CN103403553B - Sirt6的调节物及其筛选分析 - Google Patents

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Abstract

一种鉴定Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性调节物的方法，其中在Sirt6、PfSir2a或Sirt7使底物去酰基的条件下，在存在候选化合物的情况下将含有酰基-赖氨酸部分和指示物部分的脂肪-酰基化底物与Sirt6、PfSir2a或Sirt7接触，其中所述酰基是疏水性脂肪酰基基团，其含有至少三个通过碳-碳键连接的碳原子的烃基；将所述去酰基化的底物与裂解试剂接触，所述裂解试剂裂解所述赖氨酸与指示物部分之间的连接以产生可检测的信号；且由此关联定量的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶的活性。本申请还描述了Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的调节化合物，及其药物组合物，通过给予所述调节化合物的治疗方法，以及实施所述方法的试剂盒。

Description

SIRT6的调节物及其筛选分析
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年12月22日提交的申请号为61/426,231的美国临时专利申请的优先权，其在此全文参考并入。
关于联邦政府资助研究的声明
本申请是在美国国立卫生研究院提供的合同号为GM086703的政府资助下进行。政府对本申请享有一定权利。
发明背景
去乙酰化酶（Sirtuin）是一类称为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性去乙酰基酶的酶。人类有七种sirtuin，Sirt1-7，其调控多种生物学过程，包括衰老、转录和代谢。因此，能够调节sirtuin活性的小分子可以用于治疗若干人类疾病。
在这七种人类sirtuin中，Sirt6特别重要，因为其作用为调控代谢和基因组的稳定性。Sirt6的生物学功能使其有望成为治疗脂肪肝疾病、肥胖症和糖尿病的靶点。因而，能够活化、抑制或以其他方式调节Sirt6的小分子将在治疗此类疾病和状况中非常有益。
疟疾寄生虫恶性疟原虫含有两个sirtuin，PfSir2a和PfSir2b。已知这些sirtuin调控致病基因的表达、抗原变异和抗原基因的表达，其有助于疟疾寄生虫逃避宿主免疫系统的检测。因而，能够抑制或以其他有益方式调节这些sirtuin的小分子能够用于治疗疟疾，这也将是非常有益的。
Sirt6和PfSir2a抑制物的研发受到缺乏对Sirt6和PfSir2a有效的活性分析特别是能够用于高通量筛选的方法的阻碍。研发有效的Sirt6和PfSir2a活性分析的这种困难主要是由Sirt6和PfSir2a的去乙酰基酶活性非常弱造成的。在这七种哺乳动物sirtuin中，Sirtuin4-7具有较弱的或不具有去乙酰基酶活性。已知Sirt6的功能为是组蛋白H3K9-和H3K56-特异性去乙酰基酶，因为其他酰基肽不能被Sirt6水解。然而，去乙酰基酶的活性非常弱，迄今为止尚无kcat和Km检测的报告。类似地，已知PfSir2a的去乙酰基酶活性比人Sirt1弱得多。
发明简述
本申请发现了当赖氨酸上的酰基基本上是疏水的，特别是当酰基含有较高碳原子数（例如，至少5、6、7、8、9、10或更高的碳原子数）的烃基如长链烷基或烯基时，Sirt6是酰基-赖氨酸残基的选择性去酰基酶。Sirt6的这种选择性活性与已知的其他sirtuin的选择性形成鲜明对比。例如，Sirtuin1、2和3已知具有强劲的去乙酰酶活性，而Sirtuin5已知能够容易地从赖氨酸残基上除去丙二酰基、琥珀酰基和戊二酰基。相反地，本申请发现了与其去乙酰基酶活性相比，Sirt6明显能够更加有效地（例如，有效性超过30倍以上）从赖氨酸残基上除去长链疏水性脂肪酰基。与Sirt6类似，人们发现PfSir2a和Sir7的去乙酰基酶活性也非常弱，但其能够更高效地除去长链脂肪酰基。
利用Sirt6这种新发现的活性，本申请描述了一种方法，该方法能够在不同条件下和存在任意多种可能的Sirt6调节物的情况下，有效测定Sirt6（和具有类似活性的sirtuin，如PfSir2a和Sirt7）的活性水平。因此，尽管通过观察去酰基酶的活性几乎无法测定Sirt6、PfSir2a或Sirt7的活性水平或鉴定其调节物（即，调控物，包括活化物或抑制物），但是本申请已发现了一种通过引入含有长链脂肪酰赖氨酸结构的底物测定Sirt6、PfSir2a或Sirt7的活化水平或鉴定其调节物（即，调控物，包括活化物或抑制物）以及测定不同条件下Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-介导酰基水解的效能的有效方法。本申请描述的方法还能有利地用于对能够调节Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性的小分子进行高通量筛选。
通过本申请描述的方法鉴定的Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-特异性调节物能够用于治疗或预防多种以Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性异常或处于非最佳状态为特征的多种疾病。这些疾病包括与代谢（例如，肥胖症）、糖尿病、疟疾和基因组稳定性相关的那些疾病。
本申请还发现哺乳动物的组蛋白具有长链脂肪酰基赖氨酸修饰，Sirt6的生理学作用可能是除去这些脂肪酰基修饰。因此，Sirt6可能能够通过除去组蛋白上的修饰来调控某些基因的转录，这提示了组蛋白赖氨酸长链脂肪酰化是参与转录调控的新型表观遗传学修饰。尽管短链脂肪酰修饰如乙酰化能够调控转录是公知的，但是长链脂肪酰化如在组蛋白上的豆蔻酰化参与表观遗传学修饰迄今为止仍是未知的。由于转录调控对正常和病变细胞均很重要，因而所述的新型表观遗传学修饰能够有针对性地治疗多种疾病。
更具体地，用于鉴定Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性调节物的方法（即，分析）包括：（i）在Sirt6、PfSir2a或Sirt7使底物去酰基的条件下，在存在候选化合物的情况下将酰基化的底物与Sirt6、PfSir2a或Sirt7接触以提供去酰基的底物，其中所述酰基化的底物含有酰基-赖氨酸部分和指示物部分，所述酰基含有至少三个、四个或五个通过碳-碳键连接的碳原子的烃基，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，并且其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代，以及其中所述赖氨酸的侧链ε-氨基丁基基团可以衍生化；（ii）将去酰基的底物与裂解试剂接触，所述裂解试剂裂解所述赖氨酸和指示物部分之间的连接以释放所述指示物部分并产生具有信号强度的可检测信号；以及（iii）将所述信号强度与Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相关联；其中通过存在所述候选化合物的条件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相对于不存在所述候选化合物的条件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的变化，将所述候选化合物鉴定为Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的调节物。
候选化合物可以是在上文所述的分析中检测的任意化学物质（例如，分子或大分子，如蛋白或核酸）。依据分析结果，可以确定候选化合物是否是Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的调节物（例如，抑制物或活化物）。在特定实施方式中，候选化合物或调节物具有下述化学结构：
在上述式（1）中，R1是具有至少三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个通过碳-碳键连接的碳原子的烃基，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，并且其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代；R2选自S、NR6和O，其中R6是氢原子或烃基R；X1、X2和X3独立地选自–(CH2)n–、–NR12–、-O-、-S-或键，其中R12是氢原子或烃基R，以及其中n表示1、2或3；R5是氢原子或烃基R；R3和R4独立地是氢原子或烃基R；其中所述烃基R独立地为未取代的或者被一个或多个选自N、O、S、P和F的杂原子或含有一个或多个所述杂原子的杂原子基团所取代，其中R4还可以是OH或SH。
上文所述的分析中使用的酰基化底物一般具有上述式（1）中提供的上述特征，但是其还必须含有指示物部分。在特定实施方式中，所述酰基化底物具有下述化学结构：
在上述式（2）中，R7是具有至少三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个通过碳-碳键连接的碳原子的烃基，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，以及其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代；R8选自S、NR13和O，其中R13是氢原子或烃基R；X4、X5和X6独立地选自–(CH2)n–、–NR14–、–O–、–S–或键，其中R14是氢原子或烃基R，以及其中n表示1、2或3；R11是氢原子或烃基R；以及R9和R10独立地是氢原子或烃基R，其中R10还可以是OH或SH，以及其中R9和R10中的至少一个是指示物部分；其中所述烃基R独立地为未取代的或者被一个或多个选自N、O、S、P和F的杂原子或含有一个或多个所述杂原子的杂原子基团所取代。
本申请还涉及一种治疗受累于特征为Sirt6或Sirt7去酰基酶活性异常或处于非最佳状态的病症的主体的方法，其包括给予所述主体用于治疗所述病症的药学有效量的上文所述的调节化合物。
