CN103399058A

CN103399058A - 一种高灵敏富勒烯光电化学探针及其制备方法

Info

Publication number: CN103399058A
Application number: CN2013103674054A
Authority: CN
Inventors: 胡成国; 胡胜水; 郑金偶
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2013-08-22
Filing date: 2013-08-22
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-08-22
Also published as: CN103399058B

Abstract

本发明涉及一种高灵敏富勒烯光电化学探针的制备方法，是基于双偶氮染料分子对富勒烯光电复合材料的非共价修饰以及生物分子在其表面的共价固定而实现水溶性光电化学探针的制备。采用常见电化学分析仪及低成本激光笔单色光源，将该富勒烯光电探针作为夹心免疫结构中检测抗体的标记探针，可实现肿瘤标志物癌胚蛋白（CEA）低至0.1pg/mL的高灵敏检测，其灵敏度可媲美目前临床中常用的电致化学发光方法，但检测设备更易实现集成化、便携化和低成本，在临床高灵敏生化分析中极具应用前景。

Description

一种高灵敏富勒烯光电化学探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种高灵敏富勒烯光电化学探针及其制备方法，属于生物检测领域。

背景技术

基于光诱导电子转移过程的光电化学（PEC）传感技术，以光信号驱动传感器界面的异相电子转移，利用电化学分析仪测量光电转换产生的光电流/电压信号。除外加光源外，该光电化学传感技术在检测设备、测量方法和信号处理等方面与电化学分析基本相同，因此具有电化学方法的高灵敏、高集成、低成本等特点。与临床生化分析中常用的电致化学发光技术相反，光电化学方法采用光激发信号产生电信号，同样具有高信噪比、高灵敏等特点，但检测设备更易实现集成化、便携化和低成本。目前，光电化学传感器多采用金属基光电转换材料，如氧化物、配合物和量子点等，检测对象包括凝血酶、ATP、DNA、肿瘤标志物和细胞等生物物质。然而，金属基光电材料往往需要紫外光激发、氧化能力强、对生物分子损伤大；同时，由于金属基光电材料的导电性差，目前几乎所有的光电化学传感器都将金属基光电材料直接固定在电极表面，从而限制了基底电极的背景调控和检测模式的选择。与金属基光电材料相比，富勒烯碳基光电材料在实现高灵敏、低成本、环保型光电化学生物传感方面具有独特的优势：（1）作为有机太阳能电池领域中最常用的电子受体，富勒烯的光电转换效率高（已超过8%）、光激发及氧化能力适中（C₆₀禁带宽度~1.9eV而TiO₂为~3.2eV）；（2）富勒烯的结构与能级可在分子层面裁剪与调制，光电调控效果明显；（3）富勒烯激发态寿命长、碳材料导电性好，有利于光生电荷的分离转移与生物分子的直接光电标记；（4）碳材料来源广泛、绿色环保。然而，迄今国内外尚未见富勒烯光电化学探针的工作报道及相关产品。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种富勒烯光电化学探针及其制备方法。

本发明的富勒烯光电化学探针，包括羧基化纳米载体，偶氮染料通过π-π作用固定于羧基化纳米载体表面，富勒烯通过与偶氮染料的π-π作用间接固定于羧基化纳米载体表面，检测抗体通过与羧基化纳米载体表面的羧基形成共价键实现固定连接。

该富勒烯光电化学探针以偶氮染料作为富勒烯和纳米载体溶液分散的修饰材料，以羧基化纳米材料作为富勒烯和生物分子的大面积载体，以富勒烯作为主要的吸光与光电转换材料。

所述的偶氮染料可以是刚果红。

所述的羧基化纳米载体是羧基化碳纳米管、羧基化石墨烯、羧基化氧化锌、羧基化二氧化钛、羧基化氧化铝或羧基化四氧化三铁。

所述的富勒烯是C₆₀或C₇₀。

本发明提供的水溶性富勒烯复合光电材料的制备方法是：

（1）将富勒烯、纳米载体和偶氮染料按偶氮染料：纳米载体：富勒烯 = 5:3:1的质量比混合研磨2 h，抽滤水洗至滤液无色，配制成1.0 mg/mL（以富勒烯计）的富勒烯复合光电材料的水溶液；

