CN103396476B

CN103396476B - 两个环六肽化合物及其在制备抗菌药物中的应用

Info

Publication number: CN103396476B
Application number: CN201310322638.2A
Authority: CN
Inventors: 鞠建华; 宋永相; 黄洪波; 张云
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2013-07-29
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2033-07-29
Also published as: CN103396476A

Abstract

本发明公开了一类环六肽化合物及其在制备抑菌药物中的应用。环六肽化合物其结构如式（Ⅰ）所示：式（Ⅰ）中化合物1：R=Me；或化合物2：R=H。本发明的环六肽化合物-化合物1和化合物2是新的化合物，对测试细菌具有较好的抑制作用，可以用于制备抑菌药物或作为抑菌药物的前体，用于治疗细菌感染，因此本发明为开发抑菌药物提供了新的备选化合物，对开发中国海洋药物资源具有重要的意义。

Description

两个环六肽化合物及其在制备抗菌药物中的应用

技术领域：

本发明属于天然产物领域，具体涉及两个环肽类化合物及其在制备抗菌药物中的应用。

背景技术：

长期以来，天然产物来源的抗菌类抗生素用于抑制或治疗各种致病微生物感染，也为维护人类健康做出了巨大的贡献。统计显示，今天人类寿命较上世纪初增加了近20岁，其中约有10岁得益于抗生素的广泛使用。截止到2011年，用于临床的抗生素及其衍生物已达166个之多。然而，由于抗生素的频繁使用，近年来不断出现能够抵抗多种抗生素的“超级细菌”，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，耐万古霉素肠球菌（VRE）、耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(包括NDM-1)等，这些“超级细菌”已经严重威胁到了人类的生命健康。对此，人们一方面要合理使用抗生素，减缓具有多种耐药性的“超级细菌”的出现，另一方面，针对耐药细菌要加强新药研究进程，以缩短新型抗生素的问世时间。在抗生素药物的开发中，环肽类化合物化合物，一直以来是抗生素研发的重要先导化合物来源。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供两个具有抑菌活性的环六肽化合物及其药用盐。

本发明的环六肽化合物及其药用盐，其结构如式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ）中，化合物1：R=Me；或化合物2：R=H。

本发明人通过对深海放线菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46发酵提取物进行抑菌活性筛选和HPLC-DAD图谱分析，发现其在220和280nm具有色氨酸残基特征吸收峰的次级代谢产物组分具有明显的抑菌活性。进而，通过摇床放大发酵、萃取、分离纯化，得到两个含色氨酸类化合物1和2。同过MS/MS二级质谱，1D、2D NMR等技术，确定两个单体为环六肽化合物。具体结构如式（Ⅰ）所示，化合物1：R=Me；或化合物2：R=H。

通过对化合物1和化合物2的抑菌活性评价，发现其对金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus ATCC29213），肺炎球菌（Streptococcus pneumoiae NCTC7466）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）有较好抑制活性，具有开发抗菌药物先导化合物的潜力。

因此本发明的第二个目的是提供化合物1或化合物2在制备抗菌药物中的应用。

所述的抗菌药物优选为抗金黄色葡萄球菌、肺炎球菌或耐甲氧西林表皮葡萄球菌的药物。

本发明的第三个目的是提供一种抗菌药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的如式（Ⅰ）所示的化合物1或化合物2，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

本发明的环六肽化合物-化合物1和化合物2是新的化合物，对测试细菌具有较好的抑制作用，可以用于制备抑菌药物，用于治疗细菌感染，因此本发明为开发新的抑菌药物提供了备选化合物，对开发中国海洋药物资源具有重要的意义。

本发明的深海放线菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46于2013年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC NO.7862。