本申请还涉及一种用于鉴定Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的试剂盒，其包括上文所述的酰基化底物和裂解试剂，仅当所述酰基化底物去酰基化后所述裂解试剂裂解所述赖氨酸和指示物部分。所述试剂盒还可以包括例如Sirt6、PfSir2a或Sirt7样品、一种或多种候选化合物、候选化合物前体、一种或多种酰基化底物前体、一种或多种指示物化合物、淬灭剂、和/或一种或多种用于联合试剂和/或检测去酰基化酶活性的器件，如在进行用于测定酶活性的动力学测试中使用的任意器件或装置。
附图的简要说明
图1A，1B。Sirt6水解乙酰基和肉豆蔻酰基H2BK12肽的高效液相色谱（HPLC）图（A）和Sirt6水解乙酰基和肉豆蔻酰基H4K16序列的HPLC图（B）。未检测到乙酰基肽的水解，但检测到肉豆蔻酰基肽的水解。
图2。不同肽（20μM）与Sirt6（1μM）和32P-NAD（0.1μCi）在37℃下孵育2小时的32P-NAD放射自显影分析的结果。通过薄层层析（TLC）板对反应进行检测，通过放射自显影对32P-标记NAD末端产物进行检测。所有肉豆蔻酰基肽均检测到了Sirt6催化的去肉豆蔻酰基化，但仅H3K9乙酰基肽检测到了Sirt6催化的去乙酰基化。基于32P-NAD分析发现肉豆蔻酰基肽的水解比乙酰基肽更加有效。
图3。根据图2使用的方法获得的不同肽的32P-NAD分析结果，但是在H3K9肽中比较乙酰基、辛酰基、十二烷酰基和肉豆蔻酰基。如图所示，更长的酰基（辛酰基、十二烷酰基和肉豆蔻酰基）能够被Sirt6更有效地水解。
图4A，4B。（A）H3K9肉豆蔻酰基肽与Sirt6和PfSir2a的32P-NAD分析结果显示，PfSir2a具有更低的肉豆蔻酰基肽检测限，其能够检测低至0.03μM的肉豆蔻酰基肽的去肉豆蔻酰化。（B）当将小牛胸腺组蛋白与PfSir2a和32P-NAD孵育时H3K9肉豆蔻酰基肽的2P-NAD检测结果显示形成了脂肪酰基ADPR斑点（根据已检测的），其支持了组蛋白具有脂肪酰基赖氨酸修饰的观点。
图5。对具有强劲的去酰乙基酶活性的sirtuin（Sirt1、2和3）的荧光分析和水解更长脂肪酰基链的sirtuin（Sirt6和PfSir2a）的荧光分析进行比较的示意图。K表示肽中的赖氨酸残基和X表示肽序列中的任意氨基酸。
图6A，6B。图中显示了荧光乙酰基肽-AMC底物（A）和庚基肽-AMC底物（B）对Sirt6和PfSIr2活性的检测能力之间的差异。如图所示，发现庚基肽-AMC能够高效检测Sirt6和PfSir2的活性，而乙酰基肽-AMC对此目的无效。
图7A，7B。式1a中硫代酰胺化合物通式的化学结构（上图，图7A），和通式内的特定硫代酰胺化合物（下图，图7B）。
发明详述
为方便起见，在进一步描述本申请之前，在此对说明书、实施例和所附的权利要求所使用的某些术语进行描述。应根据整个公开的内容和本领域技术人员的理解来解读这些定义。
本文所使用的术语“一”和“一个”指文章中一个或一个以上（即，至少一个）的语法对象。举例来说，除非另有明示，否则“一个元素”可以指一个或多个元素。
术语“氨基酸”旨在包括所有分子，无论是天然的还是合成的，其包括一个氨基官能团和一个酸官能团并且能够包括在天然存在的氨基酸的聚合物中。示例性的氨基酸包括天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物和同源物；具有变体侧链的氨基酸类似物；和前述任意一项的所有立体异构体。在某些实施方式中，术语“氨基酸”仅指二十个已知的必需氨基酸，或其亚类，即甘氨酸（G）、丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）、异亮氨酸（I）、半胱氨酸（C）、甲硫氨酸（M）、苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）、脯氨酸（P）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）、天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、组氨酸（E）、赖氨酸（K）和精氨酸（R）。在某些实施方式中，前述分类中的任意一种或多种或者特定类型的氨基酸被排除。
术语“多肽”以及术语“蛋白”和“肽”，在本文中互换使用，指氨基酸的聚合物。示例性的多肽包括基因产物、天然存在的蛋白、同系物、直系同源物、旁系同源物、片段，以及前述的其他等价物、变体和类似物。其可以包括上文所述任意氨基酸残基中的一种或多种，或其修饰形式，并且一般包括至少10、20、30、40或50个和高达80、100、120、15、200、300、400、500或1,000个氨基酸残基。如本文所使用的，术语“寡肽”一般指具有至少4、5或6个和高达8、10、15或20个氨基酸残基的链。术语“二肽”和“三肽”分别指两个和三个连接的氨基酸残基。
术语“高通量筛选”（HTS）指一种检测用于抑制特定酶活性或细胞过程的小分子抑制物的自动的、大规模的方法。HTS通常检测不同化合物的库以确定其活性。
如本文所使用的，术语“调节物”包括活化或抑制Sirt6、PfSir2a、或Sirt7去酰基酶活性的任意物质。此外，“活化物”指增加、增强或加快Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的物质，而“抑制物”指降低、抑制或阻止Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的物质。
如本文所使用的，术语“烃基”，即“烃基（R）”和“烃基连接物”在第一个实施方式中仅由碳和氢组成。在不同实施方式中，烃基或连接物中的一个或多个可以精确地，或者最少或最多含有例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、或二十个碳原子，或者以任意两个前述碳原子数作为边界的特定范围内的碳原子数。在本文所述的不同化合物中的烃基或连接物，或者在化合物的不同位置中可以具有相同或不同数量（或其优选的范围）的碳原子以独立地调整或优化所述化合物的活性或其他特性。
烃基或连接物可以是例如饱和的和直链的（即，直链烷基或烯基连接物）。直链烷基（或烯基连接物）的一些例子包括甲基（或亚甲基连接物，即-CH2-，或次甲基连接物）、乙基（或乙烯基或二亚甲基连接物，即-CH2CH2-连接物）、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基和正二十烷基（或其各自的连接物类似物）。
或者，烃基或连接物可以是饱和的和支链的（即，支链烷基或烯基连接物）。支链烷基的一些例子包括异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、新戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、以及C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、和C20饱和的支链烃基。支链烯基连接物的一些例子是通过从前述示例性支链烷基中的一个除去氢原子衍生得到的那些基团（例如，异丙烯，-CH(CH3)CH2-）。
或者，烃基或连接物可以是饱和的和环状的（即，环烷基或环烯基连接物）。环烷基的一些例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。环烷基还可以是在两个环基团（例如，二环己基）之间成键或共用（即，稠合）边（例如，萘烷和降莰烷）的多环（例如，双环）基团。环烯基连接物的一些例子是通过从前述示例性环烷基中的一个除去氢原子衍生得到的那些基团。
或者，烃基或连接物可以是不饱和的和直链的（即，直链烯族或烯基或连接物）。当存在一个或多个碳-碳双键和/或一个或多个碳-碳三键时产生不饱和。直链烯基的一些例子包括乙烯基、丙烯-1-基（烯丙基）、3-丁烯-1-基（CH2=CH-CH2-CH2-）、2-丁烯-1-基（CH2-CH=CH-CH2-）、丁二烯基、4-戊烯-1-基、3-戊烯-1-基、2-戊烯-1-基、2,4-戊二烯-1-基、5-己烯-1-基、4-己烯-1-基、3-己烯-1-基、3,5-己二烯-1-基、1,3,5-己三烯-1-基、6-庚烯-1-基、乙炔基、炔丙基（2-丙炔基）、以及C7、C8、C9、C10、C11、C12和含碳数更多的不饱和直链烃基。直链烯基连接物的一些例子是通过从前述示例性直链烯基中的一个除去氢原子衍生得到的那些基团（例如，次亚乙烯基、-CH=CH-、或亚乙烯基）。
或者，烃基或连接物可以是不饱和的和支链的（即，支链烯族或烯基或连接物）。支链烯基的一些例子包括丙烯-2-基、3-丁烯-2-基（CH2=CH-CH-CH3）、3-丁烯-3-基（CH2=C-CH2-CH3）、4-戊烯-2-基、4-戊烯-3-基、3-戊烯-2-基、3-戊烯-3-基、2,4-戊二烯-3-基、以及C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12和含碳数更多的不饱和支链烃基。支链烯基连接物的一些例子是通过从前述示例性支链烯基中的一个除去氢原子衍生得到的那些基团。
或者，烃基或连接物可以是不饱和的和环状的（即，环烯基或环亚烯基连接物）。不饱和的和环状的基团可以是芳香族的或脂肪族的。不饱和的和环状的烃基的一些例子包括环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环己二烯基、苯基、苄基、环庚烯基、环庚二烯基、环辛烯基、环辛二烯基和环辛四烯基。不饱和环烃基还可以是多环基团（如双环或三环多环芳基），通过在两个环基团（例如，联苯基）之间成键或共用（即，稠合）边形成，如萘、蒽、菲、菲那烯（phenalene）或茚。环烯基连接物的一些例子是通过从前述示例性环烯基中的一个除去氢原子衍生得到的那些基团（例如，亚苯基和亚联苯基）。
