CN103396982A

CN103396982A - 利用干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法

Info

Publication number: CN103396982A
Application number: CN2013102034366A
Authority: CN
Inventors: 高志良; 何宏亮; 彭亮; 何帆; 龚逸鸿
Original assignee: Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2013-11-20

Abstract

本发明提供一种骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞方法的应用，所述的细胞外基质为诱导骨髓间充质干细胞所分泌的并且去除了骨髓间充质干细胞的基质。根据需求，更具体的提供了一种细胞外基质在诱导骨髓间充质干细胞成为肝细胞的方法。本发明提供的诱导生成肝细胞的方法高效、实用、诱导效率高、分化效果好，诱导得到的肝细胞糖原合成能力和尿素合成能力强。

Description

利用干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞分化领域，更具体地，涉及利用细胞外基质诱导人骨髓间充质干细胞成为肝细胞的方法。

背景技术

肝衰竭危害巨大、死亡率高，尚无有效治疗方法，目前包括内科综合治疗、人工肝治疗、抗病毒治疗、肝移植治疗等各种治疗方式均存在一定缺陷。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSC）是一类具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，越来越多的动物及临床研究表明BMSC治疗终末期肝病具有良好的疗效和安全性。其机制在于BMSC能够通过分化为肝细胞和发挥免疫调节作用来修复肝脏。

目前将BMSC诱导分化成肝细胞的方法很多，但大多是将BMSC接种在普通培养基材上，在这种二维条件下，细胞只能呈单层生长，细胞密度低，分化效果不好，这很大程度上影响了培养细胞的生理功能，使得分化的细胞仅具有部分肝细胞的功能，不能满足基础研究和临床治疗的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、实用、诱导效率高、分化效果好的将骨髓间充质干细胞诱导成为有功能的肝细胞的方法。

首先提供一种细胞外基质在诱导骨髓间充质干细胞成为肝细胞的方法中的应用，所述的细胞外基质为诱导骨髓间充质干细胞所分泌的并且去除了骨髓间充质干细胞的基质。所得到的肝细胞的糖原合成能力和尿素合成能力都高于现有的分化方法，即所得到的肝细胞优于原分化方法所得的肝细胞。

更具体的，提供一种利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，包括以下步骤：

S1. 明胶涂层交联改性：为了增加细胞外基质的附着力，在细胞培养基材中加入明胶溶液，在培养箱中静置，加入戊二醛溶液和乙醇胺溶液，室温静置，

S2. 诱导骨髓间充质干细胞分泌细胞外基质：在步骤S1所得细胞培养基材中加入完全培养基和骨髓间充质干细胞，培养，加入抗坏血酸继续培养，去除骨髓间充质干细胞，即得骨髓间充质干细胞分泌的细胞外基质，

S3. 利用步骤S2所得的细胞外基质体外诱导骨髓间充质干细胞分化成肝细胞：在含有步骤S2所得细胞外基质的组织培养基材中加入骨髓间充质干细胞和诱导分化培养基，培养两周，再将诱导分化培养基换成成熟培养基培养两周，即得肝细胞，

所述的诱导分化培养基包含以下物质： DMEM/F12基础培养基、特级胎牛血清、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4、青霉素、链霉素、二性霉素B。

所述的步骤S1中的在培养箱中静置的温度为37℃、含二氧化碳量为5%，静置时间为1小时；所述的室温静置的时间为半小时。

所述的步骤S2中所述的完全培养基包含以下物质：α-MEM基础培养基、特级胎牛血清、青霉素、链霉素和二性霉素B。

步骤S2中所述的加入抗坏血酸的时间为，培养至细胞密度达到90%时。

步骤S2中所述的去除骨髓间充质干细胞的方法为将骨髓间充质干细胞分泌的ECM浸泡在含有0.5% Triton X-100和20mM氨水的PBS中，放于37℃、5% CO₂培养箱中静置5 min，最后用PBS洗净。

步骤S3中所述的成熟培养基为DMEM/F12基础培养基、特级胎牛血清、制瘤素M、地塞米松、胰岛素—转铁蛋白—亚硒酸钠、青霉素、链霉素、二性霉素B。

细胞分泌的ECM不仅含有I型和III型胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、核心蛋白多糖等多种基质成分，而且具有与体内微环境相似的三维结构，同时去除原有细胞后留下的空间能为BMSC诱导分化提供足够的生长空间。在三维的ECM微环境中，成纤维细胞能迅速的形成整合素α₅β₁和integrin与ECM接触，类似其在体内的反应；细胞分泌的脱细胞ECM在BMSC向肝细胞诱导分化过程中调控BMSC行为，从而提高BMSC向肝细胞的诱导分化效率和分化后细胞的功能。使其有望成为生物人工肝的细胞来源。

