CN103394094B - 基于牛血清白蛋白-聚己内酯的高分子脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于牛血清白蛋白（BSA）-聚己内酯（PCL）的新型高分子脂质体及其制备方法。其步骤是：在容器中加入BSA-PCL键合体，加有机溶剂溶解，再加入去离子水，然后用探头式超声波发生器以100～300W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液，将上述乳液在35℃下于旋转蒸发仪上以80转每分钟的旋转速度进行旋蒸。当有机溶剂完全挥发后，继续旋蒸30分钟，即得到高分子脂质体溶液。本发明采用一种新型的牛血清白蛋白-聚己内酯蛋白质-高分子键合体作为双亲性高分子，通过反相蒸发法制备出的高分子脂质体粒径均一，粒径大小在100-200nm之间，并具有生物相容性好、毒性低以及可生物降解等优点。
Description
技术领域
本发明涉及药物载体材料制备技术领域，特别涉及一种新型的基于蛋白质-高分子键合体的高分子脂质体及其制备方法。
背景技术
研制多功能的纳米载体平台是目前生物医学领域的研究热点。在众多的载体系统中，脂质体制备技术由于其生物相容性好，制备工艺简单，药物包封率高等优点收到研究者的青睐。但是由于其自身存在无法克服地缺陷性，如稳定性差，药物易渗漏，无法功能化等，从而严重限制了脂质体技术的进一步应用。因此，本文拟利用脂质体制备技术研制一种新型的载体系统。
“高分子脂质体”其优势主要体现在：1)脂质体结构稳定：目前传统脂质体结构不稳定，从而造成粒径不均一，尺寸难以控制，在储存尤其是体内应用时极易发生团聚，难以被机体代谢，易从肾脏排泄，从而降低了药物的使用效率。而通过高分子自组装制备得到的高分子脂质体，由于其分子量大，组成的脂质体结构更稳定，尺寸稳定性好，不容易发生团聚，且制剂在溶液里储存时间更长。2)长循环功能：通过表面PEG的修饰，可使高分子脂质体不易被人体网状内皮系统捕捉，延长在体内的循环时间，同时增加高分子脂质体的生物利用度和生物相容性。利用PEG等天然或合成的聚合物修饰类脂可延长脂质体的体内半衰期；而PEG的惰性屏蔽作用也能够逃脱机体免疫系统的防御攻击。研究表明含PEG 4000的脂质体注射后药物血中含量高，存留时间长，72h后还可测出。3)分子靶向功能：由于肿瘤细胞表面一些受体高度表达，使用与受体可特异性结合的靶向分子如单克隆抗体、叶酸、RGD、核酸适配子等接到高分子脂质体的表面，从而经表面修饰实现高分子脂质体对肿瘤细胞的靶向定位。4)药物的可控释放：使用具有刺激响应性的高分子制备高分子脂质体，可实现高分子脂质体对药物的可控释放。刺激响应性主要包括PH敏感、光敏感、热敏感以及氧化还原敏感。具有刺激响应性的高分子可根据外界环境的变化其性质发生变化，这为我们设计药物载体方面带来许多新的思路。如我们可以利用肿瘤组织PH(PH为6.5左右)低于正常组织(PH为7.4)这一特点，使用具有PH敏感的材料-聚(N,N-二甲基乙氧基丙烯酸酯)制备高分子脂质体，即可实现药物在肿瘤组织处的释放。
到目前为止，研究者已经合成了一系列用于制备高分子脂质体的材料。总体来说，用于制备高分子脂质体的材料一般是由具有双亲性的高分子通过自组装来制备。常用的组成双亲性高分子的亲水聚合物主要包括：聚乙二醇(PEG)、多肽(如聚谷氨酸)、聚丙烯酸(PAA)和聚(2-甲基丙烯酞氧基乙基磷酸胆碱)(PMPC)等。常用的组成双亲性高分子的疏水聚合物主要包括：聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丁二烯(PBD)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)和聚(N,N-二甲基氨基乙氧基甲基丙烯酸酯)(PDAEMA)等。选用不同链长的亲水聚合物与疏水聚合物得到的双亲性聚合物，通过自组装可以得到不同形貌的组装体。自20世纪70年代起，高分子化学家就开始研究嵌段共聚物在选择性溶剂中的胶束化问题。但在很长时间里，所研究的对象多为球形核壳胶束，且多为成核链较短，成壳链较长的“星形胶束”。1995年张立峰和Adi Eisenberg在science上面报道了二嵌段共聚物聚苯乙烯-b-聚丙烯酸(PS-b-PAA)，当固定其中PS链段而改变PAA链段长时，可得到包括球、棒、高分子脂质体和大复合胶束(亦称反胶束胶团)的一系列不同形态的组装体。这项工作在嵌段共聚物溶液中自组装的研究中可谓是里程碑式的成果，也为高分子脂质体的出现奠定了理论基础。其后人们对其做了大量的研究，总体来说，对于嵌段共聚物来说，当亲水链与疏水链的比例大于1时易组装成胶束，而当亲水链与疏水链的比例小于0.5时更易组装成高分子脂质体。当然嵌段共聚物的自组装还受好多条件的影响，比方说所选用的溶剂、水油体积比、聚合物浓度等等。以上所述只是从嵌段共聚物的结构上面进行初步的预测。
选用不同的亲疏水链组装的成高分子脂质体远远还达不到作为药物载体所需的要求。用作药物载体的高分子首先从选材上来说，所用的材料要求不但生物安全性好、毒性低、可生物降解，而且还应该赋予药物载体一些功能，比方说在体内长循环、靶向和可控释放。虽然这些功能可以通过连接其他分子实现，但首先得保证所选用的高分子含有可功能化的基团。因此，选择优异的材料制备出生物安全性好且可生物降解的高分子脂质体用作药物载体仍是研究者在努力的方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物安全性好且可生物降解的高分子脂质体及其制备方法，该高分子脂质体是通过采用反相蒸馏法，制备出的基于BSA-PCL键合体的纳米组装体。选用的BSA-PCL键合体基材，其结构式如下：