烃基或连接物中的一个或多个还可以包括一个或多个杂原子（即，非碳和非氢原子），如一个或多个选自氧（O）、氮（N）、硫（S）、磷（P）和卤原子的杂原子，以及含有一个或多个这些杂原子的基团（即，含有杂原子的基团）。含氧基团的一些例子包括羟基（OH）、含羰基（例如，羧酸、酮、醛、羧酸酯、酰胺和脲官能团）、硝基（NO2）、碳-氧-碳（醚）、磺酰基和亚磺酰基（即，亚砜）和氧化胺基团。醚基还可以是聚环氧烷基(polyalkyleneoxide)，如聚环氧乙烷基。含氮基团的一些例子包括伯胺、仲胺、叔胺、季胺、氰（即，腈）、酰胺（即，-C(O)NR2或-NRC(O)，其中R独立地选自氢原子和烃基，如上文所述）、硝基、脲、亚胺基和氨基甲酸酯，其中应理解季胺基团必须带有正电并需要抗衡离子。含硫基团的一些例子包括巯基（即，-SH）、硫醚（即，硫化物）、二硫化物、亚砜、砜、磺酸酯和硫酸酯基团。含磷基团的一些例子包括有机磷酸酯、有机亚磷酸酯和有机膦酸酯基团。本文中考虑的卤原子的一些例子包括氟、氯和溴。上文所述杂原子（例如，氧、氮和/或硫原子）中的一个或多个可以在上文所述的任意烃基中插入到碳原子之间（例如，-O-、-NR-、或-S-）或者取代碳原子（或亚甲基）以形成杂原子取代的烃基或连接物。或者，或此外，一个或多个含杂原子的基团可以取代烃基或连接物上的一个或多个氢原子。
在特定实施方式中，烃基为或包括环或多环基团，该环或多环基团包括至少一个环杂原子（例如，一个、两个、三个、四个、或更多个杂原子）。此类环杂原子取代的环基团在本文中称为“杂环基团”。如本文所使用的，“环杂原子”是碳和氢以外的原子（典型地，选自氮、氧和硫），其插入到烃环结构中、或取代烃环结构中的环碳原子。在某些实施方式中，杂环基团是饱和的，而在其他实施方式中，杂环基团是不饱和的（即，脂肪族或芳香族杂环基团，其中所述芳香族杂环基团在本文中也称为“杂芳环”，或者当至少有两个稠环，其中至少一个稠环中含有至少一个环杂原子时称为“杂芳稠环系”）。在某些实施方式中，杂环基团通过其环碳原子中的一个与另一个基团连接（即，不是氢原子和相邻的环原子），而一个或多个环杂原子不与另一个基团连接。在其他实施方式中，杂环基团通过其杂原子中的一个与另一个基团连接，而环碳原子可以与或者可以不与另一个基团连接。
饱和杂环基团的一些例子包括含有至少一个氧原子的那些基团（例如，氧杂环丁烷、四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二恶烷、1,3-二恶烷、和1,3-二氧杂环庚烷(1,3-dioxepane)环），至少含有一个氮原子的那些基团（例如，吡咯烷、哌啶、哌嗪、咪唑啉、氮杂环庚烷和十氢喹啉环），至少含有一个硫原子的那些基团（例如，四氢噻吩、四氢噻喃、1,4-二噻烷、1,3-二噻烷和1,3-二硫戊环环基），含有至少一个氧原子和至少一个氮原子的那些基团（例如，吗啉和恶唑烷环），含有至少一个氧原子和至少一个硫原子的那些基团（例如，1,4-噻恶烷）、以及含有至少一个氮原子和至少一个硫原子的那些基团（例如，噻唑烷和硫吗啉环）。
不饱和杂环基团的一些例子包括含有至少一个氧原子的那些基团（例如，呋喃、吡喃、1,4-二恶英和二苯并二恶英环），含有至少一个氮原子的那些基团（例如，吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、1,3,5-三嗪、吖庚因、二吖庚因、吲哚、嘌呤、苯并咪唑、吲唑、2,2’-联吡啶、喹啉、异喹啉、菲咯啉、1,4,5,6-四氢嘧啶、1,2,3,6-四氢吡啶、1,2,3,4-四氢喹啉、喹喔啉、喹唑啉、哒嗪、噌啉、5,6,7,8-四氢喹喔啉、1,8-二氮杂萘、和4-氮杂苯并咪唑环），含有至少一个硫原子的那些基团（例如，噻吩、硫茚和苯并噻吩环），含有至少一个氧原子和至少一个氮原子的那些基团（例如，恶唑、异恶唑、苯恶唑、苯异恶唑、恶唑啉、1,2,5-恶二唑（呋咱）和1,3,4-恶二唑环），以及含有至少一个氮原子和至少一个硫原子的那些基团（例如，噻唑、异噻唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、噻唑啉和1,3,4-噻二唑环）。
在某些实施方式中，下文所述的任意通用取代基（例如，R、R1、R2等）可以独立地排除任意一种或多种类型、亚类或上文所述的特定烃基，或者可以独立地仅包括选自上文所述的烃基（R）的特定烃基。
本文所使用的术语“酰基”指通式为–C(X)R的有机基团，其中X为氧（=O）、硫（=S）或氨基（=NR），R独立地代表烃基。在本申请中，与C(X)连接的烃基R具有至少三个通过碳-碳键连接的碳原子。在不同实施方式中，与C(X)连接的烃基R具有精确地或至少三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个或二十个碳原子，或者以任意两个前述碳原子数作为边界范围的碳原子数（例如，碳原子数的范围为3-20、3-18、3-16、3-14、3-12、3-10、3-8、4-20、4-18、4-16、4-14、4-12、4-10、4-8、5-20、5-18、5-16、5-14、5-12、5-10、5-8、6-20、6-18、6-16、6-14、6-12、6-10、6-8、7-20、7-18、7-16、7-14、7-12、7-10、8-20、8-18、8-16、8-14、8-12、9-20、9-18、9-16、9-14、9-12、10-20、10-18、10-16、10-14、10-12、11-20、11-18、11-16、11-14、12-20、12-18、12-16、12-14、13-20、13-18、13-16、14-20、14-18或14-16个碳原子）。
在一组实施方式中，与C(X)连接的烃基R仅由碳原子和氢原子组成。在另一组实施方式中，与C(X)连接的烃基R由碳原子和氢原子组成，其中一个或多个氢原子可以被一个或多个氟（F）原子所取代。在另一组实施方式中，与C(X)连接的烃基R由碳原子和氢原子、以及任选地一个或多个氟原子，和选自O、N、和S的一个杂原子组成，所述杂原子打断所述烃基（R）的碳-碳键或者取代所述烃基（R）中的碳原子（即，亚甲基或次甲基），但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式，或者任意带电基团形式如醇盐、硫化物、羧酸盐或铵基团的不包括在内，因为这些类型的基团将呈现出酰基部分的强亲水性（即，不具有足够的疏水性）。在某些实施方式中，与C(X)连接的烃基R选自一个或多个直链或者支链烷基、烯基或炔基，其可以包括或不包括一个或多个杂原子；环烷基；芳环；杂环烷基；杂芳基；或烃基，该烃基包括任意一个或多个前述取代基，如烷基-芳基、烷基-杂环基、或烷基-杂芳基。当杂原子取代碳原子时，与C(X)中的碳连接的杂原子包括多种可能，即为C(X)-O-R、C(X)-S-R、C(X)-NH-R、或C(X)-NR-R，其中R基团的各实例均是独立地选择。
在一个方面，本申请涉及一种鉴定Sirt6、PfSir2a、或Sirt7去酰基酶活性调节物的方法。在一个优选实施方式中，所述方法以高通量筛选模式实施。
在所述方法的第一部分中，在存在候选化合物的条件下将基本上模拟疏水性酰基化赖氨酸残基的酰基化底物（即，底物）与Sirt6、PfSir2a、或Sirt7接触。为了使酰基化底物有效，根据能够确证Sirt6、PfSir2a、或Sirt7针对特定底物（针对这一目的的一些通用方法见图5）的可检测活性的任意适宜的实验方案，选择已知能被Sirt6、PfSir2a或Sirt7有效去酰基化的基团作为底物的酰基-赖氨酸部分的酰基（即，“酰基-赖氨酸模拟部分”）。如果发现下述任意此类附加特征对酰基化活性的水平具有显著影响，则可以对除酰基-赖氨酸部分以外（例如，与赖氨酸部分的氨基或羧基末端连接的那些基团，或特定肽序列）的其他结构特征进行适宜的调整以提供更加有效的底物。
可以以任意适宜的方式对所述底物的赖氨酸部分进行衍生化或修饰，但需要保留其基本的氨基酸结构。特别地，可以对赖氨酸部分的侧链ε-氨基丁基进行修饰。例如，所述赖氨酸部分可以是-NH-CH(R’)-C(O)-的形式，其中R’是侧链，其可以是在NH（酰基）或NR（酰基）基团末端一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个碳原子的烷基或者烯基链。R’中的烷基或烯基链还可以包括或不包括一个或多个选自N、O和S的杂原子，其中所述杂原子或者插入两个碳原子之间或取代碳原子（或亚甲基），或者以杂原子基团的形式如C(O)。此外，如果所述赖氨酸部分不是寡肽或多肽结构的一部分，则骨架(backbone)NH（NH末端）可以与烃基（R）连接，或NH的氢原子被烃基（R）取代，和/或骨架C(O)可以与烃基（R）、或基团-OR、或基团-SR、或基团-NHR、或基团-NR2连接，其中各R基均独立地选择。
所述底物与指示物部分连接。所述键是共价键，仅当除去赖氨酸上的酰基后其才能够被裂解剂裂解。在特定实施方式中，所述共价键是在赖氨酸部分的羧基末端与指示物化合物的氨基之间形成的酰胺键。优选地，指示物部分不与底物的酰基部分连接，因为其可能会消除本文所述的用于产生信号的特有机制。当在使任意这些sirtuin将底物去酰基化的条件下将所述底物与Sirt6、PfSir2a或Sirt7接触时，酰基的除去使得裂解剂能够裂解赖氨酸与指示物部分之间的键，以释放指示物部分。指示物部分的释放导致产生可检测信号。在特定实施方式中，酰基赖氨酸部分通过肽键与至少一个其他氨基酸残基连接，指示物部分与具有酰基的赖氨酸（特别是如果具有酰基的赖氨酸是在末端时）连接或与另一个氨基酸连接，该氨基酸可以是另一个同样酰基化或未酰基化的赖氨酸，特别是当赖氨酸具有的酰基在内部时，即不在末端。
裂解剂可以是能够裂解特定氨基酸残基之间的肽键的任意物质（即，蛋白水解裂解类型），但是当存在酰基化的赖氨酸时不能裂解肽键。根据一个实施方式，裂解剂是蛋白水解酶，即水解肽键的酶（也称为肽酶）。能够作为裂解剂的蛋白水解酶的例子包括但不限于胰蛋白酶、钙蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、肽链内切酶Lys-C、金属肽链内切蛋白酶、纤维蛋白溶解酶、羧肽酶、糜蛋白酶、V8蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、凝血酶、弹性蛋白酶、gluc-C、内切lys-C或蛋白酶K、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、MetAP-2、腺病毒蛋白酶、HIV蛋白酶等。