为了更好地理解本发明，以下对本发明方案结合反应式作进一步的阐释，其不能作为本发明保护范围的限制。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：首先对传统细胞培养基材经过明胶涂层交联改性，接着将胰酶消化的骨髓间充质干细胞接种到明胶交联过的细胞培养基材上，诱导骨髓间充质干细胞分泌细胞外基质。8天后，将骨髓间充质干细胞接种到含有ECM的培养基材中，在诱导分化培养基和成熟培养基的培养下，得到分化形成的肝细胞，在诱导分化过程中使用未含有ECM的组织培养基材（tissue culture polystyrene，TCPS）诱导分化作为对照。

所述的骨髓间充质干细胞购自生物技术公司，购买后通过流式再次鉴定细胞表面免疫表型。

所述的分化诱导时间为28天，每三天更换一次培养液。

所述的诱导分化培养基为： DMEM/F12基础培养基、10% FBS、20ng/ml肝细胞生长因子、10ng/ml成纤维细胞生长因子4、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、0.25μg /ml二性霉素B。

所述的成熟培养基为： DMEM/F12基础培养基、10% FBS、20ng/mL制瘤素M、100μM地塞米松、100μM胰岛素—转铁蛋白—亚硒酸钠（ITS）、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、0.25μg /ml二性霉素B。

本发明的优点在于：

1. 由于利用了ECM，具有与体内微环境相似的三维结构，有利于细胞-细胞、细胞-基质之间按组织学特性相互接触，在体外实现组织重建，最大程度实现BMSC诱导分化为肝细胞。

2. 肝细胞处于三维结构的ECM中，这与肝细胞的正常生理状态相近，因而诱导效率高和分化效果好，使用本发明所述的方法体外诱导BMSC，在不同的时间点，经Real-time RT-PCR分析肝脏细胞特异性基因mRNA，具有较高的表达，PAS染色、尿素检测也证明得到的肝细胞具有较强的糖原合成和尿素合成能力。

3. 根据肝细胞分化特点，在诱导分化不同时段添加不同组合的刺激生长因子，有效地诱导了BMSC向肝细胞的分化。

4. 本申请方法所获得的肝细胞的特异性基因mRNA比常规方法所得的肝细胞的特异性基因表达量高，糖原合成能力强，尿素合成能力好。

附图说明

图1：细胞外基质的制备过程示意图。

图2：ECM的光镜和电镜下形态。

图3：免疫荧光技术分析ECM脱细胞前后基质成分变化图。

图4：PAS染色检测利用ECM诱导分化人BMSC后合成糖原能力图，图B、D是第21天、28天糖原染色图，图A和图C是利用TCPS诱导分化的第21天、28天糖原染色图作为对照。

图5：分光光度法检测利用ECM诱导分化人BMSC后合成尿素的能力图，利用TCPS诱导分化人BMSC后合成尿素作为对照。

图6： Real-time RT-PCR分析利用ECM诱导分化人BMSC后肝脏细胞特异性基因mRNA表达图，利用TCPS诱导分化人BMSC肝脏细胞特异性基因mRNA作为对照，左侧纵坐标表示mRNA相对表达量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1 肝细胞的诱导生成

S1. 明胶涂层交联改性：

首先在12孔板中加入0.2%明胶溶液，放于37℃、5%CO₂培养箱中静置1小时，再加入1%戊二醛溶液和1M乙醇胺溶液，室温静置30min。

S2. 诱导骨髓间充质干细胞分泌细胞外基质，过程如图1所示:

将骨髓间充质干细胞按照3,000 个细胞/cm²的密度接种到明胶交联过的含有完全培养基的细胞培养基材中，完全培养基为（α-MEM基础培养基，10%胎牛血清，100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和0.25 μg/ml二性霉素B）。当细胞密度达到90%融合时，在培养液中加入50 μg/mL抗坏血酸继续培养。为获得脱细胞ECM，将骨髓间充质干细胞分泌的ECM浸泡在含有0.5% Triton X-100和20mM氨水的PBS中，放于37℃、5% CO₂培养箱中静置5 min，最后用PBS洗净，放置于4℃冰箱备用。

