转移到EP管中,14000 rpm离心5~10 min。(4)将上清液转移到一个新的EP离心管中,进行蛋白浓度测定。
蛋白浓度检测(1)蛋白标准品的配置(如下表所示)。(2)在96孔板中,第一排的9个孔内从低到高依次加入各个浓度的蛋白标准品各25 μL;第二排再依次加入待测蛋白样品各25 μL,每个待测蛋白样品设3个复孔。(3)加入200 μL的A与B工作混合液(50:1),混合均匀,贴上封板膜。(4)37℃孵育箱放置30 min。(5)使用紫外分光光度计在562 nm处测定蛋白的吸光度。(6)通过标准曲线,计算蛋白浓度。
3.3 Western-blot(SDS-PAGE)
(1)配制5%浓缩胶以及适宜浓度(10%或者12%)的分离胶(根据蛋白分子量的范围),并进行制胶。
TEMED | 0.006mL | 0.005mL |
(2)首先按照分离胶的配方先配置分离胶,然后加ddH2O封层,等分离胶完全凝固后(大约30 min),将小心将ddH2O用滤纸吸干净,在配浓缩,灌胶后,立即插梳子。等浓缩胶完全凝固后(大约30 min),将胶从胶架上拿出,用ddH2O将胶板表面冲洗干净,卡在电泳槽里,倒入适当的电泳液,进行加样。(3)每孔加样20 μL,80 V 电压进行电泳,20 min后将电压改为100 V。当观察到溴酚蓝开始要离开凝胶时电泳就可以停止,开始进行转膜。(4)电泳结束后,回收电泳液,将浓缩胶切除,将分离胶浸泡在转膜缓冲液中进行湿转。并根据分离胶的大小裁剪相应的PVDF膜和滤纸,PVDF膜提前用甲醇处理好(将PVDF浸泡在甲醇中60s后立即拿出,放入ddH2O中漂洗2s),将处理好的PVDF膜浸泡在转膜液中,滤纸和转膜垫也提前在转膜液中浸泡。将泡好转膜垫、滤纸、胶、膜按顺序依次叠放,并用玻璃棒赶除气泡后放入转膜槽中,250 mA恒流转膜45 min,将蛋白质从凝胶中转移到PVDF膜上。(5)转膜结束后,将PVDF膜拿出,用 TBST 溶液对 PVDF 膜进行漂洗5 min。(6)在室温下,取5%的脱脂奶粉的 TBST加入将膜浸润,进行封闭15 min。(7)将膜从封闭液中取出,使用 TBST 溶液再次洗膜,5min。(8)一抗孵育:PVDF膜封闭,洗膜结束后,根据蛋白的大小,对膜进行裁剪,并置入含有TBST稀释的一抗中(Survivin为l:1000,p107为1:800,β-actin为1:1500)室温1 h或者4℃过夜;从一抗中取出孵育的PVDF膜,置于TBST中,水平摇床上,缓速洗膜三次,每次10 min。(9)二抗孵育:洗膜结束后,将PVDF膜放置于具有辣根过氧化物酶标记的二抗体中(1:5000)室温下孵育20 min,再置于TBST中,水平摇床上,洗膜三次,每次10 min。 (10)显影,将待发光的PVDF置于保鲜膜上,取ECL化学发光剂盒中A试剂和B试剂各100~200 μL,以1:1等比例混合,用加样枪均匀的滴在膜上,90s后用纸吸除过量的溶液,将待发光的PVDF膜包在保鲜膜里,用ImageLab软件,进行发光和分析,β-actin做为内参对照,从而检测蛋白的表达水平。
4. 结果
4.1 重组质粒的鉴定
4.1.1 3×flag-Survivin片段的扩增
使用3×flag-Survivin作为模板进行PCR扩增得到的PCR产物后,进行琼脂糖凝胶电泳,可见在约544bp处有一条特异性扩增区带(图1中标识1),与预计的目的片段大小位置相符。
载体双酶切电泳图
用XhoI 和 KpnI 双酶切GV-219载体,进行琼脂糖凝胶电泳,可见在约6kb处有一条特异性扩增区带(图2中标识3)
4.1.3 PCR鉴定3×flag-Survivin重组质粒
对3×flag-Survivin重组质粒进行PCR扩增,进行琼脂糖凝胶电泳,可见在约844bp处有一条特异性扩增区带(图3中标识4)与预计的目的片段大小位置相符。
4.2. 过表达载体细胞转染后表达蛋白的western-blot验证
4.2.1 CMV-MCS-3flag-Survivin-SV40-Neomycin的过表达Survivin
蛋白的Western Blot验证
在食管癌ECA109细胞中,为了验证CMV-MCS-3flag-Survivin-SV40- Neomycin质粒在ECA109细胞中是否正常表达Survivin,我们将此质粒转染ECA109细胞,将CMV-MCS-3flag-SV40-Neomycin质粒作为阴性对照,空白的ECA109细胞作为空白对照,转染24h后收集细胞蛋白,用anti-Survivin抗体,anti-Flag标签抗体进行实验检测,结果如图4标识1。结果显示CMV-MCS- 3flag-Survivin-SV40-Neomycinp质粒能够表达Survivin蛋白。其中,在19.0kD的位置检测出含Flag标签的Survivin蛋白(外源性Survivin),在16.5kD的位置检测出Survivin蛋白(内源性Survivin)。.