在特定实施方式中，裂解剂是胰蛋白酶。胰蛋白酶将裂解与底物赖氨酸残基的羧基末端连接的肽。另一种适宜的裂解剂是胃蛋白酶，其水解苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸残基氨基末端的肽键；因此，胃蛋白酶将裂解赖氨酸残基与相邻苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸残基之间的底物肽。
指示物部分是一旦从底物上裂解就可以被检测的任意分子。在一个实施方式中，指示物部分是荧光团。一些常用的荧光团包括荧光素异硫氰酸酯（FITC）、罗丹明的衍生物（TRITC）、香豆素、芘、青色素、马来酰亚胺衍生物染料、CF染料、FluoProbes染料、DyLight荧光剂、Oyester染料、Atto染料、HiLyte荧光剂、萤光素和Alexa荧光剂。萤光素如萤火虫萤光素，当与萤火虫萤光素酶和ATP孵育时能够发光。在特定实施方式中，指示物部分是氨基香豆素荧光团，或者更特别地是氨基甲基香豆素荧光团如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）。
在一些实施方式中，荧光强度或荧光团的发射波长依赖于在荧光团和底物之间是否存在键连。通常使用荧光分光光度计测定荧光团荧光强度或发射波长的改变（即对从底物上裂解前后的结果进行比较）。
在其他实施方式中，与底物连接的荧光团并不一定改变其荧光强度或发射波长，所述荧光强度或发射波长依赖于在荧光团和底物之间是否存在键连，但是其还通过使用淬灭基团标记底物代替来提供可检测信号。例如，可以将荧光团与酰基化赖氨酸的羧基末端连接，同时可以将淬灭基团与肽链中的其他氨基酸或含有酰基化赖氨酸的分子结构中的其他部分连接。在荧光团或淬灭基团裂解以前，由于淬灭基团靠近荧光团因而这些底物的荧光强度较低。在从底物上裂解荧光团或淬灭基团后，荧光强度增强。这使得人们能够测定裂解的底物肽的量。适于本申请使用的淬灭基团的例子包括DNP、BlackHoleQuencherTM部分和DABCYL。在一些实施方式中，淬灭剂还可以是荧光团。
在一些实施方式中，正如在荧光能量转移（FRET）实验中通常使用的，底物中含有荧光团的给体-受体对。在裂解给体或受体荧光团之前，给体和受体荧光团之间足够接近使得能量在给体和受体之间能够转移，这种能量转移可以通过FRET测定。例如，可以将一个荧光团与酰基化赖氨酸的羧基末端连接，以及与处于其邻近位置的给体-受体对的其他成员连接，例如与所述底物的另一部分连接，如所述底物的另一个氨基酸残基，或所述赖氨酸残基的另一部分，如在赖氨酸侧链上。当所述荧光团对中的一个解离后，FRET的信号强度显著降低，其可以与Sirt6、PfSir2a、或Sirt7的活性水平相关联。
候选化合物可以是待检测其能够抑制、活化或以其他方式调节Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的任意分子或大分子（例如，蛋白、多核苷酸或多糖）。在特定实施方式中，候选化合物含有模拟疏水性酰基-赖氨酸的部分，如上文对底物的描述，但是不要求所述候选化合物包括指示物部分（或不包括指示物部分）。不囿于任何理论，据信有效的候选化合物与Sirt6、PfSir2a或Sirt7形成稳定（stalled）的共价中间体。因此，候选化合物可以包括有利于与Sirt6、PfSir2a或Sirt7发生这种相互作用的任意结构特征，以使得候选化合物成为更加有效的调节物。
在一个实施方式中，所述候选化合物是小分子。“小分子”指小的有机化合物，如杂环、肽、糖类、类固醇等。小分子调节物的分子量优选低于或高达约5000、3000、1500道尔顿、1000道尔顿、800道尔顿、或甚至低于约500道尔顿。可以对化合物进行修饰以增强例如效能、稳定性或药学相容性。
在所述指示物部分裂解后，检测由裂解反应产生的信号强度。通过本领域公知的用于在信号强度与酶活性之间建立相关性的方法，建立裂解反应产生的信号强度与Sirt6、PfSir2a、或Sirt7去酰基酶活性之间的相关性。将存在候选化合物时观察到的去酰基酶活性与除了不存在候选化合物以外在相同或基本相同的条件下的相同去乙酰化酶的去酰基酶活性（即，对照去酰基酶活性）进行比较。可以通过进行单独的实验获得对照去酰基酶活性的值，在该实验中，在不存在候选化合物的条件下，在Sirt6、PfSir2a或Sirt7使底物去酰基的条件下将所述酰基化底物与Sirt6、PfSir2a或Sirt7接触，再将去酰基化的底物与裂解剂接触，并观察信号强度。用于测定对照去酰基酶活性值的实验可以作为本方法的另一个步骤，直接在上文所述的包括候选化合物的方法之前或之后进行。或者，对照去酰基酶活性的值可以来自此前的实验，这样就不需要在上述方法中重新确立。
如果对照去酰基酶活性的值和在存在候选化合物时得到的去酰基酶活性的值之间不存在差异，则可以得出结论候选化合物不是Sirt6、PfSir2a或Sirt7的调节物。反之，如果对照去酰基酶活性的值和在存在候选化合物时得到的去酰基酶活性的值之间存在差异，则可以得出结论候选化合物是Sirt6、PfSir2a或Sirt7的调节物。当与不存在候选化合物时Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶的活性相比，在存在候选化合物时Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶的活性降低时，则将候选化合物鉴定为Sirt6、PfSir2a或Sirt7的抑制物。当与不存在候选化合物时Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶的活性相比，在存在候选化合物时Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶的活性增加时，则将候选化合物鉴定为Sirt6、PfSir2a或Sirt7的活化物。
为进行测定Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性的检测，首先将含有Sirt6、PfSir2a或Sirt7的样品与本文所述的适宜底物接触并在适当的条件下孵育。术语“样品”指所关注的含有纯化的、部分纯化的或未经纯化的Sirt6、PfSir2a或Sirt7的任意样品，其可以是细胞或组织的溶解产物(lysate)，或者Sirt6、PfSir2a或Sirt7蛋白的制备物（纯化自细胞或组织或者是重组的表达系统）。在Sirt6、PfSir2a或Sirt7样品和底物之间的孵育期结束后，将裂解剂与适宜的反应缓冲液一并加入反应中。在这一第二孵育期结束后，使用水或其他中性pH缓冲液稀释反应，利用在所使用的荧光团适宜的激发和检测波长下检测荧光的荧光检测器记录荧光。然后建立信号强度与Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性之间的相关性。或者，在酰基化底物中存在Sirt6、PfSir2a或Sirt7和候选化合物时加入裂解剂，这样不需要进行用于裂解反应的第二步。
在一些实施方式中，以微型板形式进行检测。例如，可以将底物肽加入反应缓冲液中，并将溶液倒入用于荧光检测的微型板的孔中，然后对板进行孵育。如果要观察候选化合物的作用，则可以将候选化合物与底物孵育。接下来，将等量的Sirt6、PfSir2a或Sirt7样品加入各孔中，并令其在给定时间内进行去酰基化反应。随后或同时，将等量的蛋白水解酶和适量的反应缓冲液加入各孔中，然后使用荧光酶标仪定期测定溶液的荧光强度。
检测可以是小型化和自动化的以用于高通量分析。检测还可以在一个或多个独立容器中进行；但是本检测的优势之一是其能够在单一容器如微型板的孔中进行，其便于使用和自动化。在需要固化的情况下，底物还可以任选地固化于固体材料上，如通过生物素-抗生物素蛋白链菌素键。
本申请提供的另一种检测是液相色谱-质谱（LCMS）检测。在该检测中，通过与Sirt6、PfSir2a或Sirt7接触后测定底物肽和产物肽的量来鉴定Sirt6、PfSir2a或Sirt7的活性。可以通过LC色谱图中产物峰和底物峰紫外光吸收（如在215nm或280nm）的面积，或者通过质谱中产物离子和底物离子的离子强度进行定量。在底物（例如，酰基化的肽）和产物（即，去酰基化的肽）的量的比较与Sirt6、PfSir2a、或Sirt7对底物活性的量之间建立相关性。在该检测中，产物的量增加表明具有Sirt6、PfSir2a、或Sirt7活性，产物的量较低或没有产物表明Sirt6、PfSir2a、或Sirt7的活性较低或没有活性。
使用质谱检测，可以按照如下方法将候选化合物鉴定为Sirt6、PfSir2a、或Sirt7的抑制物或活化物。当与不存在候选化合物时产生的产物（即，去酰基化的肽）相比存在候选化合物时产生的产物减少时，则将候选化合物鉴定为Sirt6、PfSir2a、或Sirt7的抑制物。当与不存在候选化合物时产生的产物（即，去酰基化的肽）相比存在候选化合物时产生的产物增加时，则将候选化合物鉴定为Sirt6、PfSir2a、或Sirt7的活化物。优选地，为了将候选化合物认定为调节物，则存在和不存在候选化合物时活性的差异应至少为20%、30%、40%、50%、60%、70%,、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或以上。
在一些实施方式中，为避免相对于所预测的Sirt6、PfSir2a或Sirt7的酶活性底物不足，在检测中使用过量的底物。特别地，为了在一般的生物样品如细胞核提取物中测定Sirt6、PfSir2a或Sirt7的活性，在反应中使用的底物浓度通常为1至200μM，优选地为20至50μM。还可以根据所使用底物的量调整裂解剂的浓度。典型地，根据预计生成的底物肽的量调整裂解剂的量以使得在给定条件下充分裂解底物肽。在特定实施方式中，当在反应中使用的底物浓度为约0.01至1mM时，所使用的胰蛋白酶的量可以是例如，每60μL反应液中0.2至5μg，优选地为每60μL反应液中1至2μg。