（2）往1.0 mL上述富勒烯复合光电材料的水溶液中加入20 mg/ml EDC和10 mg/ml NHS，常温下搅拌1 h，离心去上清，用1.0 mM pH7.4 PBS洗涤除去未反应的EDC和NHS，并用1.0 mL 1.0 mM pH7.4 PBS超声分散，得到羧基活化的富勒烯复合光电材料水溶液；

（3）往1.0 mL上述羧基活化的富勒烯复合光电材料水溶液中加入浓度为4 μg/mL的检测抗体溶液150 μL，在4 ℃下搅拌6 h，离心去上清，然后用1.0 mM pH7.4 PBS洗涤除去未反应的游离态检测抗体，最后用含有0.05wt% Tween-20的1.0 mM pH7.4 PBS溶液重新分散，制备出1.0 mg/mL的富勒烯光电生物探针溶液（按富勒烯计）。

本发明通过物理研磨的方法实现富勒烯复合光电材料的制备，基于生物分子在羧基化纳米载体上的共价固定实现富勒烯光电复合材料生物标记，从而制备出可实现目标抗原高灵敏检测的富勒烯光电化学探针。该方法制备的富勒烯光电化学探针的水溶性好、光电化学响应灵敏、生物标记方便，基于该光电探针构筑的光电化学免疫传感器的灵敏度可媲美电致化学发光方法，但检测成本更低，极具应用价值。

本发明制备的富勒烯光电化学探针的突出特点是：

（1）富勒烯光电复合材料的制备方法简单、条件温和、容易批量制备；所制备的光电材料的水溶性高、稳定性好、光电响应灵敏；富勒烯光电复合材料能可见光激发，检测装置易集成；

（2）富勒烯光电复合材料的导电性和生物相容性好，表面存在大量可衍生基团，生物标记方便，可直接作为生物分子的光电探针；

（3）由于富勒烯光电探针采用无酶型检测原理，其稳定性好、选择性高，方便长期储存使用。

（4）以该光电探针构筑的光电化学免疫传感器的灵敏度可媲美电致化学发光方法，但检测设备更容易集成化、便携化、检测成本更低，在临床高灵敏生化分析中极具应用前景。

附图说明

图1，富勒烯光电化学探针的结构示意图。

图2，各种碳纳米材料的紫外-可见吸收光谱：(a). C₆₀-刚果红复合物（C₆₀-CR）； (b).羧基化多璧碳纳米管-刚果红-C₆₀复合物（MWNTCOOH-CR- C₆₀）；(c).碳纳米管-刚果红复合物（MWNT-CR）。

图3，各种碳纳米材料的透射电镜图：(A). 羧基化碳纳米管（MWNTCOOH）；(B). 羧基化碳纳米管-刚果红复合物（MWNTCOOH-CR）；(C). 富勒烯-刚果红复合物（C₆₀-CR）；(D). 羧基化碳纳米管-刚果红-富勒烯复合物（MWNTCOOH-CR-C₆₀）。

图4，将癌胚抗原CEA的检测抗体标记到MWNTCOOH-CR-C₆₀上所制备的富勒烯光电化学探针对CEA的光电化学检测的光电流响应（左图）及其工作曲线（右图）。所用低成本激光笔单色光源，包括一支波长525nm单色激光笔光源（功率30mW、光斑直径约3mm）、变压器和开关三部分组成。

具体实施方式

本发明通过偶氮染料对富勒烯-纳米载体光电复合材料的表面修饰而实现富勒烯型光电探针的高效水溶液分散，利用纳米载体上的可衍生羧基基团实现富勒烯光电探针的抗体标记，采用夹心免疫原理实现待测抗原的高灵敏光电化学检测。

制备过程如下：

（1）富勒烯-纳米载体复合光电材料的合成：将富勒烯C₆₀、纳米载体羧基化碳纳米管MWNTCOOH和偶氮染料刚果红CR按偶氮染料：纳米载体：富勒烯 = 5:3:1的质量比混合研磨2 h，抽滤水洗至滤液无色，配制成1.0 mg/mL（以C₆₀计）的富勒烯复合光电材料的水溶液；

