CN103389268A - 显微镜的控温载物片及其使用光学显微镜观察抗冻蛋白冰晶形态变化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及冰晶形态观察技术领域，特别涉及利用普通光学显微镜观察冰晶形态变化的方法。一种显微镜的控温载玻片，其主要特点是将两片载玻片之间设有冷却软管，冷却软管的两端分别与低温冷却循环仪的出口和进口相连接。一种使用普通光学显微镜观察抗冻蛋白冰晶形态变化的方法，其主要特点是包括有以下步骤：（1）.抗冻蛋白的提取；（2）.制备显微镜的控温载玻片;（3）.观察冰晶形态变化，并观察冰晶生长过程。

Description

显微镜的控温载物片及其使用光学显微镜观察抗冻蛋白冰晶形态变化的方法

技术领域

本发明涉及冰晶形态观察技术领域，特别涉及抗冻蛋白溶液中冰晶形态变化的观察，以及利用普通光学显微镜观察冰晶形态变化的方法。 

背景技术

低温胁迫包括0℃-12℃之间的冷胁迫和O℃以下的冰冻胁迫两种，环境温度改变会引起物质在水溶液中发生物理化学变化。温度过低所导致的细胞结冰往往伴随着脱水，细胞内外渗透压增大，胞内浓度增大，细胞体积缩小，质膜系统和细胞骨架受到损伤，生物大分子活性改变、功能丧失，有害物质积累，植物细胞器如线粒体、叶绿体、核糖体的结构与功能受到影响。植物体内包括光合、呼吸、生长发育、代谢、蒸腾以及营养水分吸收等在内的几乎所有的生命活动都会不同程度地受到寒冷胁迫的干扰。因此，研究低温下植物存在的抗寒冷机制也成为当今热潮，其中丰富多样的低温诱导蛋白质中的抗冻蛋白（AFPs，又叫热滞蛋白质）在植物抗寒冷机制中有着十分重要的作用。 

从本世纪60年代DeVries等发现AFPs以来，人们试图分离纯化高活性AFPs，并期望将这一性状用于改良某些重要生物和农作物品种的抗冻性能，先后对鱼类、昆虫和植物AFPs开展研究。目前，AFPs成为农作物基因工程、组织器官低温保存和生物结构学研究的热点。 

研究发现，虽然不同抗冻蛋白在结构上有很大差异，但都具有相似的抗冻性能。迄今为止，发现的抗冻蛋白的抗冻功效主要有：以非依数性形式降低溶液冰点，修饰冰晶生成形态，抑制冰晶重结晶，降低过冷点，抑制冰核蛋白的成冰核作用，降低冰晶形成速度，保护细胞膜免遭低温损伤，以及降低玻璃化和去玻璃化损害。 

目前，观察研究抗冻蛋白的方法主要有一下几种； 

（1）经典的抗冻蛋白活性测定方法(DeVries法)，自DeVries提出利用相差显微镜 或倒置相差显微镜来观测毛细管中样品的结晶状态，毛细管法一直作为测定抗冻蛋白活性最基本的方法。此法是将待测样品装于毛细管内，快速冷冻。然后再缓慢升温使得毛细管内的冰晶熔融，冰晶开始消失的温度即为熔点。再缓慢降温使冰晶长大，冰晶开始生长的温度即为冰点。冰点和熔点之差即为热滞活性。没有抗冻蛋白的溶液中随着一开始降温就能清楚地观察到二次结冰。而在含有抗冻蛋白的溶液中，二次结冰在抗冻蛋白的作用被更低的温度克服时才出现。 

（2）改进的显微镜冰晶观察法。同样也是利用相差显微镜进行观察，不同的是，此种方法用特制的不锈钢样品槽代替了毛细管，低温循环仪通过乳胶管与圆柱盒侧壁相连，冷却剂酒精通过圆柱盒外腔时可以使悬浮的样品迅速降温，从而进行冰晶生长观察。与经典的DeVries法相比，改进法缩短了操作时间，不用进行毛细管的烧结与封蜡，温度控制更加直接和快捷，可以直接在显微镜下观察冰晶形态变化，这是DeVries法所不能的。但是改进法也有其不足,对仪器设备要求较高,除了需要使用相差显微镜外,还要特制不锈钢样品槽。 

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供一种显微镜的控温载玻片。 

又一目的提供一种使用普通光学显微镜观察抗冻蛋白冰晶形态变化的方法。在没有相差显微镜的条件下，可以用普通显微镜来进行冰晶形态观察，方法更加简便，推广性更强。 

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种显微镜的控温载玻片，其主要特点是将两片载玻片之间设有冷却软管，冷却软管的两端分别与低温冷却循环仪的出口和进口相连接。 