对于第一个反应（Sirt6、PfSir2a或Sirt7引起的去酰基化）而言，反应的pH可以考虑选择Sirt6、PfSir2a或Sirt7的最佳pH值。通常将pH调整至pH6.0至8.5，或者更特别地，pH6.8至8.5。反应缓冲液优选提供上述pH值。例如，在本方法中可以使用Tris-HCl、HEPES-KOH和其他此类缓冲液。更特别地，例如，可以使用pH7.4的20mMTris-HCl。一般情况下，NAD是Sirt6、PfSir2a或Sirt7发挥作用所需的共底物，其通常的使用浓度为约0.5mM。在反应溶液中通常还包括盐和防腐剂。例如，可以在反应中加入1mM二硫苏糖醇（DTT）。第一个反应（由Sirt6、PfSir2a或Sirt7引起的去酰基化）可以在35-40℃下孵育2-20小时。特定的示例性孵育条件包括，例如在含NAD（约0.5mM）和DTT（约1mM）的Tris-HCl缓冲液（pH7.4，约20mM）中将底物和含Sirt6、PfSir2a或Sirt7的样品的液体混合物在约37℃下孵育约4小时。对于使用裂解剂的第二个反应而言，将裂解剂与适宜的反应缓冲液一并加入反应中。例如，可以加入胰蛋白酶（1μg）和CaCl2(1mM），将反应在约37℃下孵育约3小时。
在胰蛋白酶孵育后，可以使用水或其他中性pH的缓冲液稀释反应，利用在所使用的荧光团适宜的激发和检测波长下检测荧光的荧光检测器记录荧光。然后如上文所讨论的建立信号强度与Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性之间的相关性。
在特定实施方式中，可能最终被确证为是Sirt6、PfSir2a或Sirt7调节物的候选化合物是具有下述通式化学结构的化合物：
在式（1）中，R1是具有至少三个通过碳-碳键连接的碳原子的烃基。基团R2选自S、NR6和O，其中R6是氢原子或任意上文所述的取代的或未取代的烃基R，或其选择。连接基团X1、X2和X3独立地选自–(CH2)n–、–NR12–、-O-、-S-或键，其中R12是氢原子或任意上文所述的取代的或未取代的烃基R，或其选择。下标n独立地表示1、2或3。在特定实施方式中，X1、X2和X3均选自–(CH2)n–，其中n独立地为1、2或3，或者其中n独立地为1或2，或者其中X1、X2、和X3的n均为1。基团R5是氢原子或任意上文所述的取代的或未取代的烃基R，或其选择。基团R3和R4均独立地是氢原子或任意上文所述的取代的或未取代的烃基R，或其选择，其中R4还可以是OH、NH2或SH。在一些实施方式中，R3和R4中的一个或全部均是含有至少1、2、3、4或5个和高达10、15、20、25、30、40或50个非氢原子的非生物的（即，合成的）基团。在其他实施方式中，R3和R4中的一个或全部均是生物相关的基团，如氨基酸、二肽、三肽、寡肽、多肽（例如，蛋白包括酶、抗体或受体）、核碱基、核苷、核苷酸、二核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、单糖、二糖、寡糖、多糖、生物素、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素或配体，其任意一个均可以是小分子，或者含有数百个非氢原子的大分子。在一些实施方式中，R3和R4中的一个或全部均对Sirt6、PfSir2a或Sirt7起调节作用或者当将调节化合物给予主体时其发挥重要功能，例如R3和/或R4可以使调节物的生物可利用性更强、具有靶向至受体的功能或者具有辅助药物部分的功能。
在式（1）的不同实施方式中，R1是精确地或者至少具有三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个或二十个碳原子，或者以任意两个前述碳原子数作为边界的特定范围内的碳原子数（例如，在3-20、3-18、3-16、3-14、3-12、3-10、3-8、4-20、4-18、4-16、4-14、4-12、4-10、4-8、5-20、5-18、5-16、5-14、5-12、5-10、5-8、6-20、6-18、6-16、6-14、6-12、6-10、6-8、7-20、7-18、7-16、7-14、7-12、7-10、8-20、8-18、8-16、8-14、8-12、9-20、9-18、9-16、9-14、9-12、10-20、10-18、10-16、10-14、10-12、11-20、11-18、11-16、11-14、12-20、12-18、12-16、12-14、13-20、13-18、13-16、14-20、14-18或14-16个碳原子范围内的碳原子数）的烃基。
在式（1）的一组实施方式中，烃基R1仅由碳和氢原子组成。在另一组实施方式中，烃基R1由碳和氢原子组成，其中一个或多个氢原子可以被一个或多个氟（F）原子取代。在另一组实施方式中，烃基R1由碳原子和氢原子、以及任选地一个或多个氟原子，和选自O、N和S的一个杂原子组成，所述杂原子打断所述烃基R1的碳-碳键或者取代所述烃基R1中的碳原子（即，亚甲基或次甲基），但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式，或者任意带电基团形式如醇盐、硫化物、羧酸盐或铵基团的不包括在内，因为这些类型的基团将使得酰基部分过于亲水（即，疏水性不足）。其结果可以是例如在R1中具有醚（R-O-R）、硫醚（R-S-R）、仲胺（R-NH-R）或叔胺（R-NR-R），其中在各情况下R基团均独立地选择。在一些实施方式中，烃基R1选自一个或多个直链或支链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基可以包括或不包括一个或多个杂原子；环烷基；芳环；杂环烷基；杂芳基；或包括任意一个或多个前述取代类型的烃基，如烷基-芳基、烷基-杂环基、或烷基-杂芳基。当杂原子取代碳原子时，包括杂原子与C(=R2)中的碳连接的可能性，即例如C(=R2)-O-R1、C(=R2)-S-R1、C(=R2)-NH-R1或C(=R2)-NR-R1。在一些实施方式中，一个或多个后面的可能性被排除。
在式（1）的特定实施方式中，R2为S，这样就得到如下式所示的候选（或调节物）化合物的亚通式：
在式（1）的其他特定实施方式中，R2为O，这样就得到如下式所示的候选（或调节物）化合物的亚通式：
在式（1）的其他特定实施方式中，R2为NR6，这样就得到如下式所示的候选（或调节物）化合物的亚通式：
还可以由式(1)、(1a)、(1b)、或(1c)所包括的任意化学结构描述底物，不同的是其包括至少一个指示物。优选地，R3和R4中的至少一个为指示物部分或者包括指示物部分。为方便起见，并确保当用于所述检测方法时底物和候选（或调节物）化合物的结构不同，提供下述独立的结构通式以描述底物化合物的示例性集合：
在式（2）中，对R7的定义如上式（1）中对R1的定义，对R8的定义如上式（1）中对R2的定义，对R9的定义如上式（1）中对R3的定义，对R10的定义如上式（1）中对R4的定义，对R11的定义如上式（1）中对R5的定义，以及对X4、X5和X6的定义分别如上式（1）中对X1、X2和X3的定义，不同的是在式（2）所示的任意通用取代中包括至少一个指示物部分，其中优选地，R9和R10中的至少一个是指示物部分。此外，为了区别候选物和底物的结构，将式（1）R2中的NR6指定为如式（2）R8中的NR13。类似地，将式（1）X1、X2和X3中的NR12指定为如式（2）X4、X5和X6中的NR14。在特定实施方式中，R9和R10中的一个是指示物部分并且R9和R10中的一个是氨基酸残基或者含有至少一个氨基酸残基或者R9和R10中的一个是二肽、三肽、寡肽或蛋白。
在式（2）的特定实施方式中，R8为S，这样就得到如下式所示的底物化合物的亚通式：
在式（2）的其他特定实施方式中，R8为O，这样就得到如下式所示的底物化合物的亚通式：
在式（2）的其他特定实施方式中，R8为NR13，这样就得到如下式所示的底物化合物的亚通式：
在一些实施方式中，底物、候选化合物或这两者，具有R3、R4、R9和/或R10作为酰胺连接部分，通常为肽或肽模拟部分。在特定实施方式中，酰胺连接部分不包括一个或多个非酰胺键或基团，如硫代酰胺、硫脲、磺酰胺、砜、硫酰胺、亚砜、有机酯（即，-C(O)O-）、有机硫酯（即，-C(S)O-）、尿素、醚（即，R-O-R）、硫醚（即，R-S-R）、二硫化物、偶氮、氨基甲酸酯（即，-OC(O)NH-）、碳酸酯（即，-OC(O)O-）、亚胺、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯和膦氧化物键或基团。在其他特定实施方式中，所排除的基团是可水解的基团，或者当引入细胞组织时将水解或裂解的基团。在一些实施方式中，如果需要此类水解或者需要赋予分子其他改善的性质如改善的靶向能力、生物分布、或生物可利用性，则可以引入一个或多个此类基团。
合成本文所述的底物和候选（或调节物）化合物的方法是本领域公知的，并且如下述实施例中所描述的。例如，可以使用公知的从胺和羧酸制备酰胺反应条件实现将酰基与赖氨酸侧链的偶联。而且，可以通过例如采用本领域公知的方法使用Lawensson试剂进行的反应实现从羰基氧原子（即，R2或R8）向硫代羰基的转化。
通过确定候选化合物的IC50来测定候选化合物抑制Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性的能力。如本文所使用的，“IC50”或“半数最高抑制浓度”表示抑制一半活性时所需的化合物的量。可以通过构建剂量-应答曲线并且检测不同浓度的化合物降低或阻止酶活性的作用确定化合物的IC50。针对给定的抑制物可以通过确定抑制最高酶活性的一半时所需的浓度计算IC50值。用于获得IC50值的数学分析方法是本领域公知的。
通过确定候选化合物的EC50来测定候选化合物活化Sirt6、PfSir2a、或Sirt7活性的能力。如本文所使用的，“EC50”或“半数最高有效浓度”指诱导基线和最大值之间一半位置的应答的化合物的浓度。因此，分级剂量-应答曲线的EC50表示达到所观察到的最大作用的50%时化合物的浓度。用于计算EC50值的数学分析方法是本领域公知的。
本申请的Sirt6、PfSir2a或Sirt7抑制物优选抑制Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的IC50或EC50低于或等于1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM或100μM，或者以这些值中任意两个为边界的范围内的IC50或EC50值。