附图说明：

图1是化合物1的¹H NMR（500MHz）图谱，溶剂为：氘代DMSO；

图2是化合物1的¹³C NMR（125MHz）图谱，溶剂为：氘代DMSO；

图3是化合物2的¹H NMR（500MHz）图谱，溶剂为：氘代DMSO；

图4是化合物2的¹³C NMR（125MHz）图谱，溶剂为：氘代DMSO。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

如式（Ⅰ）所示的化合物1和化合物2的制备和结构鉴定

一、如式（Ⅰ）所示的化合物1和化合物2的制备

1.种子培养：

（1）种子培养基配方：以质量分数100%计，包括可溶性淀粉0.5%，大豆粉0.5%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.2%，K₂HPO₄0.05%，MgSO₄·7H₂O0.05%，NaCl0.4%，粗海盐0.3%，pH7.2-7.4，CaCO₃0.2%，余量为水。按照配方将称量好的上述物质溶解、混匀，以每瓶50mL分装于250mL的锥形瓶中，于121℃灭菌20分钟，做为种子培养基。

（2）种子的培养：将菌株Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46的菌丝体或孢子接入到上述种子培养基中，以200rpm的转速、在28℃下、摇床培养36小时得种子培养液。

2．放大发酵培养：

（1）放大发酵培养基配方：以总质量分数100%计，包括可溶性淀粉0.5%，大豆粉0.5%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.2%，K₂HPO₄0.05%，MgSO₄·7H₂O0.05%，NaCl0.4%，粗海盐0.3%，pH7.2-7.4，CaCO₃0.2%，余量为水。按照配方将称量好的上述物质溶解、混匀，配置总体积约8L，然后以每瓶200mL分装于1000mL的锥形瓶中，于121℃灭菌20分钟，做为放大发酵培养基。

（2）发酵培养：

在无菌条件下，将培养好的种子培养液分别接种于放大发酵培养基中，每1000ml锥形瓶（含约200mL放大发酵培养基）接种一瓶种子培养液（约50mL），以200rpm的转速、在28℃下、摇床培养6-7天得海洋放线菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46发酵产物。

3．提取分离：

将结束发酵的菌株Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46的发酵产物，以3600rpm离心10min，得上清发酵液和沉淀菌丝体。上清发酵液用丁酮等体积萃取3次，丁酮萃取液40℃减压浓缩得发酵液浸膏；沉淀菌丝体用共计1.5L丙酮萃取三次，丙酮萃取液在40℃下减压浓缩得菌体浸膏；经HPLC-DAD检测后，合并发酵液浸膏和菌体浸膏共计得约62.5g浸膏。该浸膏用100-200目硅胶分离，经拌样、干法装柱后，采用氯仿/甲醇(C/M,200/0,196/4,190/10,184/16,180/20,160/40,100/100,0/200v/v)梯度洗脱顺序得8个组分(A1-A8)。组分A4-A7（C/M,184/16,180/20,160/40,100/100，v/v，洗脱的馏分）合并，进一步用氯仿/甲醇（C/M,147/3,144/6,141/9,138/12,135/15,132/18,129/21,126/24v/v）硅胶（100-200目）柱梯度洗脱，顺序得到组分B1-B8。将所得组分B4-B6（C/M,138/12,135/15,132/18,v/v,洗脱的馏分）合并后用反相色谱柱YMC-Pack ODS-A(250×20mm,5μm)进行高压制备，制备流速为8mL/min，检测波长为260nm，在20min内以A/B：45%-68%的比例进行线性梯度洗脱（A：水，B：乙腈）。最终在保留时间为17.0和14.9min处分别得到化合物1（278.3mg）和化合物2（25.2mg）。

二、化合物1和化合物2的理化数据

对化合物1和化合物2进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：

化合物1:白色无定形粉末;[α]²⁵ _D-13.2(c0.36,MeOH);UV(MeOH)λ_max(logε)220(4.53),281(3.44)nm;IR(ATR)ν_max3256,1632,1531cm^-1;¹H and¹³C NMR图谱见图1-2;(+)-HRESIMS m/z697.4024[M+H]⁺(calcd for C₃₅H₅₃N₈O₇,697.4032)and719.3849[M+Na]⁺(calcd for C₃₅H₅₂N₈NaO₇,705.3851).