一种显微镜的控温载玻片，其主要特点是将两片载玻片之间设有冷却软管，冷却软管出口与蠕动泵的进口端连接，蠕动泵的出口端连接保温盒的进口端，保温盒的出口端与冷却软管进口相连接；在载玻片上设有快速检测探针温度计；在保温盒中有-20℃～-18℃的无水乙醇，保温盒的进口管和出口管分别插入-20℃～-18℃的无水乙醇内。 

一种使用普通光学显微镜观察抗冻蛋白冰晶形态变化的方法，其主要特点是包括有以下步骤： 

（1）.抗冻蛋白的提取；按常规提取。 

（2）.制备所述的显微镜的控温载玻片; 

（3）.吸取10μL浓度为10mg/ml的抗冻蛋白溶液滴于所述的控温载玻片上，调节显微镜，同时控制低温冷却循环仪使载玻片上的样品迅速冷却，速率为0.5℃／min,冷却到-15℃以下，逐渐结冰，待样品充分固化后，以0.05℃/5min的速率熔融冰晶，当冰晶融化体积达到1/3-1/2，温度为-2.15～-2.05℃时降温处理，速率为0.05℃/5min，温度降至-15℃，并观察冰晶生长过程。 

抗冻蛋白(AFPs)是一类能吸附到冰晶表面并抑制其它水分子与冰晶结合的蛋白质。吸附到冰晶上的抗冻蛋自具有热滞活性和修饰冰晶形态功能，降低溶液冰点，抑制冰晶重结晶，有利于降低组织细胞的冰冻损伤,对研究植物抗寒有重大意义。 

本发明的有益效果： 

在普通光学显微镜下能观察到冰晶生长过程，水和冰化学组成成分相同，但其结构和理化性质差异很大。常温常压下，水以液态形式存在，冰点为0℃，冰晶是水分子,间氢键结合的分子晶体，略显白色。液态水的密度为1000kg/m³(4℃时），冰晶的密度为0℃时0.9g/cm³，在一定范围内，随着温度降低密度逐渐变小。水的折射率在20℃时为1.333，冰的折射率在0℃时为1.309,。正是由于水和冰密度及折射率的差异，加之颜色（光的波长）也略有不同，光线在通过样品时波长和振幅都会发生明显变化，从而我们就能在普通光学显微镜下观察到冰晶生长的过程。 

此方法相比传统的相差显微镜观察法，操作更加简便，仪器要求相对较低，不需要特质不锈钢样品槽，在没有相差显微镜的条件下也能用普通光学显微镜进行冰晶形态观察，大量节省了人力,物力和财力。 

使用载玻片代替特质不锈钢样品槽简化了样品承载装置，取材更加方便；普通光学显微镜代替相差显微镜大大节省成本，同时也能达到观察效果；控温载物片的设计使得样品观察更加方便，同时能精确控制温度；在没有低温冷却循环仪的情况下，本发明通过控制蠕动泵中无水乙醇的流速，结合快速检测探针温度计来调控样品温度同样能达到较好的控温效果，大大降低了实验成本。 

一台国产相差显微镜价格约为10000-30000元不等，一台国产光学显微镜价格在3000元左右；国产低温冷却循环仪价格在8000-20000元，进口低温冷却循环仪售价100000元左右，国产蠕动泵价格为1000-4000元；特质不锈钢样品槽价格40元，载玻片价格5元。本专利中使用凡帝朗品牌DHX-2020型低温冷却循环仪（温度范围-20-100℃，精度±0.05℃）价格8000元，Longer/兰格BT100-2J型蠕动泵（显示转速，转速范围： 0.1-100rpm，流量范围：0.007-380ml/min）价格为2300元。 

附图说明

图1本发明实施例1的结构示意图； 

图2本发明实施例2的结构示意图； 

图3实验例中普通蛋白提取液中冰晶形状（10×物镜）； 

图4实验例中抗冻蛋白液中冰晶形状（10×物镜）； 

图5实验例中抗冻蛋白液中冰晶形状（50×物镜） 

图中：1.双锥形；2.六边形； 

图6实验例中抗冻蛋白液重结晶抑制现象； 

图7实验例中A ddH2O中冰晶形态；B较低浓度抗冻蛋白液（含量5mg/ml）中冰晶形态；C较高浓度抗冻蛋白液（10mg/ml）中冰晶形态； 

图8实验例中相差显微镜观察结果B;ddH2O中冰晶形态；C-F不同浓度抗冻蛋白液中冰晶形态。 

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。 

实施例1：见图1，一种显微镜的控温载玻片，将两片载玻片1之间设有冷却软管3，冷却软管3的两端分别与低温冷却循环仪4的出口4-1和进口4-2相连接，两片载玻片由两个夹子2固定也可以使用螺栓固定调整。低温冷却循环仪为凡帝朗品牌DHX-2020型，温度范围-20-100℃，精度±0.05℃。 