在另一个方面，本申请涉及用于测量样品中Sirt6、PfSir2a或Sirt7的活性，和用于筛选抑制或增强上文所述的Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性的化合物的试剂盒。试剂盒至少包含底物或底物前体，其包括如上文所述的酰基化赖氨酸或其模拟物。试剂盒还可以包括一种或多种下述组分：一个或多个Sirt6、PfSir2a或Sirt7样品；如上文所述的裂解剂；一个或多个候选化合物或候选化合物前体；一个或多个指示物化合物；淬灭剂；缓冲液；蛋白-稳定或蛋白-变性组分，如BSA或多元醇，如蔗糖或果糖；和一个或多个针对组合试剂和/或检测去酰基酶活性的设备，如用于进行测定酶活性的动力学检测的任意设备或装置。
在另一个方面，本申请涉及包括分散于一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂中的上文所述的Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物的一种或多种的药物组合物。如本文所使用的，短语“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”指药学上可接受的材料、组分或载体，如液体或固体填充剂、稀释剂、载体、生产助剂（例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或锌，或者硬脂酸）、溶剂或包封材料，其用于携带或转运给予主体的治疗组合物。在与处方中的其他成分具有相容性和对主体具有生理安全性方面，各赋形剂应是“可接受的”。
所述药物组合物在治疗或预防具有Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性异常或非最佳化特征的疾病方面是有用的。在药物组合物中的Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物还可以是上文所述的任意调节物化合物的生理上可接受的盐或溶剂化物。可接受的盐和溶剂化物可以由本领域公知的任意技术制备。如本领域所公知的，可以通过将活性化合物的碱性部分（例如，氨基）与质子酸如HCl或H2SO4，或者与路易斯酸如CH3Br反应成盐。如有必要，可以将最初引入的阴离子或阳离子交换为另一种阴离子或阳离子。亦根据本领域所公知的，可以在保持一种、两种或多种溶剂分子与活性成分的各分子接触的条件下通过使用溶剂以溶解或以其他方式处理活性化合物的方式生产溶剂化物。
在另一个方面，本申请涉及治疗或预防以Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性异常或非最佳化为特征的疾病的方法。所述方法包括给予主体药学上有效量即以所需方式治疗或预防所述疾病的量的Sirt6、PfSir2a或Sirt7调节物。
所述疾病，其可以是病症或状况，可以是例如脂肪肝疾病、肥胖症、糖尿病、神经退行性疾病（例如，帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和亨廷顿氏病）、心血管疾病（例如，动脉粥样硬化）、凝血障碍、炎症、或炎性疾病或状况（例如，类风湿性关节炎）。或者，所述疾病引起脂肪肝疾病、肥胖症或糖尿病，或与其相关的、关联的或由其所造成的。在针对PfSir2a的特定情况下，对PfSir2a去酰基酶活性的抑制可以用于治疗罹患疟疾的主体，因为PfSir2a是一种特异性针对疟原虫的sirtuin且其对疟原虫抗原的变异具有重要作用，疟原虫抗原的变异是其用于逃避宿主免疫应答的过程。所述治疗方法包括给予患病主体药学上有效（即，治疗有效）量的Sirt6、PfSir2a或Sirt7调节物。
如本领域所公知的，所述活性成分的剂量明显依赖于此类因素如所治疗的疾病或状况、疾病或状况的程度、给予方法、患者体型和潜在的副作用。在不同实施方式中，依据这些和其他因素，Sirt6、PfSir2a或Sirt7调节物和/或其他活性成分的适宜剂量可以是精确地、至少为或不超过例如1mg、10mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1200mg或1500mg，或者以前述示例性剂量中的任意两个为边界的范围内的剂量。此外，可以通过任意适宜的计划以所示的量给予所述组合物，例如每日一次、两次或三次，总治疗时间为一天、两天、三天、四天或五天，并且高达例如一周、两周、三周或四周。或者，或此外，给予所述组合物直至所述疾病或状况出现所需的改变。
在某些实施方式中，本文所述的Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物可以单独使用，而在其他实施方式中其可以与一种或多种其他化合物联合使用，所述其他化合物可以具有或不具有调节Sirt6、PfSir2a或Sirt7的功能或者有利于增强或改变Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物的活性。在一个实施方式中，可以给予患病主体两种或多种Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物的混合物。在另一个实施方式中，可以将一种或多种Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物与一种或多种用于治疗或预防与Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶的活性异常或非最佳化相关疾病的治疗剂联合给予。在一些实施方式中，一种或多种治疗剂与Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物同时给予（例如，药物组合物中含有一种或多种治疗剂和Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物），而在另一个实施方式中，一种或多种治疗剂与Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物分别给予。当使用分开的处方时，Sirt6-、PfSir2a-、或Sirt7-调节化合物可以与另一种治疗剂同时、间歇、交错、先于或迟于给药。
可以制备或修饰本文所述的任意一种Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物，使其在给予哺乳动物主体时具有改善的性质，例如改善稳定性、细胞渗透性、延长寿命等。例如，为增强底物的细胞渗透性，调节物中可以包含含有一系列多个氨基酸的肽链，如8-10个精氨酸或与其具有化学相似性的残基，或聚环氧烷烃链如具有2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个环氧乙烷单元的聚乙二醇（PEG）链。
Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物及其生理上可接受的盐和溶剂化物可以通过，例如注射（例如，SubQ、IM、IP、IV）、吸入或吹入（通过口或鼻）或口服、口腔、舌下、透皮、鼻内、胃肠外或直肠给予（以及适宜地制剂）。在一个实施方式中，可以将Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物局部地给予存在靶细胞的部位，即在特定组织、器官或体液（例如，血液，脑脊液等）中。可以将Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物按多种给药方式制剂，包括全身和局部或局限性给药。所涉及的技术和处方均是本领域公知的，其中的大部分可以参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences,MeadePublishingCo.,Easton,Pa。
药物组合物（包括化妆品制剂）可以包括以重量计约0.00001至100%、如0.001至10%或0.1%至5%的一种或多种本文所述的Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物。在某些供局部使用的处方中，活性剂的量占处方量的约0.25wt.%至75wt.%，或占处方量的约0.25wt.%至30wt.%，或占处方量的约0.5wt.%至15wt.%，或占处方量的约1.0wt.%至10wt.%。
可以通过在细胞培养物或实验动物上进行的标准药学方法来确定Sirt6-、PfSir2a-、或Sirt7-调节化合物的毒性和治疗效能。LD50是使50%群体死亡的剂量。毒性作用和治疗效果的剂量比（LD50/ED50）是治疗指数。优选具有较高治疗指数的Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物。可以使用显示出毒副作用的Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-调节化合物，但是应仔细设计将此类化合物靶向至受感染组织部位的递送系统以尽量减少对未受感染细胞的潜在损伤，进而降低副作用。
可以使用从细胞培养物检测和动物研究中获得的数据确定其在人体内使用的剂量范围。此类化合物的剂量可以在包括具有很少或不具有毒性的ED50的循环浓度的范围内。可以根据所使用的剂型和给药途径在此范围内改变所述剂量。对于任意化合物而言，均可以在细胞培养物检测中初步估算其治疗有效剂量。可以在动物模型中确定给药剂量以使其获得包括了在细胞培养物中确定的IC50的循环血浆浓度范围。这些信息可以用于更加准确地确定在人体内使用的剂量。可以通过例如高效液相色谱测定其在血浆中的水平。
下述实施例用于解释和描述现阶段本申请的最佳方式的目的。然而，本申请的范围不应以任何方式受限于本文所述的实施例。
实施例
试剂和仪器
试剂通常来自Aldrich或Acros，购买可能获得的最高纯度规格，以购买时的形式使用。
底物的合成