本发明的技术方法如下：
在容器中加入BSA-PCL键合体，加有机溶剂溶解，再加入去离子水，然后用探头式超声波发生器以100～300W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液，将上述乳液在35℃～45℃下于旋转蒸发仪上以80～100转每分钟的旋转速度进行旋蒸。当有机溶剂完全挥发后，继续旋蒸20～30分钟，即得到高分子脂质体溶液。
所述的制备方法，其特征在于所选用的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷的任意一种。
所述的制备方法，其特征在于BSA-PCL键合体水溶液浓度在0.5mg/ml至4mg/ml之间。
所述的制备方法，其特征在于去离子水与有机溶剂的体积比例在1:1～8:1之间。
所述的制备方法，其特征在于所使用旋蒸温度为35℃，旋蒸速度为80转每分钟。
所述的制备方法，其特征在于有机溶剂完全挥发后，旋蒸时间为30分钟。
本发明制备的生物安全性好且可生物降解的高分子脂质体粒径均一且大小在100～200nm之间。
本发明制备的新型的高分子脂质体优于在于：
1.选用新型的BSA-PCL键合体为双亲性高分子，制备的高分子脂质体生物安全性好且可生物降解，是一种很好的药物载体。
2.采用反相蒸发法制备的高分子脂质体粒径均一且大小在100～200nm之间。
附图说明
图1本发明制备的高分子脂质体的透射电镜照片。
图2本发明制备的高分子脂质体的粒径大小及粒径分布。
具体实施方式
下面的实施案例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
本发明的BSA-PCL键合体基材，可以使用下列方法制备：
选用牛血清白蛋白(BSA)和聚己内酯(PCL)，利用BSA上的巯基(-SH)将马来酰亚胺化的PCL键合到BSA上，所使用的PCL的分子量为2000～10000；其结构式如下：
1)使用二氯亚砜将端基为羧基的PCL酰氯化，反应温度为60～85℃，反应时间为4～6h；
2)将1)制备的酰氯化的PCL溶解好后加入马来酰亚胺，PCL与马来酰亚胺的摩尔比为1:2～1:5，反应时间为12～24h，反应温度为20～40℃，反应结束，透析除去过量的马来酰亚胺，然后除去溶剂得到马来酰亚胺化的PCL粉末；
3)将2)制备的马来酰亚胺化的PCL溶解好后滴加到牛血清白蛋白的水溶液中，在室温下，利用BSA上的巯基(-SH)与马来酰亚胺通过迈克尔加成反应，制备得到BSA-PCL蛋白质—高分子键合体，BSA与PCL的摩尔比为1:1～1:3，反应时间为12～24h，经后处理得到BSA-PCL键合体絮状产品。
所述的步骤2)中溶解酰氯化后的PCL的溶剂为丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷中的一种或多种的组合。
所述的步骤2)中对于过量的马来酰亚胺采用透析的方法除去，透析所用溶剂为丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷中的一种或多种的组合。
所述步骤3)中溶解马来酰亚胺化的PCL的溶剂为四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺的一种或多种的组合。
所述的步骤3)中后处理过程为反应结束后，透析除去体系中未反应的PCL，然后冻干得到产品。透析先在四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺的一种或多种的组合溶剂中进行，然后转移至水中透析。
实施案例1：
称取1mg BSA-PCL键合体溶于2ml二氯甲烷中，再加入2ml去离子水，然后用探头式超声波发生器以100W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液，将上述乳液在35℃下于旋转蒸发仪上以80转每分钟的旋转速度进行旋蒸。当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后，继续旋蒸20分钟，即得到高分子脂质体溶液。浓度为0.5mg/ml。冻干，得高分子脂质体。
实施案例2：称取2mg BSA-PCL键合体溶于1ml二氯甲烷中，再加入2ml去离子水，然后用探头式超声波发生器以150W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液，将上述乳液在40℃下于旋转蒸发仪上以90转每分钟的旋转速度进行旋蒸。当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后，继续旋蒸25分钟，即得到高分子脂质体溶液，浓度为1mg/ml。冻干，得高分子脂质体。
实施案例3：