所述的低温冷却循环仪4包括有载冷剂、蒸发器、压缩机，在出口与蒸发器之间设有循环泵。 

实施例2：见图2，一种显微镜的控温载玻片，将两片载玻片1之间设有冷却软管3，冷却软管3出口3-1与蠕动泵5的进口端连接，蠕动泵5的出口端连接保温盒6的进口端，保温盒6的出口端与冷却软管3进口3-2相连接；在载玻片1上设有快速检测探针温度计7；在保温盒6中有-20℃～-18℃的无水乙醇8，保温盒6的进口管6-2和出口管6-1分别插入-20℃～-18℃的无水乙醇8，两片载玻片由两个夹子固定也可以使用螺栓固定调整。Longer/兰格BT100-2J型蠕动泵，显示转速，转速范围：0.1-100rpm，流量范 围：0.007-380ml/min。 

使用蠕动泵，需配备一个快速检测探针温度计,温度范围-40℃～150℃,测量精度±1.0℃，分辨率0.1℃,橡胶管的一端连接蠕动泵的出口，另一端连接盛放-20℃～-18℃无水乙醇的保温盒内，蠕动泵的进口有一根橡胶管与保温盒相连，这样就组成了一个冷却循环系统。温度探头测量载玻片温度，通过蠕动泵控制橡胶管内-20℃～-18℃无水乙醇的流速,从而达到调控载玻片上样品温度的目的。 

实施例3：一种使用普通光学显微镜观察抗冻蛋白冰晶形态变化的方法，包括有以下步骤： 

（1）.抗冻蛋白的提取；按常规或标准提取。 

（2）.制备显微镜的控温载玻片;将两片载玻片1之间设有冷却软管2，冷却软管3出口3-1与蠕动泵5的进口端连接，蠕动泵5的出口端连接保温盒6的进口端，保温盒6的出口端与冷却软管3进口3-2相连接；在载玻片1上设有快速检测探针温度计7；在保温盒6中有-20℃～-18℃的无水乙醇8，保温盒6的进口管6-1和出口管6-2分别插入-20℃～-18℃的无水乙醇8。Longer/兰格BT100-2J型蠕动泵，显示转速，转速范围：0.1-100rpm，流量范围：0.007-380ml/min。 

（3）.吸取10μL浓度为10mg/ml的抗冻蛋白溶液滴于所述的控温载玻片上，调节显微镜，同时控制低温冷却循环仪使载玻片上的样品迅速冷却，速率为0.5℃／min,冷却到-15℃以下，逐渐结冰，待样品充分固化后，以0.05℃/5min的速率熔融冰晶，通过控制蠕动泵降低冷却软管内无水乙醇流速并利用室内温度,结合快速检测探针温度计来实现样品冰晶熔融，当冰晶融化体积达到1/3-1/2，温度为-2.15～-2.05℃时降温处理，速率为0.05℃/5min，温度降至-15℃，并观察冰晶生长过程。 

实验例：一种使用普通光学显微镜观察油菜根抗冻蛋白冰晶形态变化的方法 

1.抗冻蛋白的提取 

（1）配置质外体蛋白提取缓冲液(1L用量）； 

配置蛋白样品缓冲液组分（不含SDS）； 

（2）田间取样；抗冻蛋白的产生受低温诱导调控，因此，田间取样时应在降温前和降温后进行两次取样，降温前所取样品作为对照。抗冻蛋白在植物的根和叶片中都存在，此处我们白菜型冬油菜品种陇油6号为材料，挖取其根部，去净表面泥土，装入自封袋并迅速带回实验室，用清水冲洗干净备用。 

（3）材料处理；将洗净的油菜根用吸水纸擦净，用剪刀将材料剪成5mm³左右大小，称取100g材料放入装用之前配置好的提取缓冲液的烧杯内浸洗10min，然后用提取缓冲液反复冲洗3次，充分洗去在剪切材料时从伤口流出的蛋白液。将材料装入锥形瓶，加入足够的提取液，抽真空8-10min，期间振荡3-4次，直至材料完全下沉。最后取出材料并充分吸去表面水分备用。 

将材料装入底部垫有四层纱布的30ml针筒内，然后将针筒放入50ml离心管中，调整平衡后放入离心机，此时针筒的底部出口应该朝向离心机外侧，便于离心，在7000rpm，4℃条件下离心20min。向得到的粗液中加入10倍体积的-20℃丙酮，充分振荡后置于-20℃环境中静置过夜。 