S3. 利用ECM体外诱导BMSC分化为成肝细胞

BMSC种植在铺有ECM的培养瓶中，前两周使用诱导分化培养基，其组成为： DMEM/F12基础培养基、10% FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、0.25μg/ml二性霉素B、20ng/ml肝细胞生长因子、10ng/ml成纤维细胞生长因子4。后两周使用成熟培养基，其组成为： DMEM/F12基础培养基、10% FBS、20ng/mL制瘤素M、100μM地塞米松、100μM胰岛素—转铁蛋白—亚硒酸钠（ITS）、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、0.25μg /ml二性霉素B。

一共培养28天即可诱导得到肝细胞。

实施例2 细胞外基质的镜下观察

ECM先在光镜下观察拍照，再经过4%的多聚甲醛固定和梯度酒精（50%、75%、80%,、95%、100%）脱水后，电镜下观察形态结构，结果如图3所示。

实施例2 细胞外基质的荧光染色

ECM在脱细胞处理前后，分别先用冰甲醇固定，接着用1%的牛血清白蛋白封闭，加I型胶原、III型胶原、纤维连接蛋白、核心蛋白多糖、层粘连蛋白抗体的一抗进行孵育，用PBS清洗三次后，加入二抗，用免疫荧光显微镜观察，结果如图3所示。

实施例4 分化细胞的鉴定

1. 采用糖原合成能力鉴定分化的肝细胞

在诱导分化的第14、28天收集细胞，先用4%的多聚甲醛固定，然后使用1%过碘酸溶液室温孵育5分钟，接着用PBS冲洗，加入品红试剂染色15min，镜下观察，结果如图4所示

2. 采用尿素合成能力鉴定分化的肝细胞

在诱导分化的第7、14、21、28天分别收集培养上清，放置于-80℃低温冰箱，待实验结束后统一使用分光光度法检测上清中的尿素浓度，结果如图5所示。

3. 利用Real-time RT-PCR鉴定肝脏细胞特异性基因mRNA的表达

在BMSC向肝细胞诱导分化的第7、14、21、28天分别抽取总RNA，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）作内参，分别进行Real-time RT-PCR反应分析六个肝脏细胞特异性基因mRNA的表达情况，所得数据通过χ=2-ΔΔCt（ΔΔCt=ΔE-ΔC, ΔE=Ctexp-CtGAPDH, and ΔC=Ctct1-CtGAPDH）分析基因相对表达量的情况，结果如图6所示。

Claims

1. 骨髓间充质干细胞自分泌的细胞外基质诱导其成为肝细胞的方法的应用，其特征在于，所述的细胞外基质为诱导骨髓间充质干细胞自身所分泌的并且去除了骨髓间充质干细胞的基质。

2. 一种利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 明胶涂层交联改性：为了增加细胞外基质的附着力，将细胞培养基材中加入明胶溶液，在培养箱中静置，加入戊二醛溶液和乙醇胺溶液，室温静置，

所述的诱导分化培养基包含以下物质：DMEM/F12基础培养基、特级胎牛血清、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4、青霉素、链霉素、二性霉素B。

3. 根据权利要求2所述的利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，其特征在于，所述的步骤S1中的在培养箱中静置的温度为37℃、含二氧化碳量为5%，静置时间为1小时；所述的室温静置的时间为半小时。

4. 根据权利要求2所述的利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，其特征在于，所述的步骤S2中所述的完全培养基包含以下物质：α-MEM基础培养基、特级胎牛血清、青霉素、链霉素和二性霉素B。

5. 根据权利要求2所述的利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，其特征在于，步骤S2中所述的加入抗坏血酸的时间为，培养至细胞密度达到90%时。

6. 根据权利要求2所述的利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，其特征在于，步骤S2中所述的去除骨髓间充质干细胞的方法为将骨髓间充质干细胞分泌的ECM浸泡在含有0.5% Triton X-100和20mM氨水的PBS中，放于37℃、5% CO₂培养箱中静置5 min，最后用PBS洗净。

7. 根据权利要求2所述的利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，其特征在于，步骤S3中所述的成熟培养基为DMEM/F12基础培养基、特级胎牛血清、制瘤素M、地塞米松、胰岛素—转铁蛋白—亚硒酸钠、青霉素、链霉素、二性霉素B。