（2）可用于CEA光电化学检测的富勒烯型光电生物探针的合成：往1.0 mL上述富勒烯复合光电材料的水溶液中加入20 mg/ml EDC和10 mg/ml NHS，常温下搅拌1 h以活化纳米载体上的羧基，而后12000 rpm离心10 min，弃去上清液，继续用1.0 mM pH7.4 PBS重复离心洗涤3次，直至洗去过量未反应的EDC和NHS溶液，并用1.0 mL 1.0 mM pH7.4 PBS超声分散，得到羧基活化的富勒烯复合光电材料水溶液；

（3）往1.0 mL羧基活化的富勒烯复合光电材料水溶液中加入浓度为4 μg/mL的癌胚抗原（CEA）的检测抗体Ab₂溶液150 μL，在4 ℃下搅拌6 h，基于载体材料上的活化羧基与检测抗体Ab₂上氨基的共价反应，实现检测抗体Ab₂在富勒烯复合光电材料上的共价固定，然后12000 rpm离心10 min，弃去上清液，继续用1.0 mM pH7.4 PBS重复洗涤3次除去过量未反应的游离态检测抗体Ab₂，最后用含有0.05wt% Tween-20的1.0 mM pH7.4 PBS（PBST）溶液重新分散，从而制备出浓度1.0 mg/mL的可用于CEA光电检测的富勒烯光电生物探针溶液（按C₆₀计）。

（4）CEA光电免疫传感器的制备：将ITO电极（检测面积5mm×10mm）在4 mg/mL MWNTCOOH和9 mM的对氨基苯甲酸混合溶液（以pH 7的10 mM PBS作溶剂）中，采用多重循环伏安扫描（-0.4~1.6V，100mV/s，10圈）电沉积，在电极表面引入羧基COOH。将该修饰电极用去离子水冲洗干净，氮气吹干备用，然后常温下在20 mg/ml EDC和10 mg/ml NHS的混合溶液中浸泡电极1 h以活化羧基基团。用10.0 mM pH7.4 PBS中润洗电极，再滴加20μL浓度4 μg/mL的CEA包被抗体Ab₁在4 ℃下孵育1 h，继续用10.0 mM pH7.4 PBS润洗电极，洗去未共价结合的过量包被抗体Ab₁，最后用20μL浓度1.0wt%的BSA溶液在4 ℃下孵育电极1 h，钝化未与包被抗体Ab₁共价反应的活化羧基基团，继续用10.0 mM pH7.4 PBS润洗，从而得到可用于CEA光电检测的免疫传感器。

（5）CEA光电免疫传感过程：将上述制备的CEA光电免疫传感器用20μL 含有一定浓度的待测抗原（标准CEA或血清）在37 ℃下进行1 h的孵育，用10.0 mM pH7.4 PBS润洗电极，最终完成传感器表面待测CEA抗原的捕获。将捕获CEA抗原的免疫传感器置于上述检测抗体Ab₂标记的富勒烯光电探针溶液中，在25 ℃下孵化1 h，用10.0 mM pH7.4 PBS润洗，然后将完成免疫识别过程的光电传感器置于含有50 mM抗坏血酸的0.1 M pH 7.4 PBS溶液中，在开路电压条件下测定光电流，根据光电流与待测抗原CEA浓度对数之间的线性关系实现CEA的高灵敏光电检测。

图1说明富勒烯光电化学探针的结构。以刚果红分子作为表面固定和水溶性分散的修饰材料，富勒烯材料以非共价作用方式固定在羧基化纳米载体表面，形成具有良好光电响应性能的富勒烯型光电复合材料，检测抗体则通过纳米载体表面羧基的共价修饰实现其在富勒烯型光电复合材料表面的固定，从而形成具有良好水分散性能、光电转换性能、可用于抗原检测的富勒烯光电化学探针。

图2说明本发明所制备的非共价修饰制备水溶性碳纳米材料在水中优良的溶解性能及其紫外-可见特征吸收。经过刚果红研磨处理后，C₆₀（a）、原始MWNTs（b）、羧基化碳纳米管与C₆₀的复合物（c）都可以较好地分散在水中，形成浓度高达2 mg/mL（以C₆₀计）的稳定水分散溶液。其中，刚果红修饰C₆₀（C₆₀-CR）和原始碳纳米管（MWNT-CR）的制备方法与MWNTCOOH-CR- C₆₀的类似，即将刚果红与碳纳米材料（C₆₀或MWNTs）按质量比3:1的比例混合研磨2 h，抽滤水洗至滤液无色，配制成2 mg/mL的水溶液。紫外-可见吸收光谱表明，所制备的C₆₀-CR复合物在水溶液中于222、269、349及450nm处有C₆₀的特征吸收峰。其中，450nm的吸收峰表明C₆₀-CR复合物溶液中C₆₀以纳米簇而非单分子形式存在。并且，在MWNTCOOH-CR-C₆₀复合物中可以明显看到C₆₀的特征吸收，表明所制备的MWNTCOOH-CR-C₆₀复合物中确实存在C₆₀。