通常，首先将α-Fmoc-（ε-酰基）-赖氨酸（0.2mmol）与三苯甲基氯树脂（100mg，0.1mmol）偶联。使用标准Fmoc/tBu化学O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基苯并三唑（HBTU/HOBt）方案合成下述的肽。对于从树脂上裂解肽而言，在室温下将树脂混悬于体积比为1:1:8的乙酸/TFE/DCM的混合物中30min。将树脂过滤并将滤液真空浓缩。用己烷作为共沸物除去过量的乙酸，以获得游离羧酸保护的肽。在含有吡啶（50μL）的二氯甲烷（2mL）溶液中溶解残留物。在上述混合物中加入AMC（7-氨基-4-甲基香豆素，63mg，0.36mmol）和DCC（N,N’-二环己基碳二亚胺，64mg，0.31mmol）。在室温下（RT）搅拌过夜后，将反应物过滤并真空浓缩。为了除去保护基团，使用TFA（2mL）处理上述残留物4小时。使用反相HPLC对粗肽进行纯化，使用BECKMANCOULTER系统Gold125P溶剂模块&168检测器配有TARGAC18柱（250×20mm,10μm,HigginsAnalytical,Inc.,MountainView,CA），在215nm下监测。使用0.1%的TFA水溶液（溶剂A）和0.1%的TFA乙腈溶液（溶剂B）作为流动相。以10mL/min的流速和下述梯度洗脱肽：0%的溶剂B5min，然后0%至25%的溶剂B25min。使用LCMS对肽进行鉴定并测定其纯度。ISGASE（乙酰基-K）-AMC肽：LCMS（ESI）计算值C40H59N9O14[MH+]890.4，实测值890.5。ISGASE（丁酰基-K）-AMC肽：LCMS（ESI）计算值C42H63N9O14[MH+]918.4，实测值918.5。ISGASE（庚酰基-K）-AMC肽：LCMS（ESI）计算值C45H69N9O14[MH+]906.5，实测值906.4。ISGASE（肉豆蔻酰基-K）-AMC肽，LCMS（ESI）计算值C52H83N9O14[MH+]1058.6，实测值1058.6。
候选化合物的合成
在40℃下将P4S10（0.1mol）和甲醇（0.72mol）加入1,2-二氯苯（100ml）中。然后将混合物加热至120℃持续5min，再加热至178℃持续10min。将混合物冷却至100℃，然后加入肉豆蔻酸（0.3mol），将反应混合物加热至178℃持续10min。然后将反应混合物冷却至130℃并加入更多P4S10（0.05mol）。然后将反应混合物加热至160℃持续5min。过滤除去沉淀后，对滤液进行真空蒸馏以获得澄清的黄色液体二硫肉豆蔻酸甲酯。
在0℃下将5%（w/v）的Na2CO3水溶液中（3mL）滴加至搅拌着的含Fmoc-赖氨酸（368mg，1.0mmol）的EtOH（3mL）混悬液。然后在0℃下滴加二硫肉豆蔻酸甲酯（1.1mmol）。滴加完毕后，在室温下将反应混合物搅拌过夜，随后加入50%（v/v）的含EtOH的二次去离子水溶液（3mL）。减压除去乙醇并使用6NHCl将残留的水溶液酸化至pH1-2并使用二氯甲烷萃取。使用盐水洗涤结合的有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩，得到油性残留物，通过硅胶柱层析使产品从油性残留物中分离，其为淡黄色固体（307mg，52%）。LCMS（ESI）计算值C35H50N2O4S[M+H]+595.4，实测值595.3。
使用标准Fmoc/tBu化学O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基苯并三唑（HBTU/HOBt）方案在Fmoc-Wang树脂上合成硫代肉豆蔻酰基肽。使用Fmoc-Lys（硫代肉豆蔻酰基）-OH掺入修饰的赖氨酸。通过将树脂与含有苯酚（5%）、茴香硫醚（5%）、乙二硫醇（2.5%）和水（5%）的三氟乙酸（TFA）孵育2小时从树脂上裂解并除去所有的保护基团。使用反相HPLC对粗肽进行纯化，使用BECKMANCOULTER系统Gold125P溶剂模块&168检测器配有TARGAC18柱（250×20mm,10μm,HigginsAnalytical,Inc.,MountainView,CA），在215nm下监测。使用0.1%的TFA水溶液（溶剂A）和0.1%的TFA乙腈溶液（溶剂B）作为流动相。以10mL/min的流速和下述梯度洗脱肽：0%的溶剂B5min，然后0%至25%的溶剂B25min。使用LCMS对肽进行鉴定并测定其纯度。ARK（硫代肉豆蔻酰基）ST肽，LCMS（ESI）计算值C36H69N9O8S[M+H]+788.5，实测值788.2。
对Sirt6和PfSir2a去酰基酶活性的说明
合成在Lys9上具有不同酰基的若干H3K9肽。这些肽包括生物素基、硫辛酰基、丙二酰基、琥珀酰基、3-羟基-3-甲基戊二酰基、肉豆蔻酰基和棕榈酰基。使用重组Sirt6进行的初始检测显示肉豆蔻酰基和棕榈酰基均能够被Sirt6水解。对使用H3K9肽进行的Sirt6催化去乙酰基和去肉豆蔻酰基反应的时程进行监测后发现去肉豆蔻酰基化反应比去乙酰基化反应更为迅速（数据未列出）。该结果进一步被动力学检测所证实，如下表1所示。使用相同的H3K9肽序列，去肉豆蔻酰基化反应的kcat/Km值为185（kcat=0.0078s-1，Km=43μM），其比去乙酰基化反应高30倍（kcat/Km=5.3s-1M-1）。
表1：Sirt6在H3K9乙酰基和肉豆蔻酰基肽上的动力学参数
*由于检测限的原因，当底物浓度低于1μM时无法准确测定Km值。
已报道Sirt6的去乙酰基化酶活性具有序列特异性。迄今为止，只有H3K9和H3K56乙酰基肽已报道作为Sirt6的底物。这与sirtuin具有良好的去乙酰基化酶活性的报道是相反的，如Sirt1和酵母HST2，其能够在多种不同肽序列中将乙酰基赖氨酸去乙酰基。现在本申请发现了Sirt6更有效的活性，进行了进一步的研究以确定更有效的去肉豆蔻酰基化活性是否也使得Sirt6能够接受更多的肽序列作为底物。出于这一目的，基于H2BK12和H4K16序列合成了乙酰基和肉豆蔻酰基肽。明显地，使用HPLC分析基本上无法检测到Sirt6对乙酰基肽的水解，参见比较H2BK12乙酰基和H2BK12肉豆蔻酰基的HPLC图（图1A）和比较H4K16乙酰基和H4K16肉豆蔻酰基的HPLC图（图1B）。而与之相反的是，相应的肉豆蔻酰基肽的水解可以很容易地检测到，其进一步被图1A和图1B所示的HPLC图所证实。这些结果进一步证实了Sirt6的去肉豆蔻酰基化酶的活性显著高于其去乙酰基化酶的活性的观点。这样，通过使用适宜的酰基，Sirt6能够催化多种不同肽序列上的酰基赖氨酸的水解。
为了进一步确证该结果，还进行了基于32P-NAD的生化检测。根据sirtuin已知的去乙酰基化作用机制，通过Sirt6的去肉豆蔻酰基化作用应产生2’-O-肉豆蔻酰基ADP-核糖。当将肉豆蔻酰基H3K9与Sirt6和32P-NAD孵育时，大部分的NAD被消耗并且大致在溶剂前沿处可见新的斑点（图2）。这与形成2’-O-肉豆蔻酰基ADP-核糖的结果一致，因为疏水性的肉豆蔻酰基将使得化合物具有较低的极性。当将乙酰基H3K9肽与Sirt6和32P-NAD孵育时，尽管观察到了新产物（2’-O-乙酰基ADPR）的斑点，但是仍有NAD分子留下（图2），提示Sirt6的去肉豆蔻酰基化作用比去乙酰基化作用更为有效。使用H2BK12和H4K16肽时，在使用Sirt6的32P-NAD检测中观察到了去肉豆蔻酰基化作用但未观察到去乙酰基化作用（图2）。因此，32P-NAD检测的结果与上文所述的HPLC检测一致并提示Sirt6具有强劲的去肉豆蔻酰基化酶活性。
除了乙酰基和肉豆蔻酰基以外，在32P-NAD检测中还对丁酰基、辛酰基和十二烷酰基肽进行了研究。在这些不同的酰基中，与较短的酰基链相比，酰基链越长水解更有效（图3）。辛酰基、十二烷酰基和肉豆蔻酰基肽均能够通过消耗大部分的32P-NAD分子而被Sirt6水解，。这些结果提示Sirt6优选赖氨酸肽上更长的脂肪酰基作为底物。
已知恶性疟原虫Sir2a（PfSir2a）也能够除去组蛋白上的修饰。本申请中的数据确证了与Sirt6类似，PfSir2a的去乙酰基化酶活性比Sirt1的低得多（表1）。使用带有不同酰基的H3K9肽，本申请发现了PfSir2a也能够非常有效地从肽上除去脂肪酰基。PfSir2a的去肉豆蔻酰基化酶的活性比其去乙酰基化酶的活性高300倍（表1）。
作为新型表观遗传修饰的组蛋白脂肪酰基化
蛋白赖氨酸脂肪酰基化，尽管不是众所周知的，但也已知出现在一些蛋白中。Sirt6能够从赖氨酸残基上有效除去脂肪酰基的事实提示赖氨酸脂肪酰基化可能比此前认为的更普遍。由于认为Sirt6能够除去组蛋白上的修饰，因而我们进行了一项研究以查明组蛋白是否具有脂肪酰基修饰。特别地，我们进行了一项研究以探索Sirt6或PfSir2a和32P-NAD是否能够用于检测组蛋白上存在的脂肪酰基赖氨酸残基。在这项研究中，使用合成的H3K9肉豆蔻酰基肽检测了PfSir2a和Sir6的检测限。如图4A所示，在所使用的条件下，使用PfSir2a能够检测到低至0.03μM的肉豆蔻酰基肽的去肉豆蔻酰基化作用。而与之相反的是，使用Sirt6时，当肉豆蔻酰基肽的浓度为0.3μM或更低时，无法检测到去肉豆蔻酰基化反应。因而，在所使用的条件下，PfSir2a能够用于检测更低水平的脂肪酰基赖氨酸肽。出于这个原因，在随后的研究中，使用PfSir2a检测组蛋白中存在的脂肪酰基赖氨酸。将商品化的小牛胸腺组蛋白与32P-NAD和PfSir2a孵育，检测到形成了O-脂肪酰基ADPR（图4B），提示在组蛋白上确实发生了赖氨酸残基的脂肪酰化。
上述数据提示人Sirt6和PfSir2a，其均具有较弱的去乙酰基化酶活性，能够更有效地催化长脂肪酰基赖氨酸修饰的水解。而且，我们发现了赖氨酸脂肪酰基化可以发生在小牛胸腺组蛋白上。结合酶学数据和在组蛋白上存在脂肪酰基赖氨酸，这表明从组蛋白上除去长脂肪酰基链应是Sir6和PfSir2a的生理功能。这些发现与本领域普遍认可的观点存在强烈反差，其认为Sir6和PfSIr2a通过除去组蛋白上的乙酰基赖氨酸修饰来调节某些基因的转录。本申请中的数据提示在转录调节中还涉及了更长的脂肪酰基赖氨酸修饰。
用于候选化合物筛选的Sir6和PfSir2a活性检测的研发
由于sirtuin具有强劲的去乙酰基化酶活性，因此使用荧光检测来检测其活性并筛选抑制物/活化物（图5，上图）。该检测使用具有同乙酰基赖氨酸残基的羧基连接的氨基香豆素（AMC）分子的乙酰基肽。在sirtuin除去乙酰基后，使用胰蛋白酶释放AMC，其产生荧光信号。因而，可以通过监测反应中释放的荧光对能够改变待分析的sirtuin活性的化合物的存在进行检测。然而，使用与AMC偶联的乙酰基肽（例如，ISGASEAcK）是无法检测Sirt6或PfSir2a的活性的，如参见图6A和6B的比较。这一发现与这两种sirtuin具有较弱的去乙酰基化酶活性一致，如表1所示。基于Sirt6和PfSir2a优选赖氨酸残基上更长的脂肪酰基的发现，我们制备并研究了庚酰基肽-AMC化合物（图5，下图）。如图6B所示，庚酰基肽-AMC化合物能够用于检测Sirt6和PfSir2a的活性，而这种用途未见于乙酰基肽-AMC。可以通过使用不同的肽序列和不同的酰基对该系统进行进一步优化。