实施例2
我们用实施例1相同的方法,在肺腺癌细胞株(SPC-A-1 )中观察到:
1、外源性Svv明显提升内源性Svv的表达(图6a泳带3),同时也增高IKKβ的表达量(图6b泳带3);
2、IKKβ特异性抑制剂TPCA-1则在降低IKKβ的表达量(图6b泳带4)的同时,也降低了内源性Svv的表达量(图6a泳带4)。
Claims (3)
1.TPCA-1在Svv循环调控通路相关肿瘤精准防治中的用途,其特征在于,所述肿瘤是肿瘤细胞中存在Svv→IKKβ→NF-κB→Svv循环调控通路的肿瘤,TPCA-1通过特异性地抑制IKKβ表达,从而阻断肿瘤组织中的Svv→IKKβ→NF-κB→Svv循环调控通路,最终显著降低Svv的表达。
2.根据权利要求1中所述的TPCA-1在Svv循环调控通路相关肿瘤精准防治中的用途,其特征在于:所述肿瘤是食管癌。
3.根据权利要求1中所述的TPCA-1在Svv循环调控通路相关肿瘤精准防治中的用途,其特征在于:所述肿瘤是是肺癌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910228576.6A CN109925311A (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | 一种TPCA-1在Svv循环调控通路相关肿瘤精准防治中的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910228576.6A CN109925311A (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | 一种TPCA-1在Svv循环调控通路相关肿瘤精准防治中的用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109925311A true CN109925311A (zh) | 2019-06-25 |
Family
ID=66988086
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910228576.6A Pending CN109925311A (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | 一种TPCA-1在Svv循环调控通路相关肿瘤精准防治中的用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109925311A (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103417533A (zh) * | 2013-07-09 | 2013-12-04 | 白银博赛宁生物科技有限公司 | Tpca-1作为stat3信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用 |
WO2017004181A1 (en) * | 2015-06-30 | 2017-01-05 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods involving downregulating apobec3b |
-
2019
- 2019-03-25 CN CN201910228576.6A patent/CN109925311A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103417533A (zh) * | 2013-07-09 | 2013-12-04 | 白银博赛宁生物科技有限公司 | Tpca-1作为stat3信号抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用 |
WO2017004181A1 (en) * | 2015-06-30 | 2017-01-05 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods involving downregulating apobec3b |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108486159B (zh) | 一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统及其应用 | |
CN109517820A (zh) | 一种靶向HPK1的gRNA以及HPK1基因编辑方法 | |
CN110244056B (zh) | Znf521基因在制备肝癌治疗药物、诊断及预后评估试剂中的应用 | |
CN103773802B (zh) | Hip-55蛋白在开发抑制肿瘤药物中的应用 | |
CN111793134A (zh) | 一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂 | |
CN110960677B (zh) | Sage1抑制剂在制备药物或试剂盒中的用途 | |
Zhang et al. | Extracellular vesicles promote esophageal cancer progression by delivering lncZEB1-AS1 between cells. | |
CN110974963B (zh) | 用于调节sage1-ints3复合物表达和/或功能的物质的用途 | |
CN115851946B (zh) | CaMK I作为治疗靶点在制备胰腺癌治疗药物中的应用 | |
CN110317878B (zh) | 一种用于膀胱癌诊治监测的长链非编码rna及其应用 | |
CN110237257B (zh) | Ube3a泛素化PP2A激活因子PTPA在治疗天使综合症和孤独症中的应用 | |
CN109925311A (zh) | 一种TPCA-1在Svv循环调控通路相关肿瘤精准防治中的用途 | |
CN112190712A (zh) | 氢巯基氧化酶1激动剂和索拉菲尼联合在制备治疗肝癌细胞中的应用 | |
CN113980963B (zh) | 一种寡核苷酸rna双链分子及其在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用 | |
CN109988765A (zh) | 一种fendrr基因的靶向抑制剂及其用途 | |
CN112501239B (zh) | Tak1抑制剂抑制pdl1的检测方法及其在制备抗pdl1药物中的应用 | |
CN110354279A (zh) | 抑癌基因zcchc10在肺癌诊断与预后判断及治疗药物中的应用 | |
CN106729756A (zh) | 生物标志物作为靶标在肺腺癌诊治中的应用 | |
CN106177906B (zh) | Ddb1蛋白的应用 | |
CN107868785B (zh) | 肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用及ruvbl1基因作为药物靶标在筛选抗肺癌药物中应用 | |
CN106075396B (zh) | Cul4蛋白的应用 | |
CN107082811B (zh) | 一种嵌合抗原受体并融合诱导性凋亡酶的复合蛋白 | |
CN115998846A (zh) | Smim26蛋白以及slc25a11蛋白在肾癌中的应用 | |
CN115094134B (zh) | Pcsk9在巨噬细胞m2型极化及其相关疾病中的应用 | |
CN109706173A (zh) | 一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190625 |