称取4mg BSA-PCL键合体溶于1ml三氯甲烷中，再加入2ml去离子水，然后用探头式超声波发生器以200W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液，将上述乳液在45℃下于旋转蒸发仪上以100转每分钟的旋转速度进行旋蒸。当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后，继续旋蒸30分钟，即得到高分子脂质体溶液，浓度为2mg/ml。冻干，得高分子脂质体。
实施案例4：
称取16mg BSA-PCL键合体溶于2ml二氯甲烷和三氯甲烷的混合溶液中，再加入4ml去离子水，然后用探头式超声波发生器以200W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液，将上述乳液在45℃下于旋转蒸发仪上以80转每分钟的旋转速度进行旋蒸。当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后，继续旋蒸30分钟，即得到高分子脂质体溶液，浓度为4mg/ml。冻干，得高分子脂质体。
实施案例5：称取4mg BSA-PCL键合体溶于0.5ml二氯甲烷中，再加入2ml去离子水，然后用探头式超声波发生器以250W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液，将上述乳液在45℃下于旋转蒸发仪上以80转每分钟的旋转速度进行旋蒸。当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后，继续旋蒸30分钟，即得到高分子脂质体溶液，浓度为2mg/ml。冻干，得高分子脂质体。
实施案例6：
称取8mg BSA-PCL键合体溶于0.5ml三氯甲烷中，再加入4ml去离子水，然后用探头式超声波发生器以300W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液，将上述乳液在35℃下于旋转蒸发仪上以80转每分钟的旋转速度进行旋蒸。当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后，继续旋蒸30分钟，即得到高分子脂质体溶液，浓度为2mg/ml。冻干，得高分子脂质体。
实施案例7：称取4mg BSA-PCL键合体溶于1ml二氯甲烷中，再加入2ml去离子水，然后用探头式超声波发生器以250W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液，将上述乳液在35℃下于旋转蒸发仪上以80转每分钟的旋转速度进行旋蒸。当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后，继续旋蒸30分钟，即得到高分子脂质体溶液，浓度为2mg/ml。冻干，得高分子脂质体。将冻干粉在水中分散，透射电镜观察其形貌见图1。
实施案例8：称取4mg BSA-PCL键合体溶于1ml二氯甲烷中，再加入2ml去离子水，然后用探头式超声波发生器以300W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液，将上述乳液在35℃下于旋转蒸发仪上以80转每分钟的旋转速度进行旋蒸。当茄形瓶中的有机溶剂完全挥发后，继续旋蒸30分钟，即得到高分子脂质体溶液，浓度为2mg/ml。冻干，得高分子脂质体。未冻干前取少量高分子脂质体溶液稀释测其粒径大小在100～200nm，见图2。
Claims (7)
1.一种高分子脂质体，其特征是采用反相蒸发法，由牛血清白蛋白(BSA)-聚己内酯(PCL)蛋白质-高分子键合体自组装制备得到，粒径大小在100-200nm之间，所述键合体中PCL的分子量为2000～10000，其结构式如下：
2.权利要求1的高分子脂质体的制备方法，其特征在于步骤如下：
在容器中加入BSA-PCL键合体，加有机溶剂溶解，再加入去离子水，然后用探头式超声波发生器以100～300W的功率对其进行超声分散，直至形成半透明乳液，将上述乳液在35℃～45℃下于旋转蒸发仪上以80～100转每分钟的旋转速度进行旋蒸；当有机溶剂完全挥发后，继续旋蒸20～30分钟，即得到高分子脂质体。
3.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于所选用的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷的一种或两种的组合。
4.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于BSA-PCL键合体水溶液的浓度在0.5mg/ml至4mg/ml之间。
5.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于去离子水与有机溶剂的比例在1:1～8:1之间。
6.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于所用的旋蒸温度为35℃，旋蒸速度为80转每分钟。
7.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于有机溶剂完全挥发后，旋蒸时间为30分钟。
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