Sirt6和PfSir2a抑制物的研发
基于Sirt6和PfSir2a优选赖氨酸残基上更长的脂肪酰基的发现，本申请设计了针对Sirt6和PfSir2a的示例性通式抑制物结构，如图7A所示，其中各通式基团（例如，R1、R3和R4）均根据如上文所述的定义。在图7A所示的结构中，R1、R3和R4以及该结构的其他方面均可以被系统地改变以增加所述化合物的效能和其他所需的性质。基于优选长脂肪酰基链的事实，R1基团优选为长疏水性基团。我们已制备了一个特定化合物（图7B），其抑制Sirt6和PfSir2a的50%抑制浓度分别为5和30mM。因而，通式抑制物结构的设计是有效的，通过改变R1、R3和R4进一步改进抑制物的效能应该是可行的。
虽然已经显示和描述了目前认为的本申请的优选实施方式，但是本领域技术人员可以对其作出多种改变和修饰，这些改变和修饰仍在所附权利要求所定义的本申请的范围内。

Claims (28)

1.一种鉴定Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性调节物的方法，所述方法包括：
在Sirt6、PfSir2a或Sirt7使底物去酰基的条件下，在存在候选化合物的情况下将酰基化的底物与Sirt6、PfSir2a或Sirt7接触以提供去酰基的底物，其中所述酰基化的底物含有酰基-赖氨酸部分和指示物部分，所述酰基含有至少三个通过碳-碳键连接的碳原子的烃基，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，并且其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代，以及其中所述赖氨酸的侧链ε-氨基丁基基团可以衍生化；
将去酰基的底物与裂解试剂接触，所述裂解试剂裂解所述赖氨酸和指示物部分之间的连接以释放所述指示物部分并产生具有信号强度的可检测信号；以及
将所述信号强度与Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相关联；
其中通过存在所述候选化合物的条件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相对于不存在所述候选化合物的条件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的变化，将所述候选化合物鉴定为Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的调节物；
其中所述候选化合物具有下述化学结构：
其中R1是具有至少三个通过碳-碳键连接的碳原子的烃基，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，并且其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代；
R2选自S、NR6和O，其中R6是氢原子或烃基R；
X1、X2和X3独立地选自–(CH2)n–、–NR12–、-O-、-S-或键，其中R12是氢原子或烃基R，以及其中n表示1、2或3；
R5是氢原子或烃基R；
R3和R4独立地是氢原子或烃基R；
其中所述烃基R独立地为未取代的或者被一个或多个选自N、O、S、P和F的杂原子或含有一个或多个所述杂原子的杂原子基团所取代，其中R4可以是OH或SH；
条件是所述候选化合物和所述酰基化的底物在结构上不同。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酰基-赖氨酸部分连接至至少一个其他的氨基酸，以及所述指示物部分通过肽键共价连接至所述赖氨酸或至少一个其他的氨基酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述裂解试剂是蛋白水解酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述指示物部分是荧光团。
5.根据权利要求4所述的方法，其中由于所述荧光团的裂解和释放，所述荧光团改变其发射波长。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述R1的烃基具有至少三个通过碳-碳键连接的碳原子且不存在杂原子取代，但是一个或多个氢原子任选地被氟原子所取代。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述R1的烃基具有至少6个通过碳-碳键连接的碳原子，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，以及其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述R1的烃基具有至少7个通过碳-碳键连接的碳原子，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，以及其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述R1的烃基具有至少8个通过碳-碳键连接的碳原子，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，以及其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代。
10.根据权利要求1所述的方法，其中R2为S。
11.根据权利要求1所述的方法，其中X1、X2和X3均为–(CH2)n–，其中n独立地为1、2或3。
12.根据权利要求1所述的方法，其中R3和R4均包含至少一个氨基酸残基。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述酰基化的底物具有下述化学结构：
其中R7是具有至少三个通过碳-碳键连接的碳原子的烃基，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，以及其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代；
R8选自S、NR13和O，其中R13是氢原子或烃基R；
X4、X5和X6独立地选自–(CH2)n–、–NR14–、–O–、–S–或键，其中R14是氢原子或烃基R，以及其中n表示1、2或3；
R11是氢原子或烃基R；
R9和R10独立地是氢原子或烃基R，其中R10还可以是OH或SH，以及其中R9和R10中的至少一个是指示物部分；
其中所述烃基R独立地为未取代的或者被一个或多个选自N、O、S、P和F的杂原子或含有一个或多个所述杂原子的杂原子基团所取代。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述指示物部分是荧光团。
15.根据权利要求13所述的方法，其中R8为S。
16.根据权利要求13所述的方法，其中X4、X5和X6均为–(CH2)n–，其中n独立地为1、2或3。
17.根据权利要求13所述的方法，其中R9和R10中的至少一个包括至少一个氨基酸残基。
18.根据权利要求13所述的方法，其中R9和R10中的一个包括至少一个氨基酸残基，以及R9和R10中的一个是指示物部分。
19.一种调节Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的化合物，具有下述化学结构：
其中R1是具有至少5个通过碳-碳键连接的碳原子的烃基，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，以及其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代；
R2选自S、NR6和O，其中R6是氢原子或烃基R；
X1、X2和X3独立地选自–(CH2)n–、–NR12–、-O-、-S-或键，其中R12是氢原子或烃基R，以及其中n表示1、2或3；
R5是氢原子或烃基R；
R3和R4独立地是氢原子或烃基R；
其中所述烃基R独立地为未取代的或者被一个或多个选自N、O、S、P和F的杂原子或者含有一个或多个所述杂原子的杂原子基团所取代，其中R4还可以是OH或SH。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述R1的烃基具有至少五个通过碳-碳键连接的碳原子且不存在杂原子取代，但是一个或多个氢原子任选地被氟原子所取代。
21.根据权利要求19所述的化合物，其中所述R1的烃基具有至少6个通过碳-碳键连接的碳原子，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，以及其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代。
22.根据权利要求19所述的化合物，其中所述R1的烃基具有至少7个通过碳-碳键连接的碳原子，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，以及其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代。
23.根据权利要求19所述的化合物，其中所述R1的烃基具有至少8个通过碳-碳键连接的碳原子，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，以及其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代。
24.根据权利要求19所述的化合物，其中所述R1的烃基具有多达20个碳原子。
25.根据权利要求19所述的化合物，其中R2为S。
26.根据权利要求19所述的化合物，其中X1、X2和X3均为–(CH2)n–，其中n独立地为1、2或3。
27.根据权利要求19所述的化合物，其中R3和R4均包括至少一个氨基酸残基。
28.权利要求19所述的化合物在制备用于治疗受累于特征为Sirt6或Sirt7去酰基酶活性异常或处于非最佳状态的病症的主体的药物中的用途。
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