图3说明本发明所制备的刚果红修饰碳纳米材料的显微结构。从图中可以看出，羧基化多壁碳纳米管都已缠绕在一起的管状结构存在（A）；与刚果红研磨处理后得到的羧基化碳纳米管-刚果红复合物（MWNTCOOH-CR）的分散性变好、但长度减小（B），表明研磨处理能显著改善碳纳米管的分散性，但会使碳纳米管发生断裂，形成短管；将C60与刚果红混合研磨得到的C₆₀-CR复合物呈现直径约50nm的球形结构（C），结合图1a可以看出，刚果红也能实现富勒烯的高效表面修饰与溶液分散；将羧基化碳纳米管和C₆₀与刚果红一起研磨得到的MWNTCOOH-CR-C₆₀复合物也呈现管状结构，并且未见到明显的纳米球状结构（D），表明MWNTCOOH-CR-C₆₀复合物可能在MWNTCOOH表面形成了强吸附的覆盖层而非纳米球结构。结合图1和图2，可以很直观地证明MWNTCOOH-CR-C₆₀复合物的成功合成。由于MWNTCOOH表面带有大量的羧基，因此利用羧基活化试剂活化后实现抗体等蛋白质分子的共价固定。

图4说明由本发明所制备的富勒烯光电化学探针的对CEA高灵敏光电免疫检测的效果。从图中可以看出，基于该富勒烯光电化学探针所构筑的光电免疫传感器能实现宽范围内CEA的高灵敏检测，其检测限可达0.1 pg/mL（S/N=3），线性范围为1.0 pg/mL ~100.0 ng/mL。

Claims

1.一种富勒烯光电化学探针，其特征在于，包括羧基化纳米载体，偶氮染料通过π-π作用固定于羧基化纳米载体表面，富勒烯通过与偶氮染料的π-π作用间接固定于羧基化纳米载体表面，检测抗体通过与羧基化纳米载体表面的羧基形成共价键实现固定连接。

2.根据权利要求1所述的富勒烯光电化学探针，其特征是所述偶氮染料是刚果红。

3.根据权利要求1所述的富勒烯光电化学探针，其特征是所述羧基化纳米载体是羧基化碳纳米管、羧基化石墨烯、羧基化氧化锌、羧基化二氧化钛、羧基化氧化铝或羧基化四氧化三铁。

4.根据权利要求1所述的富勒烯光电化学探针，其特征是，所述富勒烯是C₆₀或C₇₀。

5.一种富勒烯光电化学探针的制备方法，包括如下步骤：

（1）按偶氮染料：纳米载体：富勒烯 = 5:3:1的质量比将富勒烯、羧基化纳米载体和偶氮染料混合并研磨2 h，抽滤水洗至滤液无色，配制成1.0 mL 1 mg/mL（以富勒烯计）的富勒烯复合光电材料的水溶液；

（2）往1.0 mL上述富勒烯复合光电材料的水溶液中加入1.0 mL 20 mg/ml EDC和10 mg/ml NHS，常温下搅拌1 h，离心去上清，用1.0 mM pH7.4 PBS洗涤除去未反应的EDC和NHS，并用1.0 mL 1.0 mM pH7.4 PBS超声分散，得到羧基活化的富勒烯复合光电材料水溶液；

（3）往1.0 mL上述羧基活化的富勒烯复合光电材料水溶液中加入150 μL 4 μg/mL的检测抗体溶液，在4℃下搅拌6 h，离心去上清，然后用1.0 mM pH7.4 PBS洗涤除去未反应的游离态检测抗体，最后用含有0.05wt% Tween-20的1.0 mM pH7.4 PBS溶液重新分散，制备出浓度为1.0 mg/mL的富勒烯光电生物探针溶液（以富勒烯计）。

6.权利要求1所述的富勒烯光电化学探针在光电化学生物传感中的应用。