（4）抗冻蛋白提取：10000rpm，4℃条件离心20min，倾去丙酮，得到沉淀在-20℃条件下充分静置直至丙酮完全挥发，按照样品质量和样品缓冲液体积比为50g:1ml两个比例，加入2ml样品缓冲液并充分振荡溶解，在10000rpm，4℃条件下离心10min，得到上清液即为质外体蛋白液。得到的对照组合处理组两份蛋白液可进行聚丙烯酰胺凝胶电泳来初步观测是否存在抗冻蛋白。 

2.制备显微镜的控温载玻片，将两片载玻片1之间设有冷却软管2，冷却软管3的两端分别与低温冷却循环仪4的出口4-1和进口4-2相连接，两片载玻片由两个夹子固定也可以使用螺栓固定调整。低温冷却循环仪为凡帝朗品牌DHX-2020型，温度范围-20-100℃，精度±0.05℃。 

3．使用普通光学显微镜观察油菜根抗冻蛋白冰晶形态变化 

吸取10μL浓度为10mg/ml抗冻蛋白液于步骤2的载玻片上，调节显微镜使其达到最佳观测状态，同时控制低温冷却循环仪使载玻片上的样品迅速冷却并结冰，待样品充分固化后，以0.05℃/5min的速率熔融冰晶，观察冰晶熔融过程，当冰晶融化体积达到1/3-1/2时，缓慢降温并观察冰晶生长过程。 

另外，取10μL以稀释得到的抗冻蛋白液（浓度为5mg/ml）滴加到载玻片上，观察 较低浓度抗冻蛋白液中冰晶的生长状况，用同样的方法观察得到在高浓度抗冻蛋白存在条件下的冰晶生长过程，并对三种情况下冰晶生长状况进行比较，结果如下； 

见图3和图4，抗冻蛋白液中冰晶体积明显小于普通蛋白液中冰晶体积，而且比较均匀，小冰晶数目增多。图6展示了抗冻蛋白对冰晶重结晶抑制作用效果，抗冻蛋白使得冰晶体颗粒大小重新分布，一些冰晶增大，而另一些减小，并且大的冰晶愈长愈大，小的越来越小，直至消失。如图7中A所示,在ddH2O中，冰晶以平行于晶格基面(a轴)的方式叠加生长，而在垂直于基面的方向(C轴)很少生长,故通过光学显微镜观察到冰晶格看起来呈扁圆状或圆状，如图7中B所示；在较低浓度抗冻蛋白液中，抗冻蛋白与冰晶有微弱结合，这样就抑制了冰晶沿基面a轴生长，而冰晶基面未受干扰，冰晶沿c轴生长使得其形状近乎六棱形，通过光学显微镜观察到冰晶成六边形，如图7中C所示；在高浓度抗冻蛋白液中，冰晶生长在沿a轴和c轴方向的生长都受到抑制，此时冰晶呈棱形或针形，如图7中C所示。 

抗冻蛋白能吸附到冰晶的非基面，影晌冰晶生长，冰晶生长的方式和速度与抗冻蛋白浓度有关。 

本发明与相差显微观察的比较： 

图7和图8分别是使用普通光学显微镜和相差显微镜抗冻蛋白液冰晶形态观察结果，两种显微镜下均能观察到冰晶形态变化，在相差显微镜下图像更加清晰和立体，而在普通光学显微镜下清晰度同样较高，只是立体感稍差，其观察效果能够满足实验所需，故此，本发明用普通光学显微镜代替相差显微镜进行抗冻蛋白液中冰晶形态观察完全可行。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (3)

1.一种显微镜的控温载玻片，其特征是将两片载玻片之间设有冷却软管，冷却软管的两端分别与低温冷却循环仪的出口和入口相连接。

2.一种显微镜的控温载玻片，其特征是将两片载玻片之间设有冷却软管，冷却软管出口与蠕动泵的进口端连接，蠕动泵的出口端连接保温盒的入口端，保温盒的出口端与冷却软管入口相连接；在载玻片上设有快速检测探针温度计；在保温盒中有-20℃～-18℃的无水乙醇，保温盒的入口管和出口管分别插入-20℃～-18℃的无水乙醇。

3.一种使用普通光学显微镜观察抗冻蛋白冰晶形态变化的方法，其特征是包括有以下步骤：

（1）.抗冻蛋白的提取；

（2）.制备如权利要求1或2所述的显微镜的控温载玻片;

（3）.吸取10μL浓度为10mg/ml的抗冻蛋白溶液滴于所述的控温载玻片上，调节显微镜，同时控制低温冷却循环仪使载玻片上的样品迅速冷却，速率为0.5℃／min,冷却到-15℃以下，逐渐结冰，待样品充分固化后，以0.05℃/5min的速率熔融冰晶，当冰晶融化体积达到1/3-1/2，温度为-2.15～-2.05℃时降温处理，速率为0.05℃/5min，温度降至-15℃，并观察冰晶生长过程。

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