化合物2:白色无定形粉末;[α]²⁵ _D-11.9(c0.73,MeOH);UV(MeOH)λ_max(logε)220(4.58),281(3.68)nm;IR(ATR)ν_max3260,1632,1531cm^-1;¹H and¹³C NMR图谱见图3-4;(+)-HRESIMS m/z683.3879[M+H]⁺(calcd for C₃₄H₅₁N₈O₇,683.3875)and705.3699[M+Na]⁺(calcd for C₃₄H₅₀N₈NaO₇,705.3695).

根据以上理化数据分析可知，化合物1和化合物2的结构如式（Ⅰ）。

式（Ⅰ）中，化合物1：R=Me；或化合物2：R=H。

实施例2：

对实施例1的环六肽化合物-化合物1和化合物2的抑菌实验。

用金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus ATCC29213），肺炎球菌（Streptococcuspneumoiae NCTC7466），肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia ATCC13883），耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）做为测试细菌，参照CLSI的微孔板法对化合物1-2进行100μl体系测试活性。具体为：

1）细菌培养：以Mueller-Hinton（MH）肉汤培养基培养实验菌，当其生长8-12h至约0.5个Mcfarland浓度（1×10⁸CFU）时备用。并配置好一定浓度的样品溶液和阳性对照溶液，阳性对照选用氨苄西林、卡那霉素两种（水溶）。

2）配置样品与稀释菌液。将样品（化合物1或2）配置成3200μg/mL，均以DMSO溶解。将菌液合理稀释，保证最终测试浓度约为5×10⁴CFU。

3）加MH肉汤。用排枪往96孔板中加MH肉汤，第1列加92μl、第12列加100μl无菌MH肉汤，其余各列加入50μl无菌MH肉汤，第11列和第12列分别作为阳性和阴性对照。

4）加样品（药品）：吸取8μl事先配好的样品溶液或阳性对照溶液（也以DMSO溶解），加入第1列。将排枪体积设置为50μl，将第1列的测试药物小心上下吸取4-5次，以混合均匀，期间要防止用力过猛溅出。

5）混匀样品（药品）。用排枪从第一列中吸取50μl，加入到对应的第二列中，上下吸取小心4-5次，混匀后再吸取50μl加入第三排。依次类推，直到稀释至第10列，从第10列中取出50μl弃掉。

6）活性测试。向1-11列每孔加入50μl稀释的实验菌液。此时，第1列至第10列药物浓度分别为128，64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。盖上盖子，轻微震荡，置于37℃培养箱培养12-18小时，第11列做阳性对照，第12列做空白对照，确定出每个样品的MIC值。

11.每个样品做3个平行。实验结果见表2。

表2：化合物1-2对5株测试细菌的MIC值（μg/mL）

nt:not test

由表2可见，化合物1和2对金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus ATCC29213），肺炎球菌（Streptococcus pneumoiae NCTC7466）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）有较好的抑菌活性。尤其是对耐甲氧西林表皮葡萄球菌的抑制活性，为以此为基础进行耐药性抗生素的研发提供了支持。

综上所述，本发明为研制新型抗菌药物提供了新的先导化合物，在此基础上，对进一步开发中国海洋药物资源具有重要的意义。

Claims

1.结构如式(Ⅰ)所示的环六肽化合物及其药用盐：

其中R＝Me或R＝H。

2.权利要求1所述的化合物在制备抗菌药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌、肺炎球菌或耐甲氧西林表皮葡萄球菌的药物。

4.一种抗菌药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的权利要求1所述的化合物，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

5.根据权利要求4所述的抗菌药物，其特征在于，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌、肺炎球菌或耐甲氧西林表皮葡萄球